人胰岛素的制备
(完整word版)人胰岛素的工业制备
人工胰岛素制备工艺的研究及其进展摘要:据WHO 统计，全世界糖尿病患者已接近1.2亿，而我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。
如今我国经济发展迅速，同时也带来了巨大生活的压力和健康问题，并且带有一定的遗传因素，数百万患者需要长期使用胰岛素治疗。
胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
而目前临床使用的胰岛素有三种来源：1、动物胰岛素（从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体）。
2、半合成胰岛素（将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素）。
3、重组人工胰岛素（利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同）。
可见第三种方法是目前最好的副作用最小，而且简单安全的方法。
所以针对重组人工胰岛素的制备做了以下研究。
关键词:重组人工胰岛素；大肠杆菌；(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原；在当今世界范围内，诺和诺德、辉瑞、万安特以及我们国内的通化东宝、深圳科兴等生物技术公司在胰岛素的生产技术上已经都是很先进的水平了，也就是重组人工胰岛素的制备方法。
这种方法是自从动物中提取胰岛素和人工合成胰岛素的方法以来，最简便而且是最有效最安全的制备胰岛素的方法。
它是发酵工程技术和基因工程技术结合的产物，也是造福人类的新一代药物生产方法。
不仅在治疗糖尿病方面的作用突出，同时对治疗癌症等严重影响人类健康的疾病的治疗开创了思路。
所以，作为本科生的生物技术专业制药方向的大学生来说，这种利用基因工程，发酵工程等方法工业制备胰岛素的原理和流程的工艺，和这种开拓创新的思维是我们必须要了解和学习得。
1重组人工胰岛素的生产原理通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
重组人胰岛素的制备流程
重组人胰岛素的制备流程胰岛素是一种重要的蛋白质激素，对于调节血糖水平起着至关重要的作用。
重组人胰岛素是通过基因工程技术制备的人工合成胰岛素，它与人体自然产生的胰岛素具有相同的结构和生物活性。
下面将介绍一种常用的重组人胰岛素制备流程。
制备重组人胰岛素的第一步是获得胰岛素基因的DNA序列。
这可以通过两种途径来实现。
一种是从人体中分离出胰岛细胞，然后提取其中的RNA，通过逆转录酶将RNA转录成DNA，从而获得胰岛素基因的DNA序列。
另一种方法是从人体细胞库中筛选出含有胰岛素基因的细胞，然后从这些细胞中提取DNA。
这两种方法都需要进行PCR扩增，以增加目标基因的数量。
接下来，将获得的胰岛素基因插入到表达载体中。
表达载体是一种能够在细胞中稳定复制的DNA分子，它可以携带外源基因并使其在细胞中表达。
常用的表达载体有质粒和病毒。
将胰岛素基因与表达载体进行连接，形成重组胰岛素基因载体。
然后，将重组胰岛素基因载体导入到宿主细胞中。
常用的宿主细胞有大肠杆菌和酵母等。
将重组胰岛素基因载体转化到宿主细胞中后，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组胰岛素基因在细胞内得以表达。
接着，利用细胞培养技术进行大规模的培养和表达。
将转化了重组胰岛素基因的宿主细胞培养在培养基中，通过控制培养条件和添加适当的诱导剂，促使细胞大量表达重组胰岛素。
培养时间一般为数天至数周，取决于细胞的生长速度和表达量。
在细胞培养过程中，重组胰岛素会以包括细胞内溶胞液和培养基在内的形式存在。
为了提取和纯化重组胰岛素，需要经过细胞破碎、离心、过滤等步骤，以去除细胞碎片和其他杂质。
然后，通过离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等技术，对重组胰岛素进行纯化。
对纯化后的重组胰岛素进行结构和活性的分析。
利用质谱、核磁共振等技术，确定重组胰岛素的分子质量和结构特征。
同时，通过生物活性测定，验证重组胰岛素与天然胰岛素的功能等效性。
重组人胰岛素的制备流程主要包括获得胰岛素基因序列、构建重组胰岛素基因载体、转化宿主细胞、大规模培养和表达、纯化和结构活性分析等步骤。
胰岛素的原理及生产过程
胰岛素的原理及生产过程胰岛素是一种由胰岛β细胞分泌的激素，其主要功能是调节血糖水平。
它通过促进葡萄糖的摄入和利用，以及抑制肝脏对葡萄糖的合成和释放，维持正常的血糖水平。
胰岛素生产的过程可以分为以下几个步骤：1. 细胞培养：胰岛素的生产通常使用细胞培养技术，主要使用胰岛β细胞系来进行。
这些细胞系可以从人类胰腺中分离出来，并在细胞培养基中培养。
2. 细胞培养基的制备：胰岛β细胞系需要适合其生长和分化的培养基。
培养基的配方通常包括氨基酸、葡萄糖、胰岛素、胆固醇等成分，以提供细胞所需的营养物质。
3. 培养条件的优化：为了获得高产量和高质量的胰岛素，需要对培养条件进行优化。
这包括调整培养基的成分、pH值和温度等因素，以及添加适当的生长因子和细胞因子来促进细胞的生长和分化。
4. 细胞的分离和提取：当细胞达到一定密度后，需要将其分离和提取。
这通常使用胰岛素泵进行，通过负压抽取培养液中的胰岛素。
5. 纯化和精制：提取的胰岛素通常还存在其他蛋白质和杂质。
为了得到纯度较高的胰岛素产品，需要进行纯化和精制过程。
这包括使用过滤、离心、层析等技术，以去除杂质并提高纯度。
6. 结晶和干燥：纯化的胰岛素溶液可以通过结晶和干燥过程得到固体胰岛素。
这通常通过加入适量的溶剂和控制温度来实现。
7. 产品的包装和贮存：最后，胰岛素产品需要进行包装和贮存。
常见的包装形式包括注射用玻璃瓶和笔式注射器。
为了保证产品的质量和稳定性，胰岛素通常在低温下保存。
总结起来，胰岛素的生产过程主要包括细胞培养、培养基制备、培养条件优化、细胞的分离和提取、纯化和精制、结晶和干燥以及产品的包装和贮存。
这些步骤需要严格控制，以获得高产量、高纯度和稳定性好的胰岛素产品。
重组人胰岛素制备工艺
重组人胰岛素制备工艺引言胰岛素是一种由胰腺β细胞分泌的激素，它参与调节葡萄糖代谢，维持血糖水平稳定。
然而，对于许多糖尿病患者，体内胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗使得血糖控制成为难题。
为了解决这一问题，重组人胰岛素制备工艺应运而生。
本文将详细介绍重组人胰岛素的制备工艺，以及如何通过优化制备工艺提高其产量和质量。
关键词介绍1、重组人胰岛素：是指利用基因工程技术，通过细胞培养或微生物发酵生产的胰岛素。
它具有与天然人胰岛素相同的结构和功能，因此在临床上有广泛的应用。
2、制备：是指通过一系列工艺步骤，从原料中提取或制造出所需物质的过程。
在重组人胰岛素制备中，主要包括基因工程操作、细胞培养、发酵、分离和精制等步骤。
3、工艺：是指实现制备过程的一系列具体方法和操作规程。
工艺的选择和优化直接影响到产品的产量和质量。
重组人胰岛素制备工艺1、酵母菌的筛选：选用适合生产重组人胰岛素的酵母菌种，对其进行筛选和改良，以提高发酵过程中的产量。
2、基因工程操作：将人胰岛素基因插入到酵母菌的染色体或质粒中，确保基因正确表达。
3、发酵：在适宜的营养条件下，利用筛选得到的酵母菌进行发酵生产。
4、分离和精制：通过一系列物理、化学和生物学方法，将重组人胰岛素从发酵液中分离出来，并进行精制和纯化，以得到高纯度的产品。
制备工艺优化1、通过现代实验设计方法和技术，如响应面法和均匀设计法，筛选最佳工艺条件，以提高重组人胰岛素的产量和质量。
2、通过基因工程技术改良酵母菌，增强其生产重组人胰岛素的能力，提高产量。
3、采用先进的分离和精制技术，如高效液相色谱和超滤膜过滤等，进一步提纯产品，提高产品质量。
4、结合计算机模拟技术和实验验证，模拟工艺过程，指导实际生产，优化制备工艺。
重组人胰岛素制备工艺在糖尿病治疗中具有重要意义，本文详细介绍了其制备过程及优化方法。
通过合理选择工艺条件和基因工程改良，可以有效提高重组人胰岛素的产量和质量。
随着科学技术的发展，相信未来制备工艺将进一步优化，为糖尿病患者提供更好的治疗选择。
人胰岛素的工业制备
人工胰岛素制备工艺的研究及其进展摘要:据WHO 统计，全世界糖尿病患者已接近1.2亿，而我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。
如今我国经济发展迅速，同时也带来了巨大生活的压力和健康问题，并且带有一定的遗传因素，数百万患者需要长期使用胰岛素治疗。
胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
而目前临床使用的胰岛素有三种来源：1、动物胰岛素（从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体）。
2、半合成胰岛素（将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素）。
3、重组人工胰岛素（利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同）。
可见第三种方法是目前最好的副作用最小，而且简单安全的方法。
所以针对重组人工胰岛素的制备做了以下研究。
关键词:重组人工胰岛素；大肠杆菌；(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原；在当今世界范围内，诺和诺德、辉瑞、万安特以及我们国内的通化东宝、深圳科兴等生物技术公司在胰岛素的生产技术上已经都是很先进的水平了，也就是重组人工胰岛素的制备方法。
这种方法是自从动物中提取胰岛素和人工合成胰岛素的方法以来，最简便而且是最有效最安全的制备胰岛素的方法。
它是发酵工程技术和基因工程技术结合的产物，也是造福人类的新一代药物生产方法。
不仅在治疗糖尿病方面的作用突出，同时对治疗癌症等严重影响人类健康的疾病的治疗开创了思路。
所以，作为本科生的生物技术专业制药方向的大学生来说，这种利用基因工程，发酵工程等方法工业制备胰岛素的原理和流程的工艺，和这种开拓创新的思维是我们必须要了解和学习得。
1重组人工胰岛素的生产原理通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
基因工程制备胰岛素的原理
基因工程制备胰岛素的原理基因工程制备胰岛素的原理主要涉及三个步骤：基因克隆、表达和纯化。
第一步：基因克隆。
首先，从人类组织或细胞中提取出编码胰岛素的基因，即胰岛素原基因（proinsulin gene）。
然后，使用酶切酶将这个基因剪切成多个片段。
接下来，将剪切好的基因片段与载体（通常是质粒）连接，形成重组质粒。
再将这个重组质粒转化到细菌中（如大肠杆菌）进行复制。
经过培养、筛选和鉴定，得到含有胰岛素基因的重组质粒。
第二步：基因表达。
将所得到的重组质粒注入到宿主细胞（通常是培养的动物细胞或真核表达系统）中，使其成为重组表达宿主。
在宿主细胞中，重组质粒会被转录成胰岛素的mRNA，并被细胞质中的核糖体翻译成胰岛素的前体蛋白（proinsulin）。
然后，前体蛋白经过一系列的翻译后修饰，如信号肽的剪切和糖基化等，转变成成熟的胰岛素蛋白。
第三步：纯化。
经过表达的胰岛素会以包括其他蛋白质的复杂混合物的形式出现在表达宿主细胞中。
因此，需要对这个混合物进行纯化，以获得高纯度的胰岛素。
一种常用的方法是使用层析技术，如亲和层析和离子交换层析等，根据胰岛素与某些特定配体（如金属离子或抗胰岛素抗体）的亲和性来进行分离和富集。
通过这些层析步骤，可以得到纯度较高的胰岛素。
总结起来，基因工程制备胰岛素的原理主要涉及基因克隆、基因表达和纯化。
通过基因克隆，首先获得含有胰岛素基因的重组质粒；接着，通过基因表达，将胰岛素基因在宿主细胞中转录和翻译成胰岛素蛋白；最后，通过纯化步骤，将胰岛素从其他蛋白质中分离出来，并得到高纯度的胰岛素。
这种方法可以大量制备胰岛素，为临床治疗糖尿病等疾病提供重要药物。
大肠杆菌制备胰岛备工艺流程
大肠杆菌制备胰岛备工艺流程
以下是利用大肠杆菌生产胰岛素的工艺流程：
1. 提取目的基因：从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。
2. 提取质粒：使用细胞工程，培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。
3. 基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。
4. 将质粒送回大肠杆菌：再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2，这使细胞会吸收外源基因。
此时将重组的质粒也放入培养液中，大
肠杆菌便会将重组质粒吸收。
5. 胰岛素的产生：在再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质。
通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。
以上步骤仅供参考，如果想要了解更多关于大肠杆菌制备胰岛素的工艺流程，建议咨询专业人士获取帮助。
人胰岛素的制备
人胰岛素的制备一、获得目的基因从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。
即得到了目的基因。
反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1, 细胞总RNA的提取:取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。
2 ，从总RNA中分离mRNA：取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。
70℃水浴（裂解RNA的二级结构），20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。
将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。
（二）mRNA转录合成cDNA第一链cone 第一链的合成加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、dNTP（加入放射性同位素利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。
取出置于冰上。
电泳分析，同位素活性测定。
（三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA 链。
PCR法的操作步骤：预变性引物退火引物延伸循环25-35次最后延伸✧前端引物：✧5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgtttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’✧后端引物：✧5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’二、组建重组质粒采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。
人胰岛素的工业制备
人工胰岛素制备工艺的研究及其进展摘要:据WHO 统计，全世界糖尿病患者已接近1.2亿，而我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。
如今我国经济发展迅速，同时也带来了巨大生活的压力和健康问题，并且带有一定的遗传因素，数百万患者需要长期使用胰岛素治疗。
胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
而目前临床使用的胰岛素有三种来源：1、动物胰岛素（从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体）。
2、半合成胰岛素（将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素）。
3、重组人工胰岛素（利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同）。
可见第三种方法是目前最好的副作用最小，而且简单安全的方法。
所以针对重组人工胰岛素的制备做了以下研究。
关键词:重组人工胰岛素；大肠杆菌；(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原；在当今世界范围内，诺和诺德、辉瑞、万安特以及我们国内的通化东宝、深圳科兴等生物技术公司在胰岛素的生产技术上已经都是很先进的水平了，也就是重组人工胰岛素的制备方法。
这种方法是自从动物中提取胰岛素和人工合成胰岛素的方法以来，最简便而且是最有效最安全的制备胰岛素的方法。
它是发酵工程技术和基因工程技术结合的产物，也是造福人类的新一代药物生产方法。
不仅在治疗糖尿病方面的作用突出，同时对治疗癌症等严重影响人类健康的疾病的治疗开创了思路。
所以，作为本科生的生物技术专业制药方向的大学生来说，这种利用基因工程，发酵工程等方法工业制备胰岛素的原理和流程的工艺，和这种开拓创新的思维是我们必须要了解和学习得。
1重组人工胰岛素的生产原理通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
重组人胰岛素的制备及生物学特性分析
重组人胰岛素的制备及生物学特性分析随着现代生物技术的发展，重组蛋白的制备技术越来越成熟，其中重组人胰岛素是一种应用非常广泛的重组蛋白。
本文将从重组人胰岛素的制备流程和生物学特性两个方面来探讨这一主题。
一、重组人胰岛素的制备流程1. 基因克隆重组人胰岛素的制备首先需要进行基因克隆。
胰岛素基因序列已经被多次确定，是由A链和B链两个多肽链组成的，其中A链由21个氨基酸组成，B链由30个氨基酸组成。
这两条基因在人的胰岛β细胞中均被表达，然后通过转录和翻译合成成分别为84个和30个氨基酸残基的前蛋白，再经由胰岛细胞内的酶的加工而形成两肽链胰岛素。
由于A链和B链之间存在两个二硫键，因此在基因克隆时需要将这两条基因串联起来并插入到适当的宿主细胞中。
2. 宿主细胞的选取重组人胰岛素的制备过程需要选择合适的宿主细胞。
常用的宿主细胞有大肠杆菌、腺病毒、哺乳动物细胞等。
制备过程中需要考虑到宿主细胞的易培养性、表达效率、翻译后修饰等因素。
3. 表达和纯化构建好质粒并选择好宿主细胞后，就需要使用适当的诱导剂刺激宿主细胞对胰岛素基因进行表达，接着进行纯化、离子交换和高效液相等步骤进行胰岛素的分离纯化。
这一部分的操作涉及到分子生物学、蛋白质化学等多个学科领域。
二、重组人胰岛素的生物学特性1. 作用机制胰岛素是一种影响葡萄糖代谢的激素，它可以促进葡萄糖进入细胞内以供能量消耗。
若胰岛素水平下降，会导致高血糖，甚至糖尿病等疾病的出现。
重组人胰岛素在体内能够发挥与天然胰岛素完全相同的作用，并且不会引发免疫反应，是治疗糖尿病等疾病的重要药物。
2. 生物学性质对于重组人胰岛素的生物学性质需要进行全面、客观的评价。
首先，作为一种重组蛋白，重组人胰岛素在体内不会引起免疫反应，因此可以安全应用于糖尿病等疾病的治疗；其次，重组人胰岛素的药效作用与天然胰岛素完全相同，可以达到相同的降血糖效果；此外，重组人胰岛素的半衰期较短，需要分次注射才能保持足够的药效。
重组人工胰岛素的原理
重组人工胰岛素的原理重组人工胰岛素是一种通过基因工程技术生产的胰岛素，可用于治疗糖尿病患者的胰岛素缺乏或不足。
它的原理是通过将人胰岛素的基因导入到一种细菌或酵母等表达系统中，使其产生人工胰岛素蛋白。
下面我将详细介绍重组人工胰岛素的原理。
首先，选择表达系统。
重组人工胰岛素的制备过程通常采用微生物表达系统，如大肠杆菌、酵母或昆虫细胞等，因为这些微生物具有较高的生长速度和较低的生产成本，能够大规模产生蛋白质。
其次，获得人类胰岛素基因。
人类胰岛素基因位于人类基因组中，通常从人胰腺组织中提取。
在实验室中，可以采用PCR技术将人胰岛素基因扩增并纯化。
然后，构建表达载体。
表达载体是一种DNA分子，可用于将人类胰岛素基因导入到微生物表达系统中。
载体通常含有启动子、终止子、选择标记等序列，在合适的条件下，它能够引导基因的转录和翻译。
接着，将人类胰岛素基因导入表达宿主。
导入表达宿主的方法有多种，如转化、电穿孔和病毒媒介等。
一旦导入宿主，人类胰岛素基因将会与宿主细胞基因组融合，并进入表达宿主的代谢途径。
随后，启动人胰岛素的表达。
一旦人类胰岛素基因被宿主细胞接受，宿主细胞就会开始转录和翻译该基因，在翻译的过程中合成胰岛素前体蛋白。
然后，该胰岛素前体蛋白会遵循内质网-高尔基体-高尔基体突起-溶酶体途径进一步转化为成熟的胰岛素蛋白。
最后，纯化和制剂处理。
人工生产的重组人工胰岛素与天然胰岛素的结构是一致的，但通常需要纯化和制剂处理来提高纯度和可用性。
纯化过程中可以使用凝胶过滤、离子交换、亲和层析等技术，以去除杂质和提高目标蛋白的纯度。
制剂处理包括稀释、配方和灭菌等步骤，以确保制剂安全。
总结起来，重组人工胰岛素的原理是通过将人胰岛素基因导入到微生物等表达系统中，使其产生人工胰岛素蛋白。
这种技术不仅提供了制造胰岛素的有效方法，也为糖尿病患者生产高纯度的胰岛素提供了可行策略。
重组人工胰岛素已经在临床应用中得到了广泛的使用，为糖尿病患者提供了重要的治疗选择。
利用重组酵母菌生产人胰岛素
利用重组酵母菌生产人胰岛素摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。
其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子，采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。
将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株，经过营养筛选和PCR 复筛，得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。
后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分批发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素。
纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。
关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定Using recombinant yeast to produce human insulinHuSheng 1142043040Abstract：The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as follow:get purpose gene→c onstruct the recombinant plasmid→construct the genetic engineering bacteria→fermentation of e ngineering bacterium→separation and purification of the product→identification of the product. The front three processes is building engineering bacteria of human insulin yeasts . Insulin gene was synthesized according to the amino acid sequence of human insulin and yeast preferential codons. The insulin gene was cloned in to pPIC9 vector and expression vector pPINS319 was constructed. The expression vector was digested with BgllI and then used to transform Pichia Pastoris GSll5 by electroporation. The expression analysis showed that the insulin gene w s able to expressed efficiently in Pichia Pastoris. The posterior three processes is large-scale production by fermentation.Through fed - batch fermentation getting fermentation liquor, separation and purification the fermentation liquor getting human insulin.The final products purified by supedrex 75showed one band by SDS-PAGE analysis and were identical with the native human insulin by all critetia employed.(SDS-PAGE analysis,amin acid composition analysis and bioidentity assay) Keywords：recombinant yeast;human insulin; fermentation;purification;identification 胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。
人胰岛素的工业制备
人胰岛素的工业制备
人类胰岛素是一种由蛋白质构成的药物，可用于控制血糖水平。
它由 51 个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基以特定的顺序排列在链上，形成了一条螺旋式结构。
人类胰岛素的制备主要涉及以下步骤：
1. DNA 重组技术生产基因
制备人类胰岛素的第一步是利用 DNA 重组技术生成表达人类胰岛素的基因。
这种基因可以使用人类组织中自然存在的胰岛素基因作为模板，并对其进行修改，使得其在细胞中产生大量的胰岛素。
2. 重组表达
重组表达是将人类胰岛素基因插入到合适的宿主细胞中，并使其在宿主细胞中大量表达胰岛素的技术。
这个过程需要在生物发酵釜中进行，一般采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 提纯和分离人胰岛素
当大量的细胞表达人类胰岛素后，需要分离和提纯胰岛素，以获得高纯度的药物。
这个过程通常包括柱层析、钠离子置换、逆流层析和超过滤等步骤。
使用这些技术，可以将胰岛素从其它蛋白质和杂质中去除。
4. 人胰岛素的晶体化
在提纯的最后阶段，人胰岛素的晶体化是非常必要的。
人类胰岛素是一种结构较为稳定的蛋白质，其结晶过程可使其更为纯净和稳定。
晶体化通常使用静态或动态技术，如批量结晶或连续结晶等方法。
总的来说，制备人类胰岛素需要经过一系列的制备和纯化过程，并需使用复杂的技术手段。
尽管人类胰岛素的制备过程复杂，但其应用广泛，已经成为治疗糖尿病的重要药物。
重组人类胰岛素制备工艺研究
重组人类胰岛素制备工艺研究人类胰岛素是治疗糖尿病的重要药物，自20世纪初被发现以来就一直受到广泛的关注。
随着现代生物技术的发展，利用重组DNA技术生产人类胰岛素已成为最主要、最经济的方法。
本文将就重组人类胰岛素制备工艺进行探讨。
一、重组人类胰岛素是什么人类胰岛素是由胰岛细胞产生的多肽激素，主要调节葡萄糖在体内的代谢。
结构上，它包括两个多肽链，A链和B链，它们由21个和30个氨基酸组成，而这些氨基酸的顺序是非常特定的。
重组人类胰岛素是通过将人类胰岛素的DNA序列插入到细菌或酵母等生物的DNA中，利用这些生物基因表达和生产人类胰岛素的蛋白质，达到生产大量纯度极高的人类胰岛素的目的。
这是一种完全体外合成人类胰岛素方法。
二、生产重组人类胰岛素的主要工艺流程生产重组人类胰岛素的主要工艺流程包括基因克隆、重组体表达、糖链修饰、纯化和结构鉴定等步骤。
1. 基因克隆生产重组人类胰岛素的第一步是从人类胰岛素基因库中选取A、B链基因、基因交链片段、启动子、终止子和选择反抗性基因等。
然后，在体外进行重组，使这些片段组合在一起，形成完整的胰岛素基因。
接下来，将这个基因克隆到表达载体上，以便细胞可以识别和表达它。
2. 重组体表达一旦重组表达载体被构建，便可以将其转化到大肠杆菌等生物中。
接着，这些生物被培养在液体培养基或固体培养基中，以促进基因表达和胰岛素蛋白合成。
重组人类胰岛素的产生需要大量的细胞培养，通常使用发酵罐、生物反应器和其他相关设备。
3. 糖链修饰胰岛素的生物活性取决于胰岛素蛋白中的糖链修饰。
然而，大肠杆菌在自然生态中并不会进行糖基化修饰，获取的表达产品如此也是裸露的蛋白链体，无法发挥生物活性。
为了获得具有生物活性的重组人类胰岛素，需要对其进行糖链修饰。
这个过程需要进行歧化和酶法处理，以检查和修改粘附到胰岛素蛋白上的糖基。
糖链修饰的最终产品可以具有各种形式的糖基链。
4. 纯化重组人类胰岛素是在细胞内产生的，因此需要进行后期精细纯化。
人胰岛素的工业制备
人工胰岛素制备工艺的研究及其进展摘要:据WHO 统计，全世界糖尿病患者已接近1.2亿，而我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。
如今我国经济发展迅速，同时也带来了巨大生活的压力和健康问题，并且带有一定的遗传因素，数百万患者需要长期使用胰岛素治疗。
胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
而目前临床使用的胰岛素有三种来源：1、动物胰岛素（从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体）。
2、半合成胰岛素（将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素）。
3、重组人工胰岛素（利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同）。
可见第三种方法是目前最好的副作用最小，而且简单安全的方法。
所以针对重组人工胰岛素的制备做了以下研究。
关键词:重组人工胰岛素；大肠杆菌；(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原；在当今世界范围内，诺和诺德、辉瑞、万安特以及我们国内的通化东宝、深圳科兴等生物技术公司在胰岛素的生产技术上已经都是很先进的水平了，也就是重组人工胰岛素的制备方法。
这种方法是自从动物中提取胰岛素和人工合成胰岛素的方法以来，最简便而且是最有效最安全的制备胰岛素的方法。
它是发酵工程技术和基因工程技术结合的产物，也是造福人类的新一代药物生产方法。
不仅在治疗糖尿病方面的作用突出，同时对治疗癌症等严重影响人类健康的疾病的治疗开创了思路。
所以，作为本科生的生物技术专业制药方向的大学生来说，这种利用基因工程，发酵工程等方法工业制备胰岛素的原理和流程的工艺，和这种开拓创新的思维是我们必须要了解和学习得。
1重组人工胰岛素的生产原理通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
人胰岛素的制备
人胰岛素的制备一、获得目的基因从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。
即得到了目的基因。
反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1, 细胞总RNA的提取:取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。
2 ，从总RNA中分离mRNA：取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。
70℃水浴（裂解RNA的二级结构），20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。
将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。
（二）mRNA转录合成cDNA第一链cone 第一链的合成加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、dNTP （加入放射性同位素利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。
取出置于冰上。
电泳分析，同位素活性测定。
（三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链。
PCR法的操作步骤：预变性引物退火引物延伸循环25-35次最后延伸前端引物：✧5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt caccac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’✧后端引物：✧5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’二、组建重组质粒采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。
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人胰岛素的制备一、获得目的基因从供体细胞中提取mRNA,以其为模板,在反转录酶的作用下,反转录合成胰岛素mRＮA互补DNA，再以cDＮＡ第一链为模板，在反转录酶或ＤNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链ＤNA序列.即得到了目的基因....文档交流仅供参考...反转录－聚合酶链反应法（一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA1, 细胞总RＮA的提取：取胰岛B细胞，用ＰBS洗后，加入TRIZOＬ试将细胞破裂，后用DＥPC处理,多次离心后,取RNA白色沉淀，测OＤ值，电泳。
...文档交流仅供参考...2 ，从总RＮA中分离mRNA:取上述提取的总ＲＮA若干,加入Buffer ＯBB ，Oliｇotｅx Ｓｕspensｉon ，打匀。
70℃水浴(裂解RNＡ的二级结构), ２0-３0℃条件下,静置（让Olｉgotex与mRNＡ结合). 将Oｌｉｇoｔｅx/ｍRＮA复合物的沉淀加到EP管SPＩN柱上高速离心，加Ｂuffeｒ将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。
...文档交流仅供参考...(二)mRＮA转录合成cＤNA第一链ｃone 第一链的合成加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中,加入RＮａse—ｆree watｅr,混匀后,70℃反应１0分钟，反应完成后，立刻将反应体系置于冰上５ｍin；稍微离心一下，顺序加入缓冲液、ＲNＡ酶抑制剂、反转录酶、dNTP（加入放射性同位素利于检验），混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置２分钟。
取出置于冰上.电泳分析，同位素活性测定。
...文档交流仅供参考...（三）PＣR法扩增,特异合成目的ｃDNA链通过胰岛素的特异引物，用PCＲ法进行扩增,特异的合成胰岛素的cDNA链。
ＰCＲ法的操作步骤:预变性引物退火引物延伸循环25—３5次最后延伸✧前端引物：✧5’—ｇgｔ tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtcｃcｃｃgｃggt agt caｃ cac cac ｃac caｃcaｃｃｇt ttt ｇtｇａac caａ caｃｃtｇｔgc ｇgc-3'...文档交流仅供参考...✧后端引物：✧5’-ａgt ｇtc gac ttａgｔt ｇca gtａｇtt ctc cａg ｃtｇ gta-3’...文档交流仅供参考...二、组建重组质粒采用pQE—-30质粒作为载体,用双酶切法进行基因重组。
1.双酶切法用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DＮA和外源D ＮA片段,使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端,将它们混合,在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子,从而实现ＤNA的定向连接。
...文档交流仅供参考...２.重组过程pQE-—３0用Hind Ⅲ和ＢａmHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。
外源ＤNA片段同样也用H ｉnd Ⅲ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。
双酶切后的载体外源DNA片段混合退火,因为Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外源DＮＡ片段的自身连接，外源ＤNA片段只能定向地连接到载体的Hiｎd Ⅲ和BaｍHⅠ位点之间。
当然也不可避免发生载体的Ｈｉnd Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环,转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化....文档交流仅供参考...三、构建基因工程菌(一)重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链同时表达法将人胰岛素的Ａ链和Ｂ链编码序列拼接在一起,然后组装在大肠杆菌－半乳糖苷酶基因的下游.重组子表达出的融合蛋白经CNBr处理后，分离纯化Ａ－B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得Ａ链和B链肽段,最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。
重组ＤＮA的转化...文档交流仅供参考...1, CaＣl2法制备大肠杆菌感受态细胞:取1００ｍl 菌体培养至OD60０ = 0.5，离心收集菌体,用１0 ml 冰冷的1０ｍM ＣａCｌ2溶液悬浮菌体,离心,收集菌体,用１ml 冰冷的7５ mM CaCl2溶液悬浮菌体 ,冰浴放置1２ - 24小时，备用。
...文档交流仅供参考...2,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取1０0 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组，DNA连接液，混匀。
冰浴放置半小时。
在42 ℃保温２分钟(热脉冲）,快速将转化细胞转移至冰浴中放置１– 2 分钟 .加入1 ｍl 新鲜培养基，于37 ℃培养 1 小时（扩增）.涂在合适的固体培养基平板上进行筛选....文档交流仅供参考...经典的CａCl２转化方法：a将培养液转入离心管中，冰上放置1０分钟，然后于4℃下３00０g离心10分钟。
b 弃去上清，用预冷的0。
05mol/L的CaCl２溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置１5-３0分钟后，4℃下３000ｇ离心10分钟. ﻫc弃去上清,加入４mｌ预冷含1５％甘油的0.０５ｍol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
ﻫ d 感受态细胞分装成２00μl的小份, 贮存于—70℃。
...文档交流仅供参考...ｅ从-70℃冰箱中取200μｌ感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上.ﻫ f 加入pBS质粒ＤNA溶液（含量不超过5０ng，体积不超过10μl）,轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。
g４2℃水浴中热击９０秒或３7℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3－5分钟.h向管中加入1ml LB液体培养基(不含Aｍp），混匀后3７℃振荡培养１小时，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampｒ ). ﻫｉ将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Ａmp的筛选平板上,正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16—24小时。
...文档交流仅供参考...（二）重组子的筛选和鉴定（载体遗传标记检测)１．初筛选随机挑取转化单菌落，在LB/AK培养基（含1００p g ／ｍl氨苄青霉素和50ug／ml卡那霉素)中进行培养,用O。
５ｍｍol/LIPTＧ诱导表达。
...文档交流仅供参考...表达情况用16．5％SDS。
PAGE进行分析。
２.重组菌的后续鉴定直接电泳检测法将初筛选获得的重组菌扩大培养后，提取其质粒DNＡ,通过ＰＣR对其进行扩增,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大，用电泳法检测质粒是否为重组质粒。
...文档交流仅供参考...目的蛋白表达检验所得菌体经溶菌酶／超声破碎细胞后得到的包涵体进行ＳDS—ＰAGE分析，所需基因工程菌表达的外源蛋(Hｉs）6·Arg-Aｒｇ－人胰岛素原以包涵体形式存在，其分子大小约为13ｋb,经电泳与胰岛素原ｍaｒｋer对比,如条带显示有所需目的蛋白,则所得菌既可做工程菌使用，经扩大培养后，斜面保存以便后续使用。
...文档交流仅供参考...3。
工程菌的保藏１5%甘油保存菌种，菌液=２０:80，，充分混匀后，-70度保藏。
四、培养工程菌优化发酵条件采用比浊法测定不同时间培养基中菌量,绘制基因工程菌的生长曲线,在摇瓶培养的水平下，采用优化的发酵培养基发酵基因工菌,培养4小时候即进入对数生长期，而且对数生长期可延长至17小时。
...文档交流仅供参考...1，正交优化实验：采用正交法，选取摇瓶培养条件中七个主要因素进行两水平正交优化,该七个因素为：种子活化方式，摇床转速（通风量），IPTG诱导温度,接种量，IPＴG添加量，诱导时间,补料方式。
分别用A、B、C、Ｄ、E、F、G表示.以每升培养基收获湿菌体的量及发酵液的A600为目标量,考察条件优化的效果,进行八次实验，对实验结果进行分析,优化出最佳实验条件。
...文档交流仅供参考...２,其他条件优化:在优化发酵条件的基础上,进一步就各种金属元素对苗体生长发重组蛋白诱导的影响作了分析。
3,放大培养（比较不同发酵工艺产量）:在优化摇瓶水平发酵试验的基础上，放大至1 L培养基中比较两种发酵工艺。
在不同转速,通气量，ｐH条件下,比较选择产量最高的发酵工艺。
五、产物分离纯化由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的,所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。
基因工程药物的分离纯化一般不应超过4—5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工....文档交流仅供参考...发酵液进行细胞分离,分别得到胞内产物和胞外产物。
胞外产物直接进行透析浓缩然后进行再复性及酶转化，再对产物进行高度纯化,最后制剂即可.胞内产物用溶酶菌或超声波将细胞破碎，细胞破碎后用高速离心法进行固液分离.分离后用变性剂或者离子去污剂得到包含体,再用变性剂(尿素）使其变形，接着用二次复性法将其复性。
对复性后的产物进行透析浓缩,然后进行再复性及酶转化，再对产物进行高度纯化,最后制剂即可....文档交流仅供参考...重组蛋白分离纯化的特点重组蛋白质分离纯化的特点为:(1）大多数重组蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活a（2)重组蛋白质产品在物料中含量很低,凰物料组成非常复杂。
例如,利用基因工襁菌发酵生产蛋白藤,物料中含有大量缀成复杂的培养基、荣体生产代谢物等，疆拣蛋鑫囊魏含量嚣豢不瑟蛋鑫凄慈爨鹃１%。
舂些嚣拣鬣囊矮存在予缀懿武或在胞内形成包含体，为获敬蛋白质,还需避行细脆破碎，结鬈物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。
(3)含蛋白质产晶的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋自水解酶降解。
(4)很多熏组蛋白质产品作为医药、食品被人炎利用,因而要求蛋国艨产器必绥是裹癀缝铯瓣，产蘸无萤、兹致热源等。
与传统麓生物大分子分离方式楣镄,蘩缀蛋臼的分离纯纯恣憝秘用其携理稻化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、祭疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
...文档交流仅供参考...二次复性法:０．5g包涵体溶解于一定量的缓冲液Ｂ（50mｍo ｌ／LGlｙ—NａOH,8 ｍoｌ/L尿素，Ｂ_巯基乙醇，pH 9．5）中,使之充分混悬，静置1小时以上。
混悬液分步逐滴加入到缓冲液C（５０ｍｍoｌ/ＬGlｙ—NａOＨ，半胱氨酸一胱氨酸，pH 9。
５)中，4℃静置复性过夜。
上样于已用５０mｍol/ＬGｌy-NaOＨ(pH 9．5）平衡的DEAE-Sepｈaｒose ＦＦ柱，用0。
１mol／Ｌ的氯化钠梯度洗脱，通过ＳDS-PAGＥ确定ＲＲｈPＩ位置，用DEAE-Sｅphａrose ＦF做离子交换层析,收集含ＲＲhPI 的洗脱峰2，层析图谱见（图6）。
电泳检测显示(图11)峰２主要为RRhPＩ,及少量高分子杂质，收集峰2做再复性.峰１为pH高于９．５及一些疏水性蛋白质形成的穿透峰,绝大部分pH低于ＲRhPI的蛋白质和核酸类杂质则牢固地结合在柱子上,在较高盐浓度及2mol／L NaCl的条件下被洗脱下来，形成其他峰3和峰4。