免疫胶体金技术影响因素分析_张付贤
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1.2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
《免疫胶体金技术》课件
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实验仪器：离心机、电泳仪、显微 镜、移液器等
实验注意事项：避免污染、控制温 度、保持湿度等
实验步骤
准备实验材料： 制备胶体金溶 制备抗体溶液： 制备抗原溶液：
包括胶体金、 液：将胶体金 将抗体与缓冲 将抗原与缓冲
抗体、抗原、 与缓冲液混合， 液混合，搅拌 液混合，搅拌
缓冲液等
搅拌均匀
提高稳定性：通过优化实验条件、选择稳定的检测试剂等方法，提高检测结果的稳定性
提高自动化程度：通过开发自动化检测设备，提高检测效率和准确性
免疫胶体金技术的实验操作
实验准备
实验材料：胶体金、抗体、抗原、 缓冲液、洗涤液、显色剂等
实验步骤：样本处理、抗体孵育、 胶体金标记、洗涤、显色等
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云计算和大数据技术：实现 检测数据的实时分析和共享
检测灵敏度提升
技术进步：通过改进胶体金颗粒的制备工艺，提高检测灵敏度
应用领域：在生物医学、食品安全、环境监测等领域具有广泛应用前景
技术融合：与其他检测技术相结合，提高检测灵敏度和准确性
发展趋势：随着科技的发展，免疫胶体金技术的检测灵敏度将不断提高，应用范围也将不 断扩大。
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免疫胶体金技术
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单击输入目录标题 免疫胶体金技术概述 免疫胶体金技术的分类 免疫胶体金技术的优缺点 免疫胶体金技术的实验操作 免疫胶体金技术的应用实例
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免疫胶体金技术概述
定义和原理
免疫胶体金技术是一种基于免疫反应的检测技术 原理：利用抗原-抗体特异性结合，通过胶体金标记抗体，实现对目标抗原 的检测 特点：灵敏度高、特异性强、操作简便、快速
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药引言近年来，随着水产品加工业的迅猛发展，水产品中喹诺酮类药物残留的问题日益凸显，给人民群众的健康带来了严重的危害。
开发一种高灵敏度、高特异性、快速检测水产品中喹诺酮类药物的方法迫在眉睫。
免疫胶体金法是一种新型的生物技术手段，具有快速、简便、低成本等优点，被广泛用于食品、水产品等领域的药物残留检测。
本文介绍了免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物残留检测方面的应用和发展。
一、喹诺酮类药物的概述喹诺酮类药物是一类广谱抗生素，主要用于预防和治疗动物细胞内寄生虫、细菌等疾病。
目前已有多种喹诺酮类药物被广泛应用于水产品养殖过程中，以控制和预防水产品中的细菌和寄生虫感染。
而由于水产品中残留的药物对人体健康造成一定程度的危害，开发一种快速、灵敏的方法用于检测水产品中喹诺酮类药物是非常必要的。
二、免疫胶体金法的概述免疫胶体金法是一种利用金纳米颗粒和抗体等生物标记物相结合的技术，通过颜色变化的方式来检测A检测物在样品中的存在和浓度的一种方法。
它具有快速、简便、低成本等优点，被广泛用于食品、水产品等领域的药物残留检测。
三、免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物残留检测中的应用免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物残留检测方面具有一定的优势和应用前景。
该方法具有高灵敏度，可以检测到极低浓度的喹诺酮类药物残留；该方法具有高特异性，可以准确鉴别水产品中的喹诺酮类药物；该方法操作简便，不需要复杂的仪器和技术支持，可以在实验室和现场快速进行检测；该方法成本低廉，适合大规模生产和应用。
结论免疫胶体金法是一种快速、简便、低成本的药物残留检测方法，在水产品中喹诺酮类药物残留检测中具有广阔的应用前景。
相信随着技术的不断创新和发展，免疫胶体金法将为保障水产品质量和人民群众的健康提供更可靠的技术支持。
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程就是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响与制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1、1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物与表面活性剂的来源、类型与数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径与分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但就是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小与分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1、2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物与待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1、3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫与吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫与吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸与样品垫。
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析免疫胶体金技术是一种常用的生物检测方法，主要通过胶体金纳米颗粒与抗原或抗体的特异性结合反应来实现对目标物质的检测和定量分析。
然而，在实际应用过程中，免疫胶体金技术的结果往往受到多种影响因素的影响。
下面将对免疫胶体金技术常见的影响因素进行分析。
首先，溶液的pH值是影响免疫胶体金技术的重要因素之一、在免疫胶体金技术中，溶液的pH值对胶体金纳米颗粒的稳定性和表面电荷有一定的影响。
一般来说，胶体金纳米颗粒在弱酸性条件下比较稳定，而在碱性条件下容易发生凝聚。
因此，在实验过程中，选择合适的缓冲液来调节溶液的pH值是非常重要的。
其次，离子强度也是影响免疫胶体金技术的重要因素之一、离子强度的增加会导致胶体金纳米颗粒表面的电荷屏蔽，从而使胶体金纳米颗粒发生凝聚。
为了解决这个问题，可以通过加入适当的离子强度调节剂来降低离子强度，从而增加胶体金纳米颗粒的稳定性。
此外，胶体金纳米颗粒的浓度也会对免疫胶体金技术的结果产生影响。
在浓度较高时，胶体金纳米颗粒之间的空间距离较小，容易发生凝聚，从而影响检测结果的准确性。
因此，在实验操作中，需要根据具体情况调整胶体金纳米颗粒的浓度，以确保检测结果的可靠性。
此外，免疫胶体金技术中还涉及到抗体或抗原的结合效率。
免疫反应的结合效率受到多种因素的影响，例如抗体或抗原的浓度、结合时间、温度等。
因此，在进行免疫反应时，需要对这些因素进行优化，以提高结合效率和准确性。
最后，非特异性吸附也是影响免疫胶体金技术的重要因素之一、在实际应用中，样品中存在的其他非目标物质往往会与胶体金纳米颗粒发生非特异性吸附，形成背景信号。
因此，在进行实验前，需要对样品进行预处理，如去除杂质、选择合适的探针等，以减少非特异性吸附的影响。
综上所述，免疫胶体金技术的结果可能受到溶液的pH值、离子强度、胶体金纳米颗粒浓度、抗体或抗原的结合效率以及非特异性吸附等影响因素的影响。
在实际应用中，需要认真分析和处理这些影响因素，以提高免疫胶体金技术的准确性和可靠性。
免疫胶体金技术常见影响因素分析
免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。
硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。
1.2结合垫的选择。
结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3样品垫及吸水纸的选择。
样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
免疫胶体金法的影响因素
免疫胶体金法的影响因素
免疫胶体金法（Immunochromatographic Assay）是一种常用于
快速、简便、阳性结果可直观观察的免疫分析方法。
其影响因素包括：
1. 样品稀释系数：适当的样品稀释系数能够避免高浓度样品的背景干扰，同时保证所检测物质的有效浓度。
2. 抗原抗体反应性：抗原和抗体的选择和质量对免疫胶体金法的灵敏度和特异性有重要影响。
3. 膜滤纸的选择：膜滤纸是免疫胶体金法的重要组成部分，其表面性质和孔径大小决定了反应物质的传输速率和分离效果。
4. 胶体金颗粒的性质：胶体金颗粒的大小、浓度和稳定性直接影响了免疫胶体金法的灵敏度和稳定性。
5. 反应时间：反应时间的选择直接影响了胶体金颗粒在膜滤纸上的迁移速率和反应的充分性。
6. pH和离子强度：适当的pH和离子强度有助于提高免疫胶
体金法的灵敏度和特异性。
7. 操作技巧：正确操作和使用标准操作程序能够减少人为误差，提高免疫胶体金法的准确性和可重复性。
免疫胶体金技术及其在兽医临床上的应用
免疫胶体金技术及其在兽医临床上的应用免疫胶体金技术在人类医学上是一种常用的免疫标记技术，有其独特的优点。
近几年来在生物医学各领域中得到了日益广泛的应用。
目前该技术在医学检验中的应用主要是胶体金快速免疫层析法(colloidal gold enhanced immunochronmtography assay，CGEIA)和快速斑点免疫金渗滤法(dot-immunogold filtration assay，DIGFA)，用于检测人类乙肝表面抗原、人绒毛膜促性腺激素、艾滋病病毒等。
近几年随着该技术的不断发展，已在兽医临床上得到了广泛应用，具有简便、快速、灵敏、特异性高和无污染等优点。
1胶体金的制备及基本原理1.1胶体金的发现1857年，法拉第用还原法从氯金酸水溶液中制备胶体金，并发现在其中加入少量电解质后，可使胶体金由红色变为蓝色，最终凝集成无色，而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化，他的重大发现奠定了胶体金制备和应用的科学基础。
直至1971年Faulk W P等[1]将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学领域得到了日益广泛的应用[2-3]。
1.2胶体金的制备胶体金是通过在氯金酸水溶液中加入还原剂使之还原并聚集形成胶体金粒子而形成的。
使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小，即粒子的大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。
还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯金酸水溶液的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，体积也越小。
粒子直径每增加1倍，数量减为原来的1/8。
目前，制备胶体金的方法有许多种，根据时间的先后，依次为抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、乙醛超声波还原法、放射性胶体金法、硼氢化钠还原法、鞣酸-柠檬酸三钠还原法、白磷还原法及白磷还原法的改良法和微波制备胶体金法。
根据不同的制备方法，可以制备出直径1 nm～500 nm的胶体金粒子，但作为免疫标记探针，其直径一般在3 nm～50 nm的范围内。
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药喹诺酮类药物是一类广泛应用于养殖业和水产业的抗生素，在预防和治疗水生动物疾病方面发挥着重要作用。
过量使用喹诺酮类药物可能会对水产品及其消费者造成潜在的健康风险。
对水产品中喹诺酮类药物进行快速、准确的检测至关重要。
免疫胶体金法（immunochromatographic assay）是一种基于免疫学原理的快速检测技术，已被广泛应用于食品、水产品及环境样品中有害物质的检测。
本文将介绍免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物检测方面的应用，以及该技术的优势和局限性。
免疫胶体金法的工作原理是将标记有金纳米颗粒的抗体与待检测样品中的抗原发生特异性结合，形成复合物后，通过毛细管作用在试纸上进行向上运移，最终在检测线上形成显色信号。
该技术具有操作简单、快速、无需显微镜和特殊设备等优点，可以在野外或临床现场进行快速检测。
免疫胶体金法被广泛应用于食品安全和环境监测领域。
在水产品中喹诺酮类药物的检测中，免疫胶体金法具有独特的优势。
该方法不需要复杂的前处理步骤，能够在短时间内对大量样品进行快速检测，非常适合在养殖场或水产品加工厂等现场使用。
免疫胶体金法对喹诺酮类药物具有高度的特异性和灵敏度，可以准确地检测出样品中喹诺酮类药物的存在并进行定量分析。
由于金纳米颗粒具有良好的生物相容性和生物标记性，因此免疫胶体金法不会对样品造成污染，可以保证检测结果的准确性和可靠性。
免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物检测中也存在一些局限性。
该方法的灵敏度受到许多因素的影响，如样品的复杂性、颜色等，可能会对检测结果产生一定程度的影响。
在使用该方法进行检测时，需要对样品进行严格的前处理和样品稀释等操作，以提高检测的灵敏度和准确性。
免疫胶体金法只能进行定性分析，无法对待检测样品中喹诺酮类药物的含量进行准确的定量分析。
在实际应用中，往往需要结合其他定量方法进行综合分析，以得出准确的检测结果。
免疫胶体金技术的基本原理及其在兽医临床中应用的研究进展
3、多指标并行检测：未来免疫胶体金技术可能发展为多指标并行检测的能 力，同时检测多种病原体或指标，提高检测的广度和深度，满足兽医临床更为复 杂的需求。
4、生物信息学结合：将免疫胶体金技术与生物信息学相结合，可以实现大 数据分析、机器学习等算法在免疫胶体金技术中的应用，从而进一步提高其诊断 准确性和流行病学调查的精细程度。
五、未来展望
免疫胶体金技术在兽医临床中的应用前景广阔，未来其可能的应用场景和发 展方向包括：
1、拓展应用范围：免疫胶体金技术在兽医临床中的应用领域仍有待进一步 拓展。例如，可以探索其在兽药残留检测、动物食品质量安全监控等方面的应用， 提高动物产品的质量安全水平。
2、集成化与自动化：随着科技的进步，免疫胶体金技术的操作流程可能实 现更高程度的集成化和自动化，提高检测效率和准确性。例如，通过引入微流控 技术，实现样本的前处理、反应液的快速混合、洗涤等步骤的自动化操作。
二、免疫胶体金技术在兽医临床 中的应用意义
免疫胶体金技术在兽医临床中具有广泛的应用价值，其主要体现在以下几个 方面：
1、疾病诊断：免疫胶体金技术可用于动物体内多种病原体的快速诊断。例 如，可用免疫胶体金技术检测动物血清中的病毒抗原或抗体，辅助诊断禽流感、 猪瘟等重大动物疫病。此外，免疫胶体金技术也可用于动物体内其他细菌感染、 寄生虫感染等疾病的诊断。
一、免疫胶体金技术的基本原理
免疫胶体金技术是一种将抗体或抗原固定在胶体金颗粒表面的标记技术。胶 体金颗粒在溶液中由于静电作用而形成稳定的胶体溶液，当加入特异性抗体或抗 原时，抗体或抗原的特异性识别作用与金颗粒表面结合，形成特定的免疫胶体金 复合物。当加入样品溶液后，免疫胶体金复合物可与样品中的目标抗原或抗体结 合，形成肉眼可见的红色或紫色斑点或线条，从而实现定性或定量分析。
免疫胶体金技术
免疫胶体金技术(一) 原理免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。
胶体金是由氯金酸(HAuCl)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并4由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。
根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
(二) 胶体金的制备根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。
常用来制备胶体金颗粒的方法如下。
1(枸橼酸三钠还原法(1)10nm胶体金粒的制备:取0.01,HAuCl水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮4沸30min，冷却至4?，溶液呈红色。
(2)15nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl水溶液100ml，加入1,枸橼酸三钠水溶液2ml，加热4煮沸15min,30min，直至颜色变红。
冷却后加入0.1Mol/L KCO0.5ml，混匀即可。
23(3)15nm、18nm,20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备:取0.01,HAuCl水溶液100ml，加热煮4沸。
根据需要迅速加入1,枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。
这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18,20nm、30nm和50nm。
2(鞣酸—枸橼酸钠还原法A液:1,HAuCl水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。
4B液:1,枸橼酸三钠4ml，1,鞣酸0.7ml，0.1Mol/L KCO液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。
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基于免疫胶体金标记技术的检测研究及其在堆肥中的应用展望 【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的论说性文章。
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基于免疫胶体金标记技术的检测研究及其在堆肥中的应用展望【摘要】金纳米颗粒作为一种性能优异的标记物应用广泛。
随后发展出来的免疫胶体金标记技术作为一种灵敏度高、操作步骤简便、检测快速的免疫反应检测技术得到广泛关注。
本文介绍了免疫胶体金标记技术的基本原理、制备方法并详述了近年来该技术的新发展。
此外，结合免疫胶体金标记技术在免疫检测与环境检测实际工作中的应用，展望了其在堆肥环境检测中的应用潜力和发展前景。
【关键词】胶体金; 标记; 免疫检测; 堆肥; 评述 Abstract Gold nanoparticle has been widely used as a good labeling substance. Subsequently, increasing concern has been paid to immunogold labeling technique which hashigh sensitivity, simple procedure and rapid detection in immunoassay. The basic principle, preparation methods and important developments of immunogold labeling technique were introduced in this article. In addition, the new applications and prospects of immunogold labeling technique in compost detection were proposed based on the applications in immunoassay and environmental analysis. Keywords Colloidal gold; Labeling; Immunoassay; Composting; Review 1 引言 堆肥被认为是将固体废物减量化、资源化的最佳途径[1]。
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药近年来，因为喹诺酮类药物被广泛地用于水产品养殖和预防，导致水产品中喹诺酮类药物残留严重，为保障水产品食品安全，对其中毒物质的检测变得尤为重要。
目前，水产品中毒物质主要通过高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-高分子质谱联用法（LC-MS）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）等检测技术检测。
然而，这些传统的检测方法存在样品前处理复杂，操作步骤繁琐，分析周期长，且需要高昂的分析设备和高技术人才。
故此，有必要寻求一种操作简便，灵敏度高，快速、准确、经济实惠的检测方法。
免疫胶体金法是一种基于单克隆或多克隆抗体专一性识别原理的检测方法，它具有快速，高灵敏度和特异性等优点，已成为一种广泛应用于食品中毒物的快速检测方法，其在水产品中的应用也越来越受到关注。
我们使用同源领域DNA的理论基础为依据，基于免疫胶体金检测方法，开发了一种快速检测水产品中喹诺酮类药物的方法，具有快速、方便而高效的优点。
该方法制备了具有高度专一性和灵敏性的单克隆抗体，用以制备免疫胶体金试纸。
样品经过简单处理后，与免疫胶体金试纸接触，喹诺酮类药物可与其特异性结合的单克隆抗体产生复合物，生成红色或紫色的亮带，而无任何药物残留的样品则没有该亮带出现。
在此方法优化过程中，我们选择2种典型的喹诺酮类药物环丙沙星和氧氟沙星进行了研究。
实验结果表明，该方法在环丙沙星的检测下限为0.01μg / L，检测范围为0.01-1μg / L，氧氟沙星的检测下限为0.05μg / L，检测范围为0.1-10μg / L，其灵敏度和特异性优于传统的检测方法。
在不同样品矩阵之间的比较中，该方法和HPLC的结果表明，水样品中环丙沙星的检测结果是一致的，但检测费用和用时比HPLC低很多，而且取样和前处理的步骤要少很多，更适合于进行大批量的样品检测。
这项研究的结果表明，免疫胶体金法可以应用于水产品中喹诺酮类药物的快速、准确、简便和低成本检测。
免疫胶体金银技术
（14）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（15）双蒸水振洗5min。
（16）1%戊二醛10min。
（17）双蒸水振洗5min。
（18）0.01% 伊文思蓝2min，甘油封片。
你现在学习的是第17页，课件共33页
结果：光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红 色，阳性颗粒位于细胞核底部，比单纯用PAG染色深度得到加 深，阳性结果得到放大。
原理：抗A蛋白抗体Fab段、Fc段均可与PAG上的A蛋白结合， 因此，聚集更多的胶体金颗粒。
PAG放大法的优点： ① 使用试剂单一； ② 敏感性高； ③ 背景干净。
常用的方法:2种
(1)柠檬酸三钠还原法
制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。 制备胶体金时金颗粒的大小与柠檬酸三钠用量成反比。 操作步骤： 1）1ml l％氯化金加入100ml蒸馏水中，煮沸。 2）迅速加入4mll％柠檬酸钠，保持沸腾状态，搅动至出现透明的橙红色。
3）自来水冲洗烧瓶，冷却。
2）小于10nm颗粒的胶体金用超速离心机离心，在4℃离心1h左右，弃上 清，将沉淀以TBS溶解，重复离心2～3次，沉淀溶于TBS中。4℃保存备 用。
为了得到颗粒均匀一致的免疫金试剂，上述粗提制剂可用10-30%蔗糖或甘油 溶液作密度梯度离心，分带收集。
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2) 凝胶过滤法
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1 硝酸银显影液的配制
(1) 10％明胶液 + 枸橼酸缓冲液 + 对苯二酚+蒸馏水， 混合，磁力搅拌均匀(注意避光) ，用前加入硝酸银水溶液
免疫胶体金技术..
胶体金标记技术的相关定义
免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗 体的一种新型的免疫标记技术。 胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。
To the boiling solution, add 1.5 mL of a 1% solution of trisodium citrate dihydrate, Na3C6H5O7.2H2O
Stop heating when a deep red color is obtained.
Synthesis and properties of different particle size
免疫胶体金技术的特点
优点： 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； 试剂稳定，适用于单份测定； 无污染。 GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。
成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，POCT）中广为应用的方法。
Adjust the gold colloid to the proper pH
常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值
Determined the minimum amount of protein
（1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520～580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45μg/ml。
免疫胶体金技术影响因素分析
免疫胶体金技术影响因素分析张付贤1,2,王兴龙2(1.吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春 130062;2.军事医学科学院军事兽医研究所,长春 130062)摘要:免疫胶体金技术以其快速、准确、简捷的特点,受到国内外科研工作者及基层工作人员的普遍关注。
笔者从耗材的选择、胶体金的制备及标记、膜包被条件、缓冲液和产品保存及验证等方面分析免疫胶体金技术的影响因素,为制备胶体金检测产品提供理论依据和技术参考。
关键词:免疫胶体金技术;影响因素;选择;检测中图分类号:Q233 文献标识码:A 文章编号:167127236(2009)0520199204 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1 耗材的选择1.1 不同型号膜的筛选 硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高(李云等,2002)。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标收稿日期:2008211228作者简介:张付贤(1982-),男,河南人,硕士,研究方向:兽医微生物与免疫学。
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药免疫胶体金法（Immuno Colloidal Gold Assay）是一种基于免疫学原理的快速检测方法，其通过标记在胶体金颗粒表面的特异性抗体与待测样品中的目标物质结合，从而实现对目标物质的定性或定量检测。
本文旨在介绍免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物快速检测方面的研究进展。
一、免疫胶体金法的原理免疫胶体金法是一种基于免疫学原理的快速检测方法。
其基本原理是利用喹诺酮类药物分子与特异性抗体之间的特异性结合作用，实现对喹诺酮类药物的快速检测。
免疫胶体金法的具体操作步骤如下：1.制备胶体金溶液：将金盐还原成金颗粒，得到胶体金溶液。
2.标记抗体：将特异性抗体与胶体金颗粒进行结合，得到标记抗体-胶体金复合物。
3.取样：将待测样品加入试管中。
4.加入标记抗体-胶体金复合物：将标记抗体-胶体金复合物加入样品中。
5.孵育：在适当条件下孵育一段时间，使待测物质与标记抗体发生特异性结合。
6.观察结果：通过肉眼或仪器对反应结果进行观察和判断。
二、免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物检测的应用免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物检测方面具有以下优势：1.快速检测：免疫胶体金法检测速度快，通常在10-30分钟之间即可得到结果。
2.高灵敏度：免疫胶体金法可以达到ppb（亿分之一）或ppm（百万分之一）级别的药物残留检测，具有高灵敏度。
3.特异性强：免疫胶体金法可以通过选择特异性抗体实现对目标物质的特异性识别和检测。
4.操作简单：免疫胶体金法操作简单，不需要复杂的实验仪器和专业的操作技术，适用于实验室和现场快速检测。
三、免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物检测的研究进展近年来，免疫胶体金法在水产品中喹诺酮类药物检测方面得到了广泛应用和研究，并取得了一些重要进展和成果。
1.方法优化：研究人员通过优化反应条件、选择合适的抗体和胶体金颗粒大小，提高了免疫胶体金法的检测灵敏度和特异性。
2.样品制备：在水产品中，样品的制备对免疫胶体金法的检测结果影响较大。
免疫胶体金技术在疾病诊断中的应用研究
免疫胶体金技术在疾病诊断中的应用研究免疫胶体金技术是一种新型的生物分子检测技术，近年来被广泛应用于疾病诊断领域。
该技术具有检测快速、灵敏度高、特异性好等特点，被誉为细胞免疫学、生物技术和纳米技术的三位一体。
胶体金颗粒作为免疫反应检测试剂，具有颜色鲜艳、稳定性好、形状规则等特点，是一种理想的生物分子标志物载体。
结合先进的加强技术，免疫胶体金技术已经广泛应用于蛋白和核酸的检查。
1.疾病的诊断和治疗疾病的快速与准确的诊断与预测是患者的关键问题，而免疫胶体金技术在患者体内检测许多关键蛋白质和类细胞因子（cytokine TNF-a、IL-1、2、6、8、10等）可以有效地帮助医生制定治疗计划和预后预测。
不仅如此，该技术也能应用于癌症早期检测，有利于降低癌症的恶性病变风险，提高癌症治疗的治愈率和生存率。
2.病理研究免疫胶体金技术可以用于病理解析期间肿瘤标记物的检测，例如CEA乳腺癌、AFP肝癌、CA125卵巢癌、PSA前列腺癌等常用肿瘤标志物、或其他微量分子的检测。
该技术可以在病理诊断中起到关键作用，有助于指导病理诊断、决策和疾病管理。
3.生物安全监测传染病和食品安全问题一直是近年来经常出现的问题，免疫胶体金技术可用于传染病的检测和食品安全的监测。
通过检测感染相关的抗体和抗原，从而实现对感染病原体、安全生产及食品相关安全问题的治理，维护公共健康和安全。
4.环境检测免疫胶体金技术还可以用于环境污染的检测，例如检测水体、空气、土壤等资源。
这种技术的特点是灵敏度和特异性高，可以快速获取有毒化学物质和微生物等颗粒物的信息，有效净化环境。
5.纳米技术免疫胶体金技术与纳米技术的结合，可以通过纳米金颗粒的特殊性质，进一步增强检测灵敏度，缩短检测时间。
此外，还可以通过纳米颗粒表面修饰等方法获得纳米分子，进一步扩展其应用范围和增强其功能。
总之，免疫胶体金技术在疾病诊断和环境监测领域一直发挥着重要的作用。
未来，随着科技的越来越发展，免疫胶体金技术还将得到更广泛的应用，成为医疗产业、环境保护和工业生产的重要工具。
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药
免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药【摘要】本研究使用免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药，通过引言介绍了背景和研究目的。
正文部分分别介绍了免疫胶体金法原理、喹诺酮类药的危害、该方法在水产品检测中的应用、实验方法和实验结果。
结论部分指出了免疫胶体金法在检测水产品中喹诺酮类药的可行性，并探讨了研究意义和未来研究方向。
通过本研究，可以有效快速地检测水产品中的喹诺酮类药物，保障消费者健康，具有重要的应用和实践意义。
未来的研究可以进一步探索该方法在其他食品中的应用，并不断完善检测技术，为食品安全提供更可靠的保障。
【关键词】免疫胶体金法、喹诺酮类药、水产品、快速检测、可行性、研究意义、未来研究方向。
1. 引言1.1 背景介绍随着水产品消费量的增加，水产品质量安全问题受到了越来越多的关注。
喹诺酮类药物是一类广泛应用于水产品养殖中的抗生素，其残留在水产品中可能对人体健康造成潜在危害。
目前，传统的检测方法对水产品中喹诺酮类药物的检测需要耗费大量的时间和人力，且检测过程繁琐复杂，难以满足日益增加的水产品质量安全监测需求。
1.2 研究目的喹诺酮类药物是一类广泛应用于水产品中的抗生素，其过量使用会对人体健康产生危害。
本研究旨在使用免疫胶体金法快速检测水产品中喹诺酮类药物的含量，以确保水产品的安全性和质量。
通过本研究，可以建立一种简便、快速、准确的检测方法，为相关监管部门提供科学依据，保障消费者的健康。
研究还旨在探索免疫胶体金法在水产品中药物残留检测领域的应用前景，促进该技术在食品安全监测中的推广和应用。
通过本研究，可以为制定更加科学合理的食品安全管理政策提供参考依据，为保障公众健康做出贡献。
2. 正文2.1 免疫胶体金法原理免疫胶体金法是一种基于抗原与抗体相互作用原理的生物分析技术，利用金纳米颗粒和特定抗原结合，形成颗粒-抗原-抗体复合物，通过颜色变化或光学信号来检测目标物质的存在。
其原理是利用金纳米颗粒表面具有良好的生物相容性和生物亲和性，可以与抗原或抗体发生特异性结合，形成稳定的复合物。
免疫胶体金技术(2)
【基本原理】
1. 直接法---将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色, 然后在光镜或电镜下观察
方法简单, 但一种探针仅限于检测一种抗原, 较局限
2. 间接法---先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原 结合, 然后加金标二抗或SPA与一抗结合, 在光镜或电 镜下对抗原的分布进行定位研究
1. 光镜免疫金银法 在免疫金染色的基础上增加物理显影的步骤
显影液的配制及显影过程应在暗处进行
阳性部位呈黑色颗粒状
2. 电镜免疫金银法
包埋前染色, 包埋后染色
【IGSS法优点】
1. 可被用于光镜和电镜观察 2. 敏感性高
3. 定位准确
4. 背景清晰, 对比度好
5. 方法简便, 安全
6. 成本较低, 标本可长期保存
免疫胶体金技术
Immunogold Technique
一. 概述
(一) 发展历史
1971年 Faulk和Taylon 用兔抗沙门氏菌抗血清与胶 体金颗粒结合, 制备成金标抗体, 检测细菌表面抗原的 分布 1975年 Horisberger等 把胶体金技术推广应用于扫 描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究 1978年 Geoghegan 水平的应用 1981年 Danscher 发表了胶体金标记物在光镜 建立了银显影液增强，光镜
（四）制备胶体金的注意事项
1. 玻璃器皿的清洁
玻璃器皿清洗→清洁液浸泡24h →流水冲→蒸馏 水反复洗涤→晾干
2. 试剂配制
应尽量使用分析纯试剂 各种水溶液必须用三蒸水或去离子水配制
3. 影响胶体金颗粒大小的因素
加入还原剂的速度 搅拌是否均匀
制备胶体金所用的烧瓶大小
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免疫胶体金技术影响因素分析张付贤1,2,王兴龙2(1.吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春 130062;2.军事医学科学院军事兽医研究所,长春 130062)摘要:免疫胶体金技术以其快速、准确、简捷的特点,受到国内外科研工作者及基层工作人员的普遍关注。
笔者从耗材的选择、胶体金的制备及标记、膜包被条件、缓冲液和产品保存及验证等方面分析免疫胶体金技术的影响因素,为制备胶体金检测产品提供理论依据和技术参考。
关键词:免疫胶体金技术;影响因素;选择;检测中图分类号:Q-33 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009)05-0199-04 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。
免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。
而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。
1 耗材的选择1.1 不同型号膜的筛选 硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。
不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。
膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高(李云等,2002)。
用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标收稿日期:2008-11-28作者简介:张付贤(1982-),男,河南人,硕士,研究方向:兽医微生物与免疫学。
通信作者:王兴龙(1959-),男,吉林人,博导,从事分子免疫学研究。
E-mail:w ang xl-2006@基金项目:吉林省科技厅计划项目(20050549)。
记物在膜上的流动速率为最佳(邓省亮等,2007)。
1.2 结合垫的选择 结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附(张美玲,2006);玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。
1.3 样品垫及吸水纸的选择 样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。
试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。
如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。
吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。
2 关于胶体金的制备制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果(Bassab等,2001)。
胶体金的制备除了保证药品的质量外,制备过程中的细节关乎胶体金制备的成败。
首先是操作环境和所用容器的清洁度(翟雷等,1996)。
所有进入溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成的胶体金出现聚堆现象,容器最好经酸洗和硅化处理。
操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作区。
其次,配制溶液均需使用双蒸水或三蒸去离子水配制,烧制胶体金最好用去离子水。
再者是不同的还原剂对胶体金质量的影响。
胶体金制备基于还原法,改变还原剂的性质和浓度,可制备粒径不同的胶体金悬液。
根据试验目的选择胶体金的粒径,根据选择的粒径确定还原剂,如制备金颗粒直径在5～12nm的胶体金溶液用白磷或抗坏血酸还原氯金酸;如制备大于12nm直径的金颗粒的胶体金则用柠檬酸三钠还原氯金酸。
此外不同的烧制方法、胶体金的制备量、还原剂的加入方式、加热容器的大小及加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小和均一性(唐景峰,2006)。
根据所需胶体金的粒径和数量,结合自身试验条件选择合适的胶体金制备方法。
3 标记蛋白与相关抗原、抗体的制备标记蛋白、T线和C线的抗原或者抗体的纯度和浓度直接影响金标探针的质量。
获得纯度高、浓度适中的抗原、抗体,关键在于制备和纯化方法的选择及条件的优化。
试验前须采用高速离心去杂质,应用饱和硫酸铵沉淀、亲和层析、透析除盐等一系列处理方法,尽可能去除单克隆抗体、二抗和相关蛋白溶液中的高浓度的杂质和多余离子,避免其干扰目的蛋白与胶体金的吸附结合,或导致胶体金粒子的凝聚(李希友,2006);特别是硼酸盐和磷酸盐不利于胶体金和蛋白的结合,应尽量避免接触。
同时,充分处理各种大分子蛋白,使其尽量分散为单体和具有适当的分子质量,提高胶体金与蛋白质的结合比,便于与胶体金充分而稳定的结合。
4 胶体金的标记胶体金标记的两个关键环节是标记时的pH和最佳蛋白质标记量的确定(吴海波,2006)。
根据胶体金标记的原理,只有在pH接近和稍高于蛋白质的等电点时,胶体金蛋白质的吸附力最强;pH过高过低都不利于两者的结合,因此标记时选择精密的酸碱度测定仪器或者试纸条,采用不同方法重复校正,并进行梯度试验找到最佳的标记pH。
溶胶与被标蛋白质的用量比例是否合适是影响标记成功的一个重要因素。
过多蛋白质标记,造成浪费的同时引起试纸的拖带现象;过少蛋白质标记,导致胶体金标记不完全,从而降低试纸的灵敏度及假阳性现象的出现。
也需要在试验中进行梯度试验,反复比较不同标记量的标记物在破坏试验中的稳定性,确定最佳的标记量(邓省亮等,2007)。
5 膜包被条件的优化处理膜的包被条件,包括膜的封闭、环境的湿度、T 线和C线上抗原或抗体的浓度、点膜条件、温度、包被时间等,需要结合试验实际情况进行反复调整。
包被过程中需要特别注意以下两点:①膜上T线和C线抗原或抗体的包被量要相对饱和;②包被后的膜一定要在适宜的温度下彻底干燥,否则会造成拖带、显色不清晰,灵敏度也大受影响(张辉,2008)。
5.1 封闭 对使用的膜进行处理,特别是进行封闭是一个十分有争议的问题,理论上来说购买回的膜基本上都是已经优化处理好的,直接点膜就可使用。
如果点膜前将膜浸泡在封闭液内进行封闭处理,必然扰乱了膜内正常的物质分布,由此引发了许多不必要的麻烦。
但是如果在实际的试验操作过程中,发现没有进行封闭的膜出现非特异性条带或者出现拖带现象,或遇到膜不封闭就无法将蛋白质或抗体包被在膜上的问题,就应考虑封闭问题。
建议在制作试纸条过程中根据各自标记物的性质及其在膜上的显色情况来选择封闭与否,如果标记效果比较好且在膜上显色清晰而无拖带及假阳性现象出现,则完全没有必要进行膜的封闭。
反之,可进行膜的封闭,查找不理想现象出现的原因。
用来对膜进行封闭的物质很多,多选用大分子蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEGM W20000)等(戴荣四, 2004)。
常用的封闭方法有流动封闭和膜上定点封闭,前者将封闭物处理在样品垫上,后者将作用物质配成溶液喷涂在膜的特定位置上。
5.2 环境湿度 环境湿度对点膜过程非常重要。
最佳湿度一般在45%～65%。
湿度过低,膜上容易聚集静电荷,点膜容易出现散点,导致测试时出现疏水斑;湿度过高,膜上毛细作用加强,点膜容易引起T线、C线变宽甚至扩散。
为了保证点样时膜湿度的均一性,一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。
5.3 T线和C线上抗原或抗体的浓度 T线和C 线上抗原或抗体的包被浓度直接影响其与金标记物的结合比例,最终影响试纸条条带的显色效果。
包被浓度过低,膜上的条带显色不清晰或出现条带中空现象;包被浓度过高,会导致C线不显色或者出现拖带现象。
若要获得反应稳定、显色清晰的试纸条,须对2条线上抗原或抗体的配合浓度及两者与金标记物的结合比进行调整和比对,以期得到最佳的组合。
5.4 点样位置 不同的T线、C线点样位置将带来不同的灵敏度,点样位置上移,金标复合物通过T 线位置时速度变慢,反应时间增加,灵敏度升高;反之灵敏度降低。
可采用这个方法来改变灵敏度和消除假阳性。
5.5 点样仪器 目前有2种点样方式,划膜式和非接触点膜式。
非接触点膜式优于划膜式,划膜式需用软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质较为软脆,划管会在其表面留下印痕。
划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性,同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线,影响结果的判定。
点样仪器不仅可以控制T线、C线点样位置,也可通过点膜仪器各种参数的调整控制T 线与C线宽度及喷膜速度等细节,达到最好显色效果。
需要在试验过程反复调整各项参数做比对试验,观察试纸条的显色情况来决定。
6 缓冲液缓冲液构成胶体金免疫层析技术的液相载体,在不影响胶体金与蛋白质、抗原与抗体、硝酸纤维素膜与T线及C线蛋白结合的前提下,并为它们的结合反应提供最佳的酸碱环境。
缓冲液并不是通用的,不同的反应体系需要不同的缓冲液来支持,这就需要试验者结合自己的试验尝试不同的缓冲液,确定适合自己的缓冲液配方。
常用的缓冲体系是在选用的缓冲液(磷酸盐、硼酸盐等)中添加相应的作用物质配制而成,所谓作用物质是解决反应体系出现的某一特定问题而添加的相应物质。
比如通过在缓冲液中添加适量的表面活性剂(如Tw een-20),可起到增加亲水力、增色和避免线条中空现象;也可同时添加几种物质,通过它们之间的相互协同作用共同解决相关的问题,如少量NaCl,减少信号强度,消除假阳性;糖和聚乙二醇作为保护剂,能减缓老化速度,也可以增加亲水力,但也要注意作用物质的添加宜简不宜繁。
试纸条制备过程中的很多处理液都是在选择的缓冲液的基础上添加相应的作用物质配置而成的(如封闭液、结合垫处理液等)。
7 样品的处理与结果的判定7.1 样品的处理方法和加样量 临床送检标本(如全血、血清、血浆),不同的单位和检测人员采用的处理方法不统一,也会对结果判定造成影响。
如血浆内大量的纤维蛋白原,影响到层析的速度及均一性,直接影响到抗原抗体结合,处理不当甚至出现一种非特异性结合。
检测时样品的添加量要相对充足,使膜上的反应充分进行,以便得到清晰的结果。