免疫胶体金技术要点

135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法.

如何选择 物理性能 膜的物理性能主要是2个参数， 膜厚度和宽度 厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的 C/T线宽窄不一，另外也影响爬速； 宽度(检测区的长度)和爬速及灵敏度的关系 跑水性能 注入足够溶液到槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标 记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放 入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通 过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水 平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反 常现象。 点样测试 C/T线出线时间和灵敏度
1939-----雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子 显微镜下观察金离子呈高电子密度。 1971------作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结 合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。 1974------实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了 间接免疫金染色法
胶体金免疫层析法试剂的组成

样品垫(Sample pad)：
玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质，多种规格，批间稳定。
样品垫的作用：
减缓样品渗透速度，有利于样品在结合垫上均匀分布； 去除样品中杂质颗粒； 调节样品液pH值或粘度等。
样品垫可使用化学物质进行浸渍处理，从而减少样本差 异，提高试验的灵敏度。通常可以将洗涤剂、粘性增强剂、 阻滞剂及盐渗入样本垫然后加以干燥，该工艺可避免使用 复杂辨识剂/追迹缓冲液的麻烦，使检测一步完成。
16 24.5 41
1%柠檬酸三钠加 入量(ml)
2 1.5 1
胶体金特性 呈色
橙色 橙色 红色
λ max
518nm 522nm 525nm
71.5
0.7
紫红
535nm
胶体金颗粒的TEM图像

平均颗粒大小 ~ 17nm
优质金颗粒和劣质金颗粒
. 劣质金外形不均一，且 非球形，有凝集现象， 颗粒间变异系数较大
免疫胶体金技术
Immune colloidal gold technique
胶体金标记技术的相关定义
免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗 体的一种新型的免疫标记技术。 胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒 表面的包被过程。
胶体金技术的发展
Development of Immune colloidal gold technique
吸收垫(Absorbent Pad)：
提供高吸收率、高容量以及相对稳定吸收率的吸 收纸； 吸收纸的作用： 主要表现在控制样品的流速，促进虹吸作用以及 使试剂跨过膜而不仅仅移到膜上。
片材：
不干胶塑料衬底，片材的质量很大程度上影响了 产品的货架期。
研究和应用
胶体金法检测HEV-IgM
胶体金法检测TB-Ab(双抗原夹心法)
纯化


在浓缩和储存前，金标抗体必须从多余的抗体和 小的聚集簇中提纯出来。 以合适的速度搅拌金标溶液以获得合适大小的金 标粒子。 金标记物会以离心管底部的沉淀物形式分离出来， 弃去清澈的上清溶液，并用合适的缓冲溶液进行 复溶. 如果制备方法正确，金标溶液可以在4℃冰箱内保 存数月，如果需长时间保存就需要将其分装成1ml 的小包装并增加20％的丙三氧基。这样就可以冷 冻并在-20℃冰箱内保存数年。
金标样本程序


将胶体金调整至正确的pH值 确定最小蛋白含量 最终结合（标记） 纯化
为胶体金调整正确的pH值
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一 般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢 固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至 待标记蛋白质的等电点略偏碱。
硝酸纤维膜的选择

膜的分类标准(μm和s)
µm: 指的是膜孔径， s: 以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是***s. 换算情况大致为：8μm=135s；6μm=180s

不同秒数的膜对反应的影响
通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读 数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢， 也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发 生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不 一定就能够真正的提升灵敏度。

硝酸纤维素膜与蛋白结合的原理 主要有两种假说：
1）首先两者靠静电作用力结合，然后靠H键和疏水作用来 维持长时间结合。 2）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长 时间结合。 两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面 长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的 工作非常依赖实践经验。
免疫胶体金技术的特点



优点：
检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； 试剂稳定，适用于单份测定； 无污染。 GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室 即有条件开发生产。 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。


成为目前“病人身边检验”（point-of-care testing，POCT） 中广为应用的方法。
需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要 降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可 能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测 定其pH即可.
蛋白 与胶体金结合的最佳pH测定


பைடு நூலகம்
取若干1.5ml的试管，分别加入1ml胶体金 用K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10； 去96孔培养板，按pH从高到低分别将上述胶体金分别取 100ul加入孔中，重复三次； 每孔分别加入20ul浓度为10%的NaCl溶液，混合，室温下 放置10min； 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH
为胶体金调整正确的pH值
常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值
最小蛋白用量的确定

（1）光电比色法：制备一系列不
同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml）， 分别加入5ml胶体金中，迅速混匀， 然后，各加入1ml 10% NaCl溶液， 摇匀，静置5min后测各管。根据胶 体金颗粒的大小，OD在520～580nm 之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白 质用量为横坐标作一曲线，取曲线 最先与横轴相接近的那一点处的蛋 白质用量为最适稳定量。图5.2中 10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适 稳定量为45μg/ml。
抗体如何被标记于金上




抗体结合于金上取决于三种独立且起独立而又相互依存的 力： a在带负电荷的金粒子和带正电的蛋白质间的离子引力。 B抗体和金表面的疏水力 C巯基(-SH)的影响(半胱氨酸和蛋氨酸） 最强的引力可能源于硫键将抗体Fc 段的两个区域进行的连接。
胶体金颗粒带电情况
抗体和金颗粒的耦联（图出处：IVD Technology）
A：金标记抗体 B：标本中的抗原 C：包被抗体 D：NC膜 E：吸水材料 F：塑料盒

免疫层析法( immunochromatogra-phy，ICA)
是继IGFA之后发展起来的另一种固相膜免疫测定， 与IGFA利用微局限性膜的过滤性能不同，免疫层析法 中滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用(基于层 析作用的横流 （lateral flow） )向另一端移动。移动过 程中被分析物 与固定在膜上某一区域的受体(抗原或者 抗体)结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分 离，然后通过标记物显色来判定试验结果，以胶体金 为标记物的实验称为胶体金免疫层析试验。
结合垫(Conjugate pad)：
玻璃纤维、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布等多种材 质，多种规格，批间稳定。
结合垫的作用主要为：
吸附一定量的金标结合物颗粒； 吸附并持续不断的将样品转移到NC膜上； 保持金标结合物颗粒的稳定性； 保证金标结合物颗粒定量完全释放等。
硝酸纤维素膜( Nitrocellulose)：
胶体金技术的种类及优点

快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者 为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片 吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜， 标记结合物为免疫金。

（2）目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比 例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5μg～45μg另设对照 管），各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中， 5min后，在上述各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表5-5 顺序进行。



量取1ml的胶体金至一系列的3ml的干净塑料管中 用100mM的K2CO3或100mMHCl调整抗体至正确的 pH值。 在每支塑料管中加入从0到150μl的一系列抗体（例 如：0～15μg的是指在每管中分别加入0，1，2， 一直到15μg的抗体） 摇动每支塑料管并放置约5分钟以便于结合
Thanks
最终结合（IgG）



取100ml金溶液，调整pH值至9 调整滤过和离心的抗体溶液（0.1μg/μl）至pH9.2 当金溶液在快速搅拌时要逐滴加入定量的抗体 5分钟后在金标溶液pH为9时加入10ml滤过的10％ BSA并轻轻搅拌10分钟 在每支管中加入100μl，10％的NaCl并搅拌1分钟。 判断获得最小蛋白量的稳定胶体金溶液
胶体金合成



溶液颜色随金颗粒的大小广泛的变化。通常为深红色。 但是也有深棕色/紫色至浅橙色/黄色。 胶体的大小由金来控制：柠檬酸盐的比率大约在1到 100nm。（？） 柠檬酸盐很容易被亲金物质所取代(例如：硫醇)