重组人胰岛素的制备流程
人胰岛素的制备
⼈胰岛素的制备⼈胰岛素得制备⼀、获得⽬得基因从供体细胞中提取mRNA,以其为模板,在反转录酶得作⽤下,反转录合成胰岛素mRNA互补DNA,再以cDNA第⼀链为模板,在反转录酶或DNA聚合酶I得作⽤在,最终合成编码它得双链DNA序列。
即得到了⽬得基因。
反转录-聚合酶链反应法(⼀)从⼈体细胞内提取胰岛素基因转录得mRNA1, 细胞总RNA得提取 :取胰岛B细胞,⽤PBS洗后,加⼊TRIZOL试将细胞破裂,后⽤DEPC处理,多次离⼼后,取RNA⽩⾊沉淀,测OD值,电泳。
2 ,从总RNA中分离mRNA:取上述提取得总RNA若⼲,加⼊Buffer OBB ,Oligotex Suspension ,打匀。
70℃⽔浴(裂解RNA得⼆级结构), 20-30℃条件下,静置(让Oligotex与mRNA结合)。
将Oligotex/mRNA复合物得沉淀加到EP管SPIN柱上⾼速离⼼,加Buffer 将其她RNA洗脱,最后⽤琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。
(⼆)mRNA转录合成cDNA第⼀链cone 第⼀链得合成加⼊上步获得得mRNA与适当引物于EP管中,加⼊RNase-free water,混匀后,70℃反应10分钟,反应完成后,⽴刻将反应体系置于冰上5min;稍微离⼼⼀下,顺序加⼊缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP(加⼊放射性同位素利于检验), 混匀,稍微离⼼反应物之后,42℃放置2分钟。
取出置于冰上。
电泳分析,同位素活性测定。
(三)PCR法扩增,特异合成⽬得cDNA链通过胰岛素得特异引物,⽤PCR法进⾏扩增,特异得合成胰岛素得cDNA 链。
PCR法得操作步骤:预变性引物退⽕引物延伸循环25-35次最后延伸前端引物:5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac caccac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’后端引物:5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’⼆、组建重组质粒采⽤pQE--30质粒作为载体,⽤双酶切法进⾏基因重组。
重组人胰岛素和重和生长激素的生产工艺
由于结构和性质的差异，胰岛素和生长激素的分离纯化过程有所不同，
涉及的步骤和技术也有所区别。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
要点一
酵母表达系统
要点二
低成本、高产出
酵母作为宿主细胞具有高表达、易培养、易发酵等优点， 有助于提高胰岛素的生产效率。
通过大规模发酵和分离纯化，可以实现低成本、高产出， 降低治疗费用。
使用哺乳动物细胞作为宿主细胞，能够实现更接近人体 生理状态的糖基化过程，提高生长激素的生物活性。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
更接近人体天然结构
哺乳动物细胞表达的生长激素更接近 人体天然结构，降低了免疫排斥的风 险。
临床效果更佳
由于结构和性质的优化，重组人生长 激素在治疗某些疾病方面具有更好的 临床效果。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的异同点
01 02
原料与培养基
胰岛素生产主要使用酵母作为宿主细胞，而生长激素则更倾向于使用哺 乳动物细胞作为宿主。此外，培养基的成分也有所不同，以满足不同细 胞的需求。
蛋白质修饰
胰岛素和生长激素在蛋白质修饰方面存在差异，以适应其特定的生理功 能和药理作用。
03
分离纯化过程
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的优缺点分析
生产成本高
哺乳动物细胞培养成本较高，导致生长激素的生产成本增加。
生产周期长
哺乳动物细胞生长缓慢，培养周期长，影响了生产效率。
潜在的病毒污染风险
虽然采用了各种病毒消除技术，但仍存在病毒污染的风险。
重组人胰岛素和重和生长激素生产工艺的发展趋势与展望
基因编辑技术应用
通过控制培养条件，如温度、pH、营养物 质等，优化细胞代谢，提高目标蛋白质的产 量。
重组人胰岛素制备工艺
重组人胰岛素制备工艺引言胰岛素是一种由胰腺β细胞分泌的激素，它参与调节葡萄糖代谢，维持血糖水平稳定。
然而，对于许多糖尿病患者，体内胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗使得血糖控制成为难题。
为了解决这一问题，重组人胰岛素制备工艺应运而生。
本文将详细介绍重组人胰岛素的制备工艺，以及如何通过优化制备工艺提高其产量和质量。
关键词介绍1、重组人胰岛素：是指利用基因工程技术，通过细胞培养或微生物发酵生产的胰岛素。
它具有与天然人胰岛素相同的结构和功能，因此在临床上有广泛的应用。
2、制备：是指通过一系列工艺步骤，从原料中提取或制造出所需物质的过程。
在重组人胰岛素制备中，主要包括基因工程操作、细胞培养、发酵、分离和精制等步骤。
3、工艺：是指实现制备过程的一系列具体方法和操作规程。
工艺的选择和优化直接影响到产品的产量和质量。
重组人胰岛素制备工艺1、酵母菌的筛选：选用适合生产重组人胰岛素的酵母菌种，对其进行筛选和改良，以提高发酵过程中的产量。
2、基因工程操作：将人胰岛素基因插入到酵母菌的染色体或质粒中，确保基因正确表达。
3、发酵：在适宜的营养条件下，利用筛选得到的酵母菌进行发酵生产。
4、分离和精制：通过一系列物理、化学和生物学方法，将重组人胰岛素从发酵液中分离出来，并进行精制和纯化，以得到高纯度的产品。
制备工艺优化1、通过现代实验设计方法和技术，如响应面法和均匀设计法，筛选最佳工艺条件，以提高重组人胰岛素的产量和质量。
2、通过基因工程技术改良酵母菌，增强其生产重组人胰岛素的能力，提高产量。
3、采用先进的分离和精制技术，如高效液相色谱和超滤膜过滤等，进一步提纯产品，提高产品质量。
4、结合计算机模拟技术和实验验证，模拟工艺过程，指导实际生产，优化制备工艺。
重组人胰岛素制备工艺在糖尿病治疗中具有重要意义，本文详细介绍了其制备过程及优化方法。
通过合理选择工艺条件和基因工程改良，可以有效提高重组人胰岛素的产量和质量。
随着科学技术的发展，相信未来制备工艺将进一步优化，为糖尿病患者提供更好的治疗选择。
利用重组酵母菌生产人胰岛素
利用重组酵母菌生产人胰岛素摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。
其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子，采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。
将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株，经过营养筛选和PCR 复筛，得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。
后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分批发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素。
纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。
关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定Using recombinant yeast to produce human insulinHuSheng 1142043040Abstract：The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as follow:get purpose gene→c onstruct the recombinant plasmid→construct the genetic engineering bacteria→fermentation of e ngineering bacterium→separation and purification of the product→identification of the product. The front three processes is building engineering bacteria of human insulin yeasts . Insulin gene was synthesized according to the amino acid sequence of human insulin and yeast preferential codons. The insulin gene was cloned in to pPIC9 vector and expression vector pPINS319 was constructed. The expression vector was digested with BgllI and then used to transform Pichia Pastoris GSll5 by electroporation. The expression analysis showed that the insulin gene w s able to expressed efficiently in Pichia Pastoris. The posterior three processes is large-scale production by fermentation.Through fed - batch fermentation getting fermentation liquor, separation and purification the fermentation liquor getting human insulin.The final products purified by supedrex 75showed one band by SDS-PAGE analysis and were identical with the native human insulin by all critetia employed.(SDS-PAGE analysis,amin acid composition analysis and bioidentity assay) Keywords：recombinant yeast;human insulin; fermentation;purification;identification 胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。
胰岛素工艺流程说明
重组人胰岛素生产工艺流程功能间分布
工序
功能间名称
主要操作
菌种
菌种室
菌种储藏
培养基准备间
培养基配制、消毒、无菌服消毒
接种室
在超净工作台中进行无菌接种，菌种并瓶
扩培室
菌种的摇瓶培养
菌种洗衣
菌种区无菌服清洗
发酵
发酵室
种子培养、发酵培养
控制室
发酵过程控制
发酵配料室
重组人胰岛素产品生产工艺流程
对从菌种库中取出的菌种进行活化及初步扩大培养
在种子罐中对菌种进行进一步的扩大培养，至菌种到对数生长期
时转入发酵罐培养பைடு நூலகம்
分两阶段进行控制，第一阶段主要通过控制溶氧和补加甘油使菌
体达到富集的目的，第二阶段通过补加甲醇使菌体进行高密度表
达目的产物，HPLC检测目的产物含量
目的产物存在于发酵液上清中，此步骤主要控制目的产物收率
成品精纯化
精纯配液室
精纯化区配液
冷室
结晶产物低温静置
精纯化区
胰岛素成品精制、结晶
制备控制
制备色谱柱电脑控制
过滤冻干
过滤冻干室
成品无菌过滤、结晶水洗以及冻干
通过两步柱层析，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白
利用紫外检测仪控制目的产物收率，主要试剂为乙醇与异丙醇
调节PH值，使P1沉淀，再经离心干燥，得中间体I固体
控温进行转肽反应，主要试剂为DMSO与1,4-丁二醇
再通过柱层析进行提纯，主要试剂为异丙醇
调节PH值，使P2沉淀，再经离心干燥，得中间体II固体
发酵配料
固液分离
过滤室
发酵液过滤分离
人胰岛素的制备生物技术制药
发酵液
胞内产物
细胞破碎 固液分离
细胞分离
溶菌酶／超声破碎细胞 高速离心
包含体 变性 复性
洗涤 变性剂&离子 型去污剂
细胞碎片分离
变性
变性剂（尿素）
复性 二次复性法
胞外产物
透析浓缩
再复性及酶转化
高度纯化 制剂
15
二次复性法：0．5g包涵体溶解于一定量的缓冲液B(50mmol／L Gly—NaOH，8 mol／L尿素，B_巯基乙醇，pH 9．5)中，使之充分混悬， 静置1小时以上。混悬液分步逐滴加入到缓冲液C(50mmol／LGly-NaOH， 半胱氨酸一胱氨酸，pH 9．5)中，4℃静置复性过夜。上样于已用50mmol／L Gly—NaOH(pH 9．5)平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用0．1mol／L 的氯化钠梯度洗脱，通过SDS-PAGE确定RRhPI位置，用DEAE-Sepharose FF做离子交 换层析，收集含RRhPI的洗脱峰2，层析图谱见（图6）。电泳检测显示(图11)峰2 主要为RRhPI，及少量高分子杂质，收集峰2做再复性。峰1为pH高于9．5及一些疏 水性蛋白质形成的穿透峰，绝大部分pH低于RRhPI的蛋白质和核酸类杂质则牢固 地结合在柱子上，在较高盐浓度及2mol／L NaCl的条件下被洗脱下来，形成其他 峰3和峰4。
4
（二）mRNA转录合成cDNA第一链
cDNA 第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-
free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应 体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑 制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检 验）， 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置 于冰上。电泳分析，同位素活性测定。
基因重组技术生产胰岛素
基因重组技术生产胰岛素介绍胰岛素是一种由胰岛细胞分泌的蛋白质激素，它在调节血糖水平中起着重要的作用。
胰岛素的生产曾经面临着供应不足的挑战，然而通过基因重组技术，科学家们成功地生产了大量的胰岛素，从而满足了临床需求。
本文将介绍基因重组技术生产胰岛素的过程和意义。
胰岛素的生产过程对基因重组技术生产胰岛素的理解首先需要了解传统的生产过程。
传统方法中，胰岛素是从猪和牛的胰腺中提取得到的。
这种方法存在着供应不稳定、产品纯度不高以及与人体胰岛素之间存在差异等问题。
而基因重组技术生产胰岛素则是通过将人类胰岛素基因导入到大肠杆菌等微生物中进行生产。
下面是具体的步骤：1.获得胰岛素基因：从人类胰岛细胞中获得胰岛素基因的DNA序列。
2.构建基因重组载体：将胰岛素基因插入到合适的基因重组载体中，如质粒或病毒。
3.转导宿主细胞：将构建好的基因重组载体导入到宿主细胞中，如大肠杆菌。
4.培养和表达：在适当的培养条件下，促使宿主细胞进行复制和转录，从而表达胰岛素基因并产生胰岛素蛋白质。
5.纯化和提取：通过分离和纯化的步骤，得到纯度较高的胰岛素。
基因重组技术的意义基因重组技术生产胰岛素具有许多优势和意义：1.提供稳定供应：通过基因重组技术生产的胰岛素能够提供更加稳定的供应，解决了传统生产方法中供应不足的问题。
2.提高纯度：基因重组技术可以实现胰岛素的高纯度生产，减少了杂质的存在，从而提高了产品质量。
3.与人体胰岛素相似：基因重组技术生产的胰岛素与人体胰岛素在结构和功能上更为接近，减少了在使用过程中出现的副作用和风险。
4.降低成本：基因重组技术可以实现胰岛素的大规模生产，从而降低了生产成本和售价，使胰岛素更加可负担。
应用领域和前景基因重组技术生产的胰岛素在医药领域有着广泛的应用。
主要包括：1.糖尿病治疗：胰岛素是糖尿病治疗中必不可少的药物，通过基因重组技术生产的胰岛素可以满足糖尿病患者的需求。
2.研究工具：基因重组技术生产的胰岛素可以作为研究工具，用于研究胰岛素的生物学功能以及与糖尿病等疾病的关系。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
参考内容
引言
人胰岛素是一种重要的生物药物，对于治疗糖尿病具有显著效果。传统上，人 胰岛素的生产主要通过从人身体中提取胰岛素原，然后进行化学合成和结构改 造。然而，这种方法不仅成本高昂，而且生产周期长，难以满足市场需求。近 年来，随着生物技术的发展，利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法逐渐得到 广泛应用。本次演示将详细介绍利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法和相关 技术。
展望未来，基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究有望为糖尿病治疗 提供更加安全、有效的药物。随着科学技术的不断进步和研究的深入，我们相 信未来能够在提高产量、降低成本、优化质量等方面取得更大的突破。加强与 其他领域（如纳米技术、生物信息学等）的跨学科合作，将为该领域的研究和 应用提供更为广阔的前景。
生产流程
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的生产流程包括以下几个步骤：
1、细胞悬浮：将大肠杆菌接种到发酵罐中的无菌培养基中，在适宜的温度和 湿度条件下进行培养。培养过程中需监测细菌生长情况，以确保细菌处于最佳 生长状态。
2、发酵：当细菌生长到一定密度时，向发酵罐中加入适量的诱导剂，以诱导 细菌表达人胰岛素基因。发酵过程中需控制温度、湿度、氧气浓度等参数，以 确保细菌正常表达胰岛素基因。
一、背景介绍
基因工程技术是一种利用微生物或细胞体系生产人类所需蛋白质的技术。在过 去几十年中，基因工程技术得到了广泛应用，并在制药、生物能源、环境保护 等领域发挥了重要作用。重组人胰岛素是一种利用基因工程技术生产的胰岛素， 它与人体产生的胰岛素具有相似的结构和功能。然而，重组人胰岛素的生产过 程比较复杂，需要经过多个步骤，因此生产成本较高。
3、收集：发酵结束后，收集细菌培养液并进行过滤，以去除其中的杂质和细 胞残骸。
胰岛素工艺流程说明
重组人胰岛素生产工艺流程功能间分布
工序
功能间名称
主要操作
菌种
菌种室
菌种储藏
培养基准备间
培养基配制、消毒、无菌服消毒
接种室
在超净工作台中进行无菌接种，菌种并瓶
扩培室
菌种的摇瓶培养
菌种洗衣
菌种区无菌服清洗
发酵
发酵室
种子培养、发酵培养
控制室
发酵过程控制
发酵配料室
成品精纯化
精纯配液室
精纯化区配液
冷室
结晶产物低温静置
精纯化区
胰岛素成品精制、结晶
制备控制
制备色谱柱电脑控制
过滤冻干
过滤冻干室
成品无菌过滤、结晶水洗以及冻干
通过两步柱层析，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白
利用紫外检测仪控制目的产物收率，主要试剂为乙醇与异丙醇
调节PH值，使P1沉淀，再经离心干燥，得中间体I固体
控温进行转肽反应，主要试剂为DMSO与1,4-丁二醇
再通过柱层析进行提纯，主要试剂为异丙醇
调节PH值，使P2沉淀，再经离心干燥，得中间体II固体
1重组人胰岛素产品生产工艺流程对从菌种库中取出的菌种进行活化及初步扩大培养在种子罐中对菌种进行进一步的扩大培养至菌种到对数生长期时转入发酵罐培养分两阶段进行控制第一阶段主要通过控制溶氧和补加甘油使菌体达到富集的目的第二阶段通过补加甲醇使菌体进行高密度表达目的产物hplc检测目的产物含量目的产物存在于发酵液上清中此步骤主要控制目的产物收率通过两步柱层析分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白利用紫外检测仪控制目的产物收率主要试剂为乙醇与异丙醇调节ph值使p1沉淀再经离心干燥得中间体i固体控温进行转肽反应主要试剂为dmso与14丁二醇再通过柱层析进行提纯主要试剂为异丙醇调节ph值使p2沉淀再经离心干燥得中间体ii固体通过控制湿度与温度进行脱帽反应得到终产物胰岛素主要试剂为丙酮产品为半固体经过两步柱层析对胰岛素进行提纯试剂为trishcl和异丙醇通过超滤对提纯后的胰岛素进行浓缩通过管道传递到下工序通过制备色谱对胰岛素粗品进行精制主要试剂为色谱乙腈然后经两步结晶后通过管道过滤除菌到百级区对胰岛素成品进行一次结晶和水洗对水洗后的胰岛素进行过滤除菌后冻干即得胰岛素成品菌种扩培种子罐培养发酵罐培养发酵液固液分离p1纯化p1沉淀干燥p2纯化p2沉淀干燥脱帽成品粗纯化过滤冻干成品精纯化2重组人胰岛素生产工艺流程功能间分布功能间名称菌种室培养基准备间接种室扩培室菌种洗衣发酵室控制室发酵配料室过滤室洗衣洗滤布间p1纯化区沉淀干燥室ip2纯化沉淀干燥室ii脱帽室粗纯配液室粗纯化区清洗室精纯配液室冷室精纯化区制备控制过滤冻干室工序主要操作菌种储藏菌种培养基配制消毒无菌服消毒在超净工作台中进行无菌接种菌种并瓶菌种的摇瓶培养菌种区无菌服清洗种子培养发酵培养发酵过程控制发酵配料发酵液过滤分离滤布清洗中间体i柱纯化中间体i沉淀干燥转肽操作中间体ii柱纯化中间体ii沉淀干燥脱帽操作p1p2粗纯化配液成品粗纯化柱纯化超滤p1p2粗纯化区玻璃仪器及工具清洗精纯化区配液结晶产物低温静置胰岛素成品精制结晶制备色谱柱电脑控制成品无菌过滤结晶水洗以及冻干发酵固液分离中间体i中间体ii成品粗纯化成品精纯化过滤冻干
重组人胰岛素的制备及生物学特性分析
重组人胰岛素的制备及生物学特性分析随着现代生物技术的发展，重组蛋白的制备技术越来越成熟，其中重组人胰岛素是一种应用非常广泛的重组蛋白。
本文将从重组人胰岛素的制备流程和生物学特性两个方面来探讨这一主题。
一、重组人胰岛素的制备流程1. 基因克隆重组人胰岛素的制备首先需要进行基因克隆。
胰岛素基因序列已经被多次确定，是由A链和B链两个多肽链组成的，其中A链由21个氨基酸组成，B链由30个氨基酸组成。
这两条基因在人的胰岛β细胞中均被表达，然后通过转录和翻译合成成分别为84个和30个氨基酸残基的前蛋白，再经由胰岛细胞内的酶的加工而形成两肽链胰岛素。
由于A链和B链之间存在两个二硫键，因此在基因克隆时需要将这两条基因串联起来并插入到适当的宿主细胞中。
2. 宿主细胞的选取重组人胰岛素的制备过程需要选择合适的宿主细胞。
常用的宿主细胞有大肠杆菌、腺病毒、哺乳动物细胞等。
制备过程中需要考虑到宿主细胞的易培养性、表达效率、翻译后修饰等因素。
3. 表达和纯化构建好质粒并选择好宿主细胞后，就需要使用适当的诱导剂刺激宿主细胞对胰岛素基因进行表达，接着进行纯化、离子交换和高效液相等步骤进行胰岛素的分离纯化。
这一部分的操作涉及到分子生物学、蛋白质化学等多个学科领域。
二、重组人胰岛素的生物学特性1. 作用机制胰岛素是一种影响葡萄糖代谢的激素，它可以促进葡萄糖进入细胞内以供能量消耗。
若胰岛素水平下降，会导致高血糖，甚至糖尿病等疾病的出现。
重组人胰岛素在体内能够发挥与天然胰岛素完全相同的作用，并且不会引发免疫反应，是治疗糖尿病等疾病的重要药物。
2. 生物学性质对于重组人胰岛素的生物学性质需要进行全面、客观的评价。
首先，作为一种重组蛋白，重组人胰岛素在体内不会引起免疫反应，因此可以安全应用于糖尿病等疾病的治疗；其次，重组人胰岛素的药效作用与天然胰岛素完全相同，可以达到相同的降血糖效果；此外，重组人胰岛素的半衰期较短，需要分次注射才能保持足够的药效。
重组人胰岛素工业生产流程
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大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺
1.提取目的基因:既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离.2.提取质粒:使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.3.基因重组:取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒.4.将质粒送回大肠杆菌:再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.5.胰岛素的产生:再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。
一、基础知识【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。
2．（记忆）DNA的溶解性特点：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。
【思考1】据图5－1分析：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L时溶解度最小；要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解；要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L可使DNA析出。
【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。
3．（记忆）DNA的耐受性特点：蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。
洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。
4．（记忆）DNA的鉴定原理当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。
重组人胰岛素原料药生产实验报告
重组人胰岛素原料药生产实验报告一、引言胰岛素是一种重要的药物，用于治疗糖尿病等疾病。
重组人胰岛素是指通过基因工程技术生产的胰岛素，与传统的动物源性胰岛素相比，具有更高的纯度和更好的效果。
本报告旨在介绍重组人胰岛素原料药生产实验的过程和结果。
二、实验设计1. 实验目的本实验旨在通过大肠杆菌表达系统生产重组人胰岛素原料药，并对其进行纯化和鉴定。
2. 实验步骤（1）构建表达载体：将人胰岛素基因插入大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中。
（2）转化大肠杆菌：将表达载体导入大肠杆菌中，使其能够表达人胰岛素基因。
（3）培养大肠杆菌：在LB培养基中进行培养，使其能够表达出人胰岛素。
（4）收集细菌：将细菌离心收集，并用冷冻离心法裂解细胞获得包含目标蛋白的上清液。
（5）纯化目标蛋白：通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对上清液进行纯化。
（6）鉴定目标蛋白：通过SDS-PAGE电泳、Western blot等方法对纯化后的目标蛋白进行鉴定。
三、实验结果1. 表达载体构建将人胰岛素基因插入pET-28a(+)表达载体中，经PCR扩增和酶切，得到正确的表达载体。
2. 转化大肠杆菌将表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中，利用热激法转化。
经PCR检测和测序验证，转化效率较高。
3. 大肠杆菌培养在LB培养基中进行培养，经过16小时的培养后，细菌进入对数生长期。
经过4小时的诱导，大肠杆菌开始表达人胰岛素基因。
4. 目标蛋白纯化通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对上清液进行纯化。
最终得到了高纯度的重组人胰岛素原料药。
5. 目标蛋白鉴定通过SDS-PAGE电泳、Western blot等方法对纯化后的目标蛋白进行鉴定。
结果表明，纯化后的目标蛋白具有正确的分子量和免疫反应性。
四、实验讨论本实验通过大肠杆菌表达系统成功生产了重组人胰岛素原料药，并对其进行了纯化和鉴定。
其中，表达载体构建和大肠杆菌转化是实验的关键步骤，需要严格控制条件以确保表达效率和转化效率。
重组人胰岛素生产工艺
手术和应激状态：在手术或应激状态下，重组人 胰岛素可以作为葡萄糖代谢调节剂，维持血糖稳 定
重组人胰岛素生产工艺流程
第三章
基因工程菌培养
基因工程菌的选 择与构建
培养基的配制与 灭菌
基因工程菌的培 养条件与过程
培养过程中的注 意事项与质量控 制
基因工程菌发酵
基因工程菌的选择与构建
基因工程菌的培养条件
重组人胰岛素生产工艺中的 关键技术
第四章
基因工程菌的选择和培养条件优化
基因工程菌的选择：选择具有高表达量、稳定性和适应性的工程菌株
培养条件优化：通过控制培养基成分、温度、pH、溶氧等条件，提高工程菌的生长和表 达水平
发酵过程监控：实时监测工程菌的生长和表达情况，及时调整培养条件
分离纯化技术：采用高效液相色谱、凝胶过滤等方法对重组人胰岛素进行分离纯化，确 保产品质量
质量控制和 监管：加强 质量控制和 监管，确保 重组人胰岛 素的安全性 和有效性
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汇报人：
重组人胰岛素的应用
糖尿病治疗：重组人胰岛素是治疗糖尿病的主要 药物之一，可以降低血糖，改善糖尿病症状
胰岛素缺乏症治疗：对于胰岛素分泌不足的糖尿 病患者，重组人胰岛素可以替代体症如 酮症酸中毒和高渗性非酮症性昏迷的治疗 中，重组人胰岛素可以降低血糖，纠正代 谢紊乱
变质。
原材料使用：按 照规定的投料量 和使用方法进行 操作，确保原材 料在生产过程中 得到充分利用， 同时避免浪费和
污染。
生产过程的质量控制
原料质量控制：对原料进行严格筛选和检测，确保符合质量标准 生产过程监控：对生产过程中的关键步骤进行严格监控，确保产品质量 稳定 成品检验：对成品进行严格检验，确保符合质量标准
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重组人胰岛素的制备流程
胰岛素是一种重要的蛋白质激素，对于调节血糖水平起着至关重要的作用。
重组人胰岛素是通过基因工程技术制备的人工合成胰岛素，它与人体自然产生的胰岛素具有相同的结构和生物活性。
下面将介绍一种常用的重组人胰岛素制备流程。
制备重组人胰岛素的第一步是获得胰岛素基因的DNA序列。
这可以通过两种途径来实现。
一种是从人体中分离出胰岛细胞，然后提取其中的RNA，通过逆转录酶将RNA转录成DNA，从而获得胰岛素基因的DNA序列。
另一种方法是从人体细胞库中筛选出含有胰岛素基因的细胞，然后从这些细胞中提取DNA。
这两种方法都需要进行PCR扩增，以增加目标基因的数量。
接下来，将获得的胰岛素基因插入到表达载体中。
表达载体是一种能够在细胞中稳定复制的DNA分子，它可以携带外源基因并使其在细胞中表达。
常用的表达载体有质粒和病毒。
将胰岛素基因与表达载体进行连接，形成重组胰岛素基因载体。
然后，将重组胰岛素基因载体导入到宿主细胞中。
常用的宿主细胞有大肠杆菌和酵母等。
将重组胰岛素基因载体转化到宿主细胞中后，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组胰岛素基因在细胞内得以表达。
接着，利用细胞培养技术进行大规模的培养和表达。
将转化了重组胰岛素基因的宿主细胞培养在培养基中，通过控制培养条件和添加适当的诱导剂，促使细胞大量表达重组胰岛素。
培养时间一般为数天至数周，取决于细胞的生长速度和表达量。
在细胞培养过程中，重组胰岛素会以包括细胞内溶胞液和培养基在内的形式存在。
为了提取和纯化重组胰岛素，需要经过细胞破碎、离心、过滤等步骤，以去除细胞碎片和其他杂质。
然后，通过离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等技术，对重组胰岛素进行纯化。
对纯化后的重组胰岛素进行结构和活性的分析。
利用质谱、核磁共振等技术，确定重组胰岛素的分子质量和结构特征。
同时，通过生物活性测定，验证重组胰岛素与天然胰岛素的功能等效性。
重组人胰岛素的制备流程主要包括获得胰岛素基因序列、构建重组胰岛素基因载体、转化宿主细胞、大规模培养和表达、纯化和结构活性分析等步骤。
这一制备流程能够有效地获得高纯度和高生物活性的重组人胰岛素，为临床治疗糖尿病等疾病提供了重要的药物。