超临界流体色谱法

高效液相色谱法的特点
理论塔板数：理论塔板数是色谱分析中的一个重 要参数，它来源于塔板理论，是表示色谱柱对样 品的分离能力或者是分离效率（柱效）。理论塔 板数越高，分离效果越好。 塔板理论：塔板理论是色谱学的基础理论，它是 将色谱柱看成是一个分馏塔，将分离组分在分馏 塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固 定相和流动相之间形成某种平衡随着流动相的流 动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板， 同时形成新的平衡，直至完全被洗脱出去。
超临界流体色谱仪
5.检测器 各种GC和HPLC检测器均可用于SFC。 使用最多的是氢离子火焰（FID），限流器到FID喷 嘴的最佳距离是5-7mm。 流动相含有机改性剂时，不适用于FID，因而采用 蒸发光散射检测器（ELSD）作为通用检测器。 元素选择性检测器，如电子捕获（ECD)、火焰光度 检测器（PFD)、氮磷检测器（NPD）等均用于多氯 联苯、有机磷、硫、氨基甲酸酯农药等测定。
超临界流体色谱法的应用
从色谱图中可以看出EPA与SFC有较好的分离效果
超临界流体色谱法的应用 化妆品中维生素D2和维生素D3的SFC分析 分离模式：填充柱SFC 柱系统：ACQUITY UPC2 2-EP（2.1×100 mm，1.7 μm） 分析条件：A.二氧化碳，B.异丙醇 洗脱梯度：0 min，1% B，0.5 min，1% B，4 min，5% B 备压：2000 psi 柱温：50 ℃ 检测器：紫外，263 nm 说明：维生素D2和维生素D3由于结构上极为相似，因此是HPLC 分离的难点，目前主要采用正相HPLC分析方法进行分析。采用 SFC的检测方法能获得比正相HPLC方法一致或更高的分离度， 而且分析时间仅为3.9 min左右，效率很高。
脂肪醇 四氢呋喃 2- 基乙醇
超临界流体色谱仪
超临界流体色谱仪主要部分有注射泵（高压泵）， 进样系统，色谱柱，限流器，检测器
超临界流体色谱仪
1. 高压泵 SFC常用高压泵主要是螺旋注射泵和往复柱塞泵。 一般泵的缸体要冷却至0-10℃，要求工作压力不小 于400×105Pa，流量0.01-5.00mL/min范围内可调， 并能快速程序升压或程序升密度，且重现性好，压 力脉动尽可能小。此外，要求泵体耐腐蚀。过去多 数SFC仅有一个泵，当使用二元或多元流动相时， 使用预混合钢瓶，使流动相组成随压力降低而变化。 现已有两泵SFC系统，一个泵引入CO2或其他主流 体，另一个泵引入单一或混合改性剂。通过控制泵 速而改变混合流体体积比。
高效液相色谱法的特点
柱效:是指色谱柱保留某一化合物而不使其扩散 的能力。
柱效能:是一支色谱柱得到窄谱带和改善分离的 相对能力。 色谱柱的有效塔板数越大或有效的塔板高度越低， 色谱柱的柱效越好，类似于每个塔板的分离效率相 同，有效塔板数越多，最终得到的物质越纯。
高效液相色谱法的特点
超临界流体色谱法的分类 根据所用的色谱柱分类 ① 填充柱超临界流体色谱（填充柱） ② 毛细管超临界流体色谱（毛细管柱） 根据色谱过程的用途分类 ① 分析型SFC：主要用于常规的分析 ② 制备型SFC：常用超临界二氧化碳作为流动相。
超临界流体色谱法的工作原理
（二）改性剂 在SFC中，弱极性或非极性超临界流体流动相如 CO2，对于一些极性化合物的溶解能力较差。为 了加强其对极性溶质的溶解和洗脱能力，常常向 其中加入一定比例的极性溶剂称为改性剂，加入 的量一般为1%-5%，以甲醇最常用，其次是其他 脂肪醇，表中列出了部分适于二氧化碳的改性剂 及应用特性。 在分离酸性或碱性化合物时，也可以向CO2流动 相中加入酸或碱，使其峰形变锐。
超临界流体色谱法的应用
从图中可 知维生素 D2和维生 素D3的分 离效果较 好，而且 分离时间 短
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超临界流体色谱仪
4. 限流器（阻尼器） 超临界流体色谱仪必须装有限流器。它的作用是 对系统维持一个合适的压力，为使流体在整个分 离过程中始终保持在超临界流体状态；另一方面 通过它使流体转换为气体，实现相的转变。当使 用氢火焰离子化检测器时，阻力器应放在检测器 之前（以保证色谱柱的出口压力缓慢地降至常 压）。使用其他（能承受高压的）检测器时，阻 力器可放在检测器之后，如紫外检测器。为防止 高沸点组分的冷凝，阻力器一般应维持在300400℃
超临界流体色谱法的工作原理
超临界流体色谱的流动相和改性剂 （一）流动相
SFC的流动相为超临界流体。超临界流体的主要特点是在不 同压力下对各种样品有不同的溶解能力。其溶解度随超临界 流体密度的增加而增加。当两组分的溶解度常数越接近时，， 其互溶性就越好。几种常用的超临界流体的溶解能力在相同 的压力条件下顺序是乙烷<二氧化碳<氧化亚氮<三氟甲烷， 在相同条件下其分离能力是：＜二氧化碳＜氧化亚氮＜三氟 甲烷≈乙烷。 除溶解性能外，还要与检测器相适应，CO2是最常用的流动 相。其临界温度低、压力适中，容易操作，相对便宜，无毒 无嗅，安全性好，且在190nm以上无紫外吸收。
超临界流体色谱仪
3. 色谱柱 ①填充柱 填充柱与HPLC柱相似，基于分配平衡实现分离， 柱长可达25cm，分离柱内径0.5-4.6mm。使用粒径 为3-10µm的填料填充。如硅胶、-NH2、-CN及C18、 C8等化学键合相均可用于SFC。其中以极性填料的 分离效果更好。SFC在手性化合物的分离上效果优 于HPLC。 ②毛细管柱 较常用的填充毛细管柱内径≤0.5mm，柱长为1030mm；开管毛细管柱主要是内径为50-100μm化学 交连的各种硅氧烷柱或其它类型的交连柱。
选择性较强，SFC可选用压力程序、温度程序，并可选用不同的 流动相或者改性剂，因此操作条件的选择范围较GC更广。
高效液相色谱法的特点
2.SFC与LC的比较
分析时间短，由于超临界流体粘度低，可使其流动速率比高效液 相色谱（HPLC）快得多，在最小理论塔板高度下，SFC的流动相速 率是HPLC的3-5倍左右，因此分离时间缩短。 总柱效比LC高，毛细管SFC总柱效可高达百万，可分析极其复杂 的混合物，而LC的柱效要低得多。当平均线速率为0.6 cm/s时,SFC 法的柱效可为HPLC法的4倍左右。 SFC的检测器应用广。SFC可连结各种类型的GC、LC检测器，如氢 离子火焰(FID)、氮磷检测器（NPD）、质谱（MS）、傅里叶变换红 外光谱（FTIR）以及紫外（UV）、荧光（FLD）等检测器。 流动相消耗量比LC更低，操作更安全。
超临界流体色谱仪
紫外吸收（UV）检测器是含有机改性剂流动 相常用的检测器，要求检测池必须耐高压。 各种结构分析检测器，包括质谱（MS）、傅 里叶红外光谱（FTIR）、核磁共振（NMR）。
此外能用于SFC的检测器还有等离子体发射 光谱检测器、电导检测器、荧光检测器等。
超临界流体色谱法的应用
超临界流体色谱法的工作原理
常用CO2改性剂
CO2改性剂 甲醇 检测方法 UVD MS FIDC（用量应少 于1%） UV MS UV MS UV CO2改性剂 脂肪 二甲基亚砜 乙 二氧甲烷 甲醇 二氧化碳 水 检测方法 UV UV UV MS UV MS UV MS FID UV MS FID UV MS FID
超临界流体色谱法的概述
从热力学上看，超临界流体的密度是气体的1001000倍，和液体相近，具有和液体相似的溶解能 力及与溶质的作用力。 从动力学上看，超临界流体的黏度比液体低，可 以使用比液相色谱更大的线速度；扩散系数是液 体的10-100倍，传质速率高，因而可以获得比高 效液相色谱更高的柱效和更快的分析速度。
超临界流体色谱仪
2. 进样系统 SFC一般采用HPLC手动或自动进样阀。对于填充 柱，采用带试样管的Rheodyne型六通进样阀。对 毛细管柱，采用类似气相色谱的动态分流及微机 控制开启进样阀时间的定时分流进样；亦可与超 临界流体萃取（SFE）在线连用柱头进样等。进样 重复性不仅与进样方式有关，而且与进样温度、 压力有关，需严格控制。
超临界流体色谱法的应用 二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在SFC上的分析 分离模式：填充柱SFC 柱系统：Dikma ODS色谱柱（4.6×250 mm，5 μm） 分析条件：纯的二氧化碳 备压：20 MPa 柱温：90 ℃ 从EPA和DHA的分子结构可以看出，EPA和DHA的主要差 别在于碳链长度和双键数目的不同，可利用ODS柱对EPA和 DHA作用力的差异将两者分开。在试验中考察了操作温度 和压力对容量因子和分离度的影响，提高温度和降低备压 对分离是有利的。
超临界流体色谱法
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超临界流体色谱法的概述 超临界流体色谱法的特点 超临界流体色谱法的工作原理 超临界流体色谱仪 超临界流体色谱法的应用
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超临界流体色谱法的概述
超临界流体色谱(supercrical fluid chromatography,SFC) 是以超临界流体作为流动相的色谱方法，是20世纪80年 代以来发展迅速的一个色谱分支。 超临界流体：在高于临界压力和临界温度时的一种物质 状态。它既不是气体，也不是液体，它的物理特性介于 气体和液体之间。 三相点：在热力学里，可使一种物质三相（气相，液相， 固相）共存的一个温度和压强的数值。如：水的三相点 在0.0076℃及610.75Pa ；汞的三相点在−38.8344℃及 0.2MPa
SFC可弥补GC和HPLC在分析性能上的某些不足，分离效能 和分析速度介于两种色谱方法之间。 SFC可分析不宜用GC分析的一些物质，如强极性、强吸附 性、热稳定性差、难挥发的化合物； 它可分析相对分子质量比GC大几个数量级的物质。 SFC可分析HPLC难以检测的各种化合物，如无紫外吸收的 各种天然产物、高分子聚合物。 现在SFC已用于分离分析脂肪酸甘油酯、类脂物、胆固醇、 胆汁酸、脂溶性维生素、氨基酸、多肽、石油中高级脂肪 烃（>C100)、高级脂肪醇、烃基聚硅氧烷、聚乙二醇、聚 醚、金属有机化合物、聚烯烃等。
超临界流体色谱法的特点 SFC因其超临界流体自身的一些特性 ，使得该方法较气相(GC)和液 相(LC)有一定的优势
1. SFC与GC的比较
SFC可以用比GC更低的温度，从而实现对热不稳定化合物进行有 效的分离。由于柱温降低，分离选择性改进，可以分离手性化合物。 由于超临界流体的扩散系数比气体小，因此SFC的谱带展宽比GC 的要窄。 SFC溶剂能力强，许多非挥发性组分在SFC中溶解度较大，可分析 非挥发性的高分子、生物大分子等样品。
超临界流体色谱法的工作原理
SFC的流动相：超临界流体(CO2、N2O、NH3等） SFC的固定相：固体吸附剂(硅胶)或键合到载体 (或毛细管壁)上的高聚物；可使用液相色谱的 柱填料。 分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配 系数不同而被分离。
超临界流体色谱法的工作原理
压力效应：SFC的柱压降大(比毛细管色谱大30倍)， 对分离有影响(柱前端与柱尾端分配系数相差很大， 产生压力效应)；超临界流体的密度在临界压力处受 压力最大，超过该点则影响小，超过临界压力20%， 柱压降对分离的影响小；超流体的密度随压力增加 而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。 例：CO2作为流动相时，当压力改变：7.0→9.0×106 Pa，C16H34的保留时间 25min → 5min。
超临界流体色谱法的概述 纯物质的相图如图所示，在温 度高于某一数值时，任何大的 压力均不能使该纯物质由气相 转化为液相，此时的温度即被 称之为临界温度(Tc)；而在临 界温度下，气体能被液化的最 低压力称为临界压力(Pc)。当 物质所处的温度高于临界温度， 压力大于临界压力时，该物质 处于超临界状态。温度及压力 均处于临界点以上的液体叫超 临界流体。