waters_e2695_training

正相色谱法 反相色谱法
固定相极性
高~低
中~低
流动相极性
低~中
中~高
组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出
适用范围
溶于有机溶剂 的极性至中等 极性的分子型
化合物
较广，非极性 至中等极性的
组分
HPLC 基础知识简介
Chromatogram
3
HPLC 基础知识简介
Peak
色谱图名词术语 Baseline
Waters液相操作
2）打开在线脱气机：在面板中直接操作或者软件
中打开。
Waters液相操作
3）色谱泵排气：
3.1）dry prime: 干抽，仪器停放很长 时间后管路空了，无法wet prime时， 用于快速排空气泡。
Waters液相操作
3.2）Wet prime: 湿抽， 快速替换管路中溶剂用的。注意：
Waters e2695 进样系统系统
五个独立的24位样品盘
Waters 2998 PDA检测器
PDA检测器的三维(3D)图
Waters液相操作
1、溶剂准备：色谱wenku.baidu.com级别
a): 过滤—0.45μm滤膜（纤维素膜水溶液， 尼龙、PTFE通用型） b):脱气—超声3-5min，排除O2，N2等。保证流量准确，提高色谱图重现
Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰
Ghost Peak: 假峰
HPLC 基础知识简介
3
HPLC 基础知识简介
3 理论塔板数(N): 分离效率的量度,
HPLC 基础知识简介
3
容量因子k'
3
分离因子α
3
HPLC 基础知识简介
理论塔板数(N): 分离效率的量度, 3
填料颗粒度越小,N 越大；流动相流速V 越高,N 越大。柱长越厂，N越大。
Waters液相操作
2、开机一般流程：开启HPLC系统各个设备的电源。 1525系统：
开泵、柱温箱、自动进样器:待设备通过自检后，打开计 算机。 打开检测器电源:检测器通过自检后（3-5min）,才能被软 件控制, 建议有流动相流经检测器后再开启电源。 启动色谱管理软件,1525系统没有控制版面，所有操作都 需在软件上执行。
Waters液相操作
4）清洗进样器系统：
当更换流动相或者发现注射器内有气泡 时（纯甲醇清洗），需要对进样系统进 行清洗，主要包括对定量环和注射器的 清洗 。
Waters液相操作
2、系统平衡：跑基线
正确安装色谱柱后，用准备好的流动相平衡系统，大约0.5~1h.
3、样品准备：过滤，样品瓶中应有超过1//3高度 的样品量。 4、编制仪器方法，开始试验，软件操作。 5、清洗：实验结束后，应对液相系统（进样器、泵、检测器等）、
Peak Base
Peak Height
Peak Width 3
Peak Width at Half Height
Baseline Drift: Baseline Noise: Band Broadening:组分在色谱柱
Peak Area
内移动过程中谱带宽度增加的现象。
Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰
常见色谱图-Troubleshooting
2、峰面积波动
同一时间多次进样波动：注射器内有气泡、流速不规律变 化（泵和单向阀问题）、前伸峰和拖尾峰的积分方法问题、 样品未完全洗脱（样品之间加一针空白样）等。 一般来说，峰面积的标准偏差在1%范围内可以接受， 0.2~0.5%是非常好的。
k‘， α和N，如何控制？
3
HPLC 系统组成部件
Waters HPLC 系统组成
硬件系统： –泵(515,1515,1525,600,616,626…) –进样器(7725i,717Plus…) –色谱柱(Symmetry C18, NovaPakC18,…) –检测器(2698/2996, 2487,2475,EMD…) –2695/2795分离单元(溶剂管理与样品管理集成为一体)
常见色谱图故障-Troubleshooting
1、色谱图保留时间变化问题
A）前后两针进样差异大：泵以及混合器问题。 B）同一实验条件，同一批实验保留时间一致，隔一短时间进样结果与 之前相差较大：流动相组成问题。 配比误差：1%的误差，引起RT5~15%变化。一般按重量比配比比按体 积比会更加准确一点 pH误差：0.1单位的改变，引起RT10%变化。 脱气方法：需最大程度减少流动相挥发。 温度的影响：色谱峰的保留时间变化方向一致，据经验，温度每变化1 度，保留时间会有1%~2%的变化。
空白溶剂出现色谱峰时，需加倍清洗或者调整样品浓度顺序 （L-H）。
常见仪器故障-Troubleshooting
5、色谱柱故障：
6、检测器故障：灯故障易引起噪声大，灵敏度下降。 流动相和样品脏易引起流通池污染和堵塞故障。
常见仪器故障-Troubleshooting
7、堵-压力高
柱压升高，升高的依据应该跟之前相同条件下所得的柱压进行 对比。 堵应该先排除是系统堵还是柱子堵，首先断开色谱柱，连接两 通，如果压力超过1500psi，那么系统肯定是堵了，滞后逐一 排查，清洗或者更换被堵部件。
溶剂的互溶性，如：在由缓冲溶剂改为高有机物含量的溶剂 时，为避免“分离单元”内出现盐沉淀，请使用中间溶剂 （如水）。在 Main （主）屏幕中，按 Menu/Status 显示 Status （状态）屏幕。按 Direct Functions 菜单。
排气后系统输液温度，压力波动小,一般在几十Psi以内),否则,需重做排气操作
1、流动相及溶剂瓶
流动相脱气不充分易引起噪声大，出现毛刺峰。溶剂过滤器 堵塞会引起流动相供给不畅，压力不稳。流动相被污染了会引 起基线上升，梯度洗脱出现鬼峰。
2、初始化错误：Plunger homing over pressure-在线过
滤器堵塞。
3、泵常见故障：Lost Prime-单向阀堵死。 4、进样器故障：需使用匹配的进样瓶，易出现进样针堵塞，
Waters的HPLC系统
Waters e2695系统
流速精度达到0.075%
--1.梯度比例阀(GPV);2.进口阀;3.主柱塞（传送溶液）;4.主压力传感器;5. 蓄积柱塞（向系统输送液体）;6.系统压力传感器;7.独立的线性柱塞驱动 马达（与传统一个马达驱动串联或并联泵相比，无压力波动，没有出口阀，减 少故障率）
现。
仪器方法：设置仪器参数采集样品 处理方法：对色谱数据进行处理计算 报告方法：对色谱结果打印报告 输出方法：输出色谱数据。 方法组：将上述方法组合，从而可以进行数据的批处理。
Waters软件操作
4、单次进样和样品组进样 5、3D数据处理 6、打印报告
常见仪器故障-Troubleshooting
Waters液相操作
e2695系统：1）打开电源开关，仪器启动诊断程序会开
始
常见问题：“plunger homing over pressure ”，初始化中断。
解决办法：打开排液阀，重新 初始化。
屏幕上会显示Main界面，继续进行针 头、注射器和阀门，样品转盘托架和 溶剂管理系统这些机械部件进行诊断 测试，测试成功后，系统进入“Idle” 状态。
Waters液相操作
1、溶剂准备：
1525系统：A,B两通道流动相，针头清洗液（绿色）。 e2695系统：
流动相--最多可以做A,B,C,D四通道梯度混合洗脱。 灌注柱塞密封清洗液（seal wash）--一般建议使用10%~20%甲醇 水溶液。 针头清洗液（绿色）-- 一般选择样品最后几分钟洗脱相似的溶剂 作为洗脱溶剂。
色谱柱进行清洗。建议批量进样后，最后进一针50ul流动相，如果流动
相中有盐，则用纯水代替缓冲盐那部分比例。清洗后色谱柱和系统中需 填充需要的溶剂。
6、关机：退出Empower控制软件，依次关闭泵，检测器，电脑等电
Waters软件操作
1、登入 2、项目建立 3、方法编辑。Empower中所有功能都需要相应的“方法”去实
性，增加信噪比（低紫外去氧气吸收），保护色谱柱（填料氧化）。
c):溶剂截止波长：最好避免，如乙腈和水190nm, 甲醇和乙醇 210nm,等。 d):缓冲盐流动相：需现配现用，低温密封保存最多3天；
有机溶剂和缓冲盐（水）混配流动相，需低温保存。 e):溶剂混溶性：建议用色谱纯10%异丙醇or水作为过渡溶剂。
Waters 1525泵系统
Waters 717自动进样器
48 or 96位样品样品盘 可单独操作也可外部控制(IEEE)
Waters 2998 PDA检测器
PDA检测器的三维(3D)图
Waters HPLC 系统
Alliance 系统: -2690/5分离单元 -2998检测器 -Empower2 控制软件
软件系统： –积分仪(746)、工作站(PC800） –数据管理系统 ������ Breeze、Millennium32、Empower –Masslynx4.0软件平台(LC-MS)
Waters HPLC 系统
1525-717-2487-Breeze系统 1525-717-2998-Empower系统
Waters High Performance Liquid Chromatography（HPLC） Training
--中心实验室 唐翠娥
目录
1
HPLC 基础知识简介
2 HPLC 系统组成部件
3 Waters e2695实验操作
4
软件操作
5
常见色仪器和色谱图故障
HPLC 基础知识简介
表1.正相色谱法与反相色谱法比较表
常见仪器故障-Troubleshooting
色谱柱堵塞引起压力高，可能由于填料表面物质吸附 或沉淀引起，则需对色谱柱进行清洗，建议方法低流速 清洗。
反相色谱柱：水，甲醇，四氢呋喃，二氯甲烷, 甲醇 和水 正相色谱柱：二氯甲烷，四氢呋喃THF, 水,甲醇， 二氯甲烷。 如果还是不行，则可考虑反冲或者购买新柱。
Notes:溶剂吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清 洗和钝化处理。一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝 化剂，先清洗再钝化。清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢。钝 化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜。
（清洗钝化步骤：设ABCD25% 1ml/min 水-30%磷酸or6M硝酸 45min-水至中性-甲醇）