医学外显子组测序检测遗传病拷贝数变异的初步探索
全外显子测序检验的临床意义与样本要求
全外显子测序检验的临床意义与样本要求在当今医学领域，全外显子测序检验正逐渐成为临床诊断和治疗中不可或缺的重要工具。
全外显子测序是一种高通量的基因组测序技术，能够对所有外显子区域进行全面的检测和分析，从而帮助医生发现患者潜在的遗传变异和突变，为疾病的诊断和治疗提供更精准的信息。
针对全外显子测序检验的临床意义和样本要求，本文将从多个角度进行探讨，并共享个人观点和理解。
一、全外显子测序检验的临床意义1. 诊断和治疗指导：全外显子测序能够为医生提供全面的遗传变异信息，帮助精准诊断疾病类型和确定治疗方案。
尤其对于罕见遗传病、癌症等复杂疾病的诊断和治疗指导具有重要意义。
2. 遗传沟通和家族风险评估：通过全外显子测序检验，可以帮助患者进行遗传沟通，评估患病风险，并为家族成员提供相关遗传信息，帮助他们进行风险评估和健康管理。
3. 个性化医学：全外显子测序检验为个性化医学提供了重要的基础数据，可以根据个体的基因组信息，制定个性化的预防、诊断和治疗方案，实现精准医疗。
二、全外显子测序检验的样本要求1. 样本类型：全外显子测序通常需要采集患者的血液样本，获取其中的DNA进行测序分析。
对于一些特定疾病或研究项目，还可能需要获取肿瘤组织样本等特定样本。
2. 样本质量：样本的质量直接影响着全外显子测序的准确性和可靠性。
在采集和保存样本时，需要注意避免血液凝块和样本污染等情况，保证样本的纯度和完整性。
3. 样本数量：通常情况下，全外显子测序需要一定数量的DNA样本才能进行测序分析。
对于不同的实验项目和测序评台，样本数量的要求可能会有所不同，需要根据具体情况进行调整。
三、个人观点和理解全外显子测序作为一种新型的基因组测序技术，对于临床诊断和治疗具有重要意义。
通过对个体基因组的全面检测，我们能够更好地了解疾病的遗传基础，为精准医学提供数据支持。
然而，在进行全外显子测序检验时，我们也需要考虑样本的要求和质量，以确保测序结果的准确性和可靠性。
外显子组测序信息分析
外显子组测序信息分析外显子组测序技术的基本步骤包括DNA提取、文库构建、高通量测序和生物信息学分析。
首先，从样品中提取DNA，通常使用血液或组织样本。
然后，将DNA片段切割，并使用特定的引物将其扩增为文库。
接下来，将文库中的DNA片段进行高通量测序，产生大量的短读取序列。
最后，使用生物信息学工具对测序数据进行分析，以寻找变异并解读其意义。
外显子组测序的结果可以提供大量有关基因组的信息。
首先，可以检测SNV和Indel等单个碱基突变，这些突变可能与人类疾病的发生相关。
其次，可以检测到外显子区域的读框错移突变，这些突变可能会导致蛋白质的功能改变。
此外，还可以通过检测外显子区域的拷贝数变异(CNV)来揭示与疾病相关的基因缺失或复制。
最后，外显子组测序还可以帮助发现新的基因和调控元件，以及对个体之间的遗传差异和基因底物关系进行研究。
虽然外显子组测序技术已经取得了很大的成功，但仍然面临一些挑战。
首先，外显子组测序只能揭示外显子区域的变异，而无法揭示基因组的其他部分。
其次，由于测序数据的复杂性，需要进行大量的生物信息学分析，对于没有相关经验的研究者来说可能会有一定的难度。
此外，由于运营和存储测序设备的成本较高，外显子组测序对实验室和研究者的设施和经济资源要求较高。
总之，外显子组测序是一种强大的技术，可以揭示与人类疾病相关的基因变异。
通过对测序数据的分析和解读，可以帮助我们更好地理解基因组的结构和功能，为疾病的诊断和治疗提供重要的信息。
尽管面临一些挑战，随着技术的进步和成本的下降，外显子组测序在个性化医学和遗传学研究中将发挥越来越大的作用。
外显子组测序技术在遗传疾病检测中的应用
外显子组测序技术在遗传疾病检测中的应用随着遗传学研究的深入，越来越多的遗传疾病得到了解决。
而随着科技的不断进步，人们开发出了越来越多的工具来解决遗传疾病的检测问题。
其中，外显子组测序技术已成为一项非常有效的检测手段，被广泛应用于遗传疾病的检测中。
本文将会对外显子组测序技术在遗传疾病检测中的应用进行探究，旨在为大家更好地了解这一技术。
外显子组测序技术的原理和特点外显子组测序技术（Exome Sequencing）是一种高通量测序技术，能够快速而准确地对人类基因组中存在的编码蛋白的外显子进行测序，包含人类基因组中的大约2%的基因部分，是人类基因组测序的有效手段。
外显子组测序技术是一种基于高通量测序技术的分子生物学技术，是通过将人类基因组中的编码蛋白的外显子与大量的引物反复杂交，在使得这些引物与DNA序列结合的过程中，将其扩增并进行序列测序。
拥有比全基因组测序更高的覆盖度、更快的处理速度以及更低的成本，使得外显子组测序技术成为大规模测序的主流工具之一。
外显子组测序技术不仅可以用于人类基因组的测序，同时也可以用来分析外显子，从而更好地了解人类的基因遗传机制。
外显子组测序技术的应用外显子组测序技术具有高精度和高可靠性的特点，使其在遗传疾病的诊断和基础研究领域中广泛应用。
此外，外显子组测序技术可以通过测序结果，实现遗传疾病的基因诊断和基因分型，探究基因底层的遗传机制，便于更好地分析和解决遗传疾病的治疗问题。
同时，外显子组测序技术还可以用来进行遗传病毒病例筛查、幼儿常见疾病筛查、基础分子遗传学研究、基因功能研究和人群遗传学研究等领域，具有广泛的应用前景。
外显子组测序技术的优缺点虽然外显子组测序技术在遗传疾病检测方面具有很大的优势，但是在实际应用中还存在着一些缺点，需要进行全面评估和优化。
其优点主要表现在以下几个方面：首先，外显子组测序技术可以对大量的外显子序列进行高通量测序。
与以往的Sanger测序方式相比，外显子组测序技术可以大大提高测序效率和速度。
外显子测序原理
外显子测序原理
外显子测序是一种基因组测序技术，它的原理是通过对DNA中编码蛋白质的外显子区域进行测序，来揭示个体基因组的遗传信息。
外显子是基因组中编码蛋白质的部分，相对于整个基因组来说，外显子只占据了很小的比例，但却包含了大部分人类疾病相关的变异。
外显子测序的原理主要包括以下几个步骤，DNA提取、文库构建、高通量测序和数据分析。
首先，从样本中提取DNA，然后将DNA片段通过特定的方法构建成文库，接着进行高通量测序，获取大量的DNA序列信息。
最后，利用生物信息学分析软件对测序数据进行分析，鉴定外显子区域的变异信息。
在DNA提取过程中，需要保证提取的DNA质量和纯度，以确保后续测序的准确性和可靠性。
文库构建是将DNA片段连接到载体上，形成文库，这一步骤的关键是要避免DNA片段丢失或错位。
高通量测序是通过高通量测序技术对文库中的DNA片段进行大规模并行测序，产生海量的DNA序列数据。
数据分析是将测序得到的原始数据进行质控、比对、变异检测等一系列生物信息学分析过程，最终得到外显子区域的变异信息。
外显子测序技术的应用非常广泛，它可以用于研究人类疾病的发病机制、遗传变异的关联分析、药物靶点的筛选等领域。
通过对外显子的测序，可以发现与疾病相关的致病基因突变，为疾病的早期诊断和个体化治疗提供重要的依据。
同时，外显子测序也可以用于研究种群遗传结构、演化过程和基因型-表型关联等基因组学研究领域。
总的来说，外显子测序技术以其高通量、高效率、高准确性的特点，成为了当前研究基因组学和临床遗传学的重要工具。
随着测序技术的不断发展和成熟，外显子测序的应用前景将会更加广阔，为人类健康和疾病治疗带来更多的机遇和挑战。
基因组拷贝数变异测序报告
基因组拷贝数变异测序报告随着基因组测序技术的迅猛发展,个人基因组测序已逐渐成为疾病诊疗、健康管理以及探寻生命奥秘的主要手段之一,极大推动了遗传学、基因组学和医学等相关学科的发展。
与此同时,越来越多的科学实验表明,拷贝数变异作为基因组变异中一种重要的结构性变异,与生命进化、生物多样性以及多种复杂疾病、罕见病的发生和发展紧密关联。
因此,全面、准确检测拷贝数变异对于探索生命体自然规律、揭示生命奥秘以及理解疾病产生机制、寻找致病靶点和疾病诊疗都具有十分重要的研究意义。
然而,由于人类基因组自身的高度复杂性、测序数据的超大数据量以及现有测序技术自身的局限等因素,如何快速、有效地检测和分析拷贝数变异面临着巨大的挑战。
本文围绕基于基因组测序技术的拷贝数变异检测方法为研究重点开展相关研究。
本研究的目标是通过对现有外显子组测序数据拷贝数变异检测方法的系统评价,提出具有更高敏感性和特异性的外显子组拷贝数变异检测方法;同时,提出一种基于广义拓扑熵的基因组序列分析方法,对拷贝数复制序列进行检测与分析。
本文的主要研究内容、研究方法如下:第一,针对目前外显子组测序数据拷贝数变异检测方法在真实数据中检测效果不明确以及没有系统的测评标准等问题,本文首先提出客观评价外显子组测序数据拷贝数变异检测效果的测评方法,并对业内主流的外显子组拷贝数变异检测方法进行系统测评。
测评标准及测评结果可以为相关科研人员针对其各自的科学实验选择不同的检测方法提供理论依据,同时为进一步提出新的拷贝数变异检测方法奠定基础。
第二,针对现有基于外显子组测序数据拷贝数变异检测方法检测效果不理想的问题,提出新的基于群体样本模式的拷贝数变异检测方法。
该方法首先使用主成分分析等手段对外显子组测序数据进行降噪;随后,该方法全面整合reads深度和单核苷酸变异(Single Nucleotide Variation,SNV)信息,共同组成双链隐马尔科夫模型进行拷贝数变异检测。
全外显子测序报告解读原则与技巧
全外显子测序报告解读原则与技巧全外显子测序是利用高通量测序技术对生物体全基因组外显子区域进行测序，从而揭示人类个体及群体基因组中与疾病相关的基因变异，是现代个性化医学的重要技术手段之一。
下面我们将介绍全外显子测序报告的解读原则和技巧。
解读原则：1.全面性：全外显子测序提供了全面、高通量的大量数据，必须对其进行全面、深入的解读。
同时需要结合临床资料，以全面、系统性的方式进行解读。
2.多参考性：全外显子测序可能会检测到一些变异，但并不一定与致病性相关。
因此，需要根据多个参考数据库、文献资料以及基于家系检测的疾病遗传性等多方面的数据进行判断和筛选。
3.个体化：全外显子测序报告需要与具体个体相关的临床资料、家族病史等进行结合，重点考虑与之相关的变异是否致病、临床意义何在等方面。
4.实用性：全外显子测序报告应当具有实用性，得出的结论应当能指导个体的诊断、治疗与遗传咨询。
解读技巧：1.对阳性结果进行验证：全外显子测序可能会检测到大量的单核苷酸多态性（SNP）、小的结构变异等，为了保证结果的精确性，最好对阳性结果进行验证，可以使用参考文献、数据库或其他现代检验技术进行检验。
2.避免过度解读：全外显子测序结果的解读需要考虑基因本身的复杂性，并非所有的变异都与疾病相关。
因此不应过度解读，需要根据科学方法进行分析和评价。
3.结合病史、家族史等临床资料：全外显子测序结果需要结合实际临床背景进行解读，包括基因检测的目的、临床表现、影响家庭、遗传风险等因素。
4.遵循实践指南：目前许多学会和机构都制定了全外显子测序报告解读的指南，如美国基因组医学协会（ACMG）和全球基因组联盟（GA4GH）等，解读应该遵循指南的原则和标准。
总之，全外显子测序是一项高复杂性的技术，其结果的解读需要谨慎，需要全面、深入地理解和分析，以确保结果的准确性和实用性。
同时，我们需要结合个体的临床信息和基因组数据来指导临床医生的决策和个体的诊断治疗方案，为个性化医学做出贡献。
利用外显子组测序检测一个家系突变的分析方法介绍201412
Fastq文件示例>>
第二步：测序质量评估及过滤
• 评估数据产量和质量（Illumina报告示例）， 并根据需要去除接头污染和低质量序列， 如：
– FastQC可对Illumina和ABI SOLiD测序序列质量 进行快速评估（FastQC质量报告示例） – FASTX-Toolkit和Galaxy即可评估序列质量，还 可去除污染碱基和低质量碱基并对序列进行 质量过滤
变异注释工具比较
(Pabinger, et al. Brief in Bioinform, 2013)
实际应用中，具体运用某个特定的软件是可以根据需要调整、优化的
常用注释工具ANNOVAR
• /annovar/
• 较全面的功能注释，广为使用 • 需在本地安装注释数据库，如dbSNP、 1000genomes、SIFT、DGV等，按需灵活使用 • 可基于基因注释、基于区间注释，还可过滤 • 对于SNP和indel，结果包括基因注释、氨基酸 置换预测评分、保守性预测评分、dbSNP ID、 千人基因组变异频率、NHLBI-ESP 6500 个外显 子测序变异频率等 • Annovar注释结果示例
– 目前是验证DNA序列突变的金标准
• 全基因组或全外显子组的第二代测序(Nextgeneration sequencing, NGS)(Illumina: 30-150bp)
– 优点：是通量高，成本较低 – 缺点：需PCR易引入误差，容易在高GC和同聚物的区域 出现错误，无法对高重复区域和单倍体型或杂合子序 列等这些复杂区域进行测序
可在线使用的注释工具 SeattleSeq Annotation
• /SeattleSeqAnnotation137/
• 可接受多种输入格式，如Maq、GFF、CASAVA、VCF、 自定义格式、一行一基因型格式、GATK BED • 可根据NCBI 全基因注释、或CCDS（仅编码区）、 或NCBI和CCDS两者兼有 • 注释的结果内容较SnpEff丰富，但不及ANNOVAR全 面
人类基因外显子组的研究与分析
人类基因外显子组的研究与分析人类基因组是由近3亿个碱基对构成，其中包括约2万个基因。
然而，这些基因只占人类基因组的1.5%左右。
而剩下的98.5%则被称为非编码基因组。
这些非编码区域过去被认为是无用的“垃圾”DNA，但是越来越多的研究表明它们其实包含着很多重要的信息。
其中，基因外显子组是一个备受关注的研究领域。
一、基因外显子组的定义与特征基因外显子是指基因的编码区域，包括基因剪接后的外显子序列以及与其相关的三个非编码区域，即5'非翻译区（UTR）、3'UTR和内含子。
外显子编码了蛋白质的氨基酸序列，而UTR和内含子则对基因的调控和调节起到了重要的作用。
基因外显子的序列长度平均为1800个碱基，占到了人类基因组的约2%。
这些编码区域是遗传信息的主要表达部位，也是遗传变异的主要来源。
二、基因外显子组的研究进展随着高通量测序技术的不断发展，基因外显子组研究进展迅速。
2011年，人类基因外显子组计划（Human Exome Project）正式启动，旨在对人类基因外显子组进行全面的测序研究。
该项目对17,000个人进行了外显子组测序，共鉴定出了220,000个单核苷酸多态性（SNP）和13,000个小型插入/缺失（Indel）。
基因外显子组中的SNP和Indel是基因遗传变异的主要形式，它们的分布与基因本身的表达和功能密切相关。
因此，基于基因外显子组的遗传变异分析已成为人类遗传学、系统生物学和个性化医疗研究的重要手段。
同时，越来越多的研究表明，基于基因外显子组的突变检测也能够为肿瘤诊断和治疗提供重要的参考。
例如，在患有癌症的患者中，通过测序研究发现基因外显子组中的突变信息，可以帮助精准诊断肿瘤类型并定制最适合患者的治疗方案。
三、基因外显子组研究的挑战基因外显子组研究面临着数据分析和解读的巨大挑战。
首先，由于基因外显子组测序是高通量、高精度的技术，产生的数据量非常庞大，需要大量的计算资源和分析技术支持。
外显子组测序数据分析流程
外显子组测序数据分析流程外显子组测序（Exome Sequencing）是一种用于测序所有编码蛋白质的外显子区域的技术。
外显子是基因组中编码蛋白质的区域，占据整个基因组的约1-2%。
相较于全基因组测序，外显子组测序可以更加经济高效地研究和发现与疾病相关的基因变异。
以下是外显子组测序数据分析的一般流程：1.数据质控和预处理2.比对和变异调用将预处理后的数据与参考基因组进行比对，可以使用多种比对工具，如BWA、Bowtie等。
比对后，会通过一系列的筛选步骤，利用各种变异检测算法对测序结果进行检测，包括单核苷酸变异（SNV）、小片段插入/缺失（Indel）和结构变异（SV）等。
3.变异注释在进行变异注释时，将检测到的变异与各类公共数据库（如dbSNP、ClinVar等）进行比对，以确定变异的频率和相关的临床信息。
还可以使用预测软件预测变异的功能影响和通路关联等。
4.功能分析和数据解读对于已注释的变异，需要进一步进行功能分析和数据解读。
这包括通过标准化的生物信息学和统计学方法对候选变异进行筛选，确定相关性并验证其是否对目标表型有影响。
可以使用多种工具和软件，如ANNOVAR、Variant Effect Predictor（VEP）等。
5.通路分析和功能富集通路分析和功能富集分析帮助理解变异对细胞、组织或系统功能的影响。
可以使用数据库和工具，如DAVID、GSEA等，通过GO（Gene Ontology）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）路径信息和其他公共基因组学数据库，对变异进行通路富集和功能分析。
6.结果呈现最后，将数据分析结果通过可视化图形、表格和注释报告等形式进行展示和呈现。
这有助于更好地理解分析结果并帮助研究人员做出进一步的研究和决策。
需要注意的是，外显子组测序数据分析流程是根据具体研究目标和实验设计而有所不同的，上述流程仅为一般参考。
拷贝数变异检测方法
拷贝数变异检测方法拷贝数变异是指基因组中某一段DNA序列在进化过程中发生了拷贝数的变异，即该序列的拷贝数增加或减少。
拷贝数变异被认为是基因组结构变异的主要形式之一，它在物种进化和个体遗传多样性中起到重要的作用。
为了准确、高效地检测拷贝数变异，科学家们开发了一系列方法。
下面将介绍几种常用的拷贝数变异检测方法。
1. MLPA（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification）MLPA是一种常用的拷贝数变异检测方法，它利用多重连接依赖式探针扩增技术，可以同时检测多个目标序列的拷贝数。
该方法通过引入两个特异性的引物，使目标序列的两个相邻区域连接起来，然后进行PCR扩增。
通过比较目标序列与参考基因组的扩增产物的相对强度，可以确定目标序列的拷贝数是否发生变异。
2. qPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）qPCR是一种基于聚合酶链反应的拷贝数变异检测方法，它可以快速、准确地测量目标序列的拷贝数。
该方法利用特异性引物和荧光探针，通过监测PCR反应体系中的荧光信号强度来定量目标序列的拷贝数。
相比于传统PCR方法，qPCR具有更高的灵敏度和准确性。
3. MLST（Multilocus Sequence Typing）MLST是一种基于多基因序列分型的拷贝数变异检测方法，它通过测定多个基因的拷贝数变异来推断目标序列的拷贝数。
该方法利用PCR扩增多个基因的片段，并对扩增产物进行测序分析。
通过比较目标序列与参考基因组的片段长度和序列差异，可以确定目标序列的拷贝数是否发生变异。
4. aCGH（array Comparative Genomic Hybridization）aCGH是一种基于基因组DNA杂交的拷贝数变异检测方法，它可以全基因组范围内快速、高通量地检测拷贝数变异。
该方法利用两个不同来源的DNA样品，将其分别标记为红色和绿色，并将它们杂交到DNA芯片上。
全外显子测序实验的步骤详解
全外显子测序实验的步骤详解全外显子测序实验的步骤详解在这篇文章中，我将详细介绍全外显子测序实验的步骤。
全外显子测序是一种高通量测序技术，可以同时检测一个个体的所有外显子区域。
这项技术的广泛应用在生物医学研究、基因组学和临床诊断中。
通过全外显子测序，我们可以深入了解人类基因组和其他物种的遗传变异，从而加深对遗传疾病的认识，并为个体化医疗提供重要的支持。
全外显子测序实验的步骤一般可分为DNA提取、文库构建、测序和数据分析四个主要阶段。
下面我将详细介绍每一步的操作和技术。
第一步：DNA提取DNA提取是全外显子测序的首要步骤。
正确的DNA提取方法可以确保样本中的DNA完整性和纯度。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、琼脂糖柱法和磁珠法等。
在这一步中，我们需要从样品中提取出高质量的基因组DNA，并通过比较纯净的样本质量和测序需求来选择适当的提取方法。
第二步：文库构建文库构建是全外显子测序的关键步骤之一。
在这一步中，我们需要将待测样本的DNA片段转化为可供测序的文库。
常用的文库构建方法包括PCR扩增、聚合酶链式反应（PCR）和各种商业化试剂盒。
在这一步中，我们需要优化文库构建的条件，包括选择合适的引物、调整反应体系、控制文库的片段大小和避免文库重组等。
第三步：测序测序是全外显子测序实验的核心步骤。
现代高通量测序技术包括Illumina测序、Ion Torrent测序和PacBio测序等。
在这一步中，我们将文库中的DNA片段与测序仪中的荧光标记引物结合，通过测序仪的扫描和记录，得到DNA片段的序列信息。
在测序过程中，我们需要合理选择测序深度，以保证测序质量和覆盖度的平衡。
第四步：数据分析数据分析是全外显子测序实验的最后关键步骤。
现代测序技术产生的数据量非常大，需要通过生物信息学分析来提取有用的信息。
数据分析的主要内容包括序列质量控制、序列比对、突变检测和功能注释等。
在这一步中，我们可以利用各种生物信息学工具和数据库对序列进行处理和解读，从而获得与个体的遗传特征、功能突变和疾病相关的信息。
拷贝数变异及其研究进展
拷贝数变异及其研究进展摘要：拷贝数变异(Copy number variations, CNVs)主要指1kb-1Mb的DNA片段的缺失、插入、重复等。
文章主要介绍了CNVs的基本知识及其机理，着重介绍了其各种检测技术，并进一步阐明CNVs对人类疾病及哺乳动物疾病的影响。
此外，对其研究发展进行可行性展望。
关键词：拷贝数变异机理检测技术疾病2004年，两个独立实验小组几乎同时报道，在人类基因组中广泛存在DNA片段大小从1 kb到几个Mb范围内的拷贝数变异(CNVs)现象。
在2006 年的《Nature》杂志上,来自英国Wellcome Sanger研究所以及美国Affymetrk公司等多国研究人员组成的研究小组公布了第1张人类基因组的第1代CNV图谱，后续又有3篇文章陆续发表在《Nature Genetics》和《Genome Research》杂志上，聚焦这一重大发现。
受到检测手段的限制，这类遗传变异直到最近2年才为研究者所重视，并迅速成为当前人类遗传学研究的热点。
CNVs 最初在患者的基因组中发现，但后来发现CNVs也大量存在于正常个体的基因组内，主要引起基因(或部分基因)的缺失或增多。
拷贝数的变异过程既与疾病相关，也与基因组自身的进化有关。
针对CNVs的发现，美国遗传学家JamesR.Lupski提出“我们不能再将人与人之间的差异想当然地认为仅是单碱基突变的结果，因为还存在更复杂的来自于CNVs的结构性差异”。
Lupski认为，CNVs的发现将改变人类对遗传学领域的认知，并将影响19世纪被誉为“遗传学之父”的孟德尔及 1953年发现“DNA双螺旋”的弗兰西斯•克里克与吉姆•沃特森所确立的人类遗传学基准1 CNV概述1.1 CNV的概念基因组变异包括多种形式，包括SNPs，数目可变串联重复位点VNTRs (微卫星等），转座元件 (Alu序列等），结构变异（重复、缺失、插入等）。
CNVs指大小从1kb到1Mb 范围内亚微观片段拷贝数突变，这些拷贝片段的缺失、复制、倒置等的变异都统称为CNVs,但不包括由转座子的插人和缺失引起的基因变异（如0-6kb Kpn I重复）[1]。
拷贝数变异（CNV）
拷贝数变异（CNV）人类基因组由23对染色体中的60亿个碱基（或核苷酸）组成。
正常人类基因组成分通常是以2个拷贝存在，分别来自父母。
拷贝数变异（CNV）是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的缺失和重复，是人类疾病的重要致病因素之一。
异常的DNA拷贝数变化（CNV）是许多人类疾病（如癌症、遗传性疾病、心血管疾病）的一种重要分子机制。
作为疾病的一项生物标志，染色体水平的缺失、扩增等变化已成为许多疾病研究的热点，然而传统的方法（比如G显带，FISH，CGH等）存在操作繁琐，分辨率低等问题，难以提供变异区段的具体信息。
CNV，即拷贝数变异，一般指长度为1kb到几个Mb基因组大片段的拷贝数复制、缺失。
CNV被定义为一段至少1kb大小DNA的拷贝数，与具有代表性的参考基因组拷贝数不同。
CNV在基因组中的存在形式主要有以下几种：2条同源染色体拷贝数同时出现缺失；1条同源染色体发生缺失，1条正常；1条同源染色体出现拷贝数重复，另1条正常；1条同源染色体出现缺失，另1条出现拷贝数重复；2条同源染色体同时出现拷贝数重复。
染色体拷贝数变异（CNV）检测：NIPT技术目前医院临床应用的为普通NIPT技术，商业上还有通过增加测序数据的升级版的NIPT产品（可以检测染色体微缺失/微重复和某些单基因病）。
对于NIPT提示的CNV可以分为两种：母源性CNV，就是母亲存在CNV（此时胎儿50%可能存在相同的CNV，50%可能不存在该CNV）；第二种，胎儿CNV。
母源性CNV的阳性预测值（PPV）接近100%，因为母源游离DNA占比90%，因此阳性预测值（PPV）很高就不足为奇。
但是不同的检测机构或者有些已发表文献，并不提示母源性CNV。
对于母源性CNV，胎儿无非两种情况，和母亲一样拥有同样的CNV，或不含有该CNV。
在临床咨询中，对于这种来源于母源或父源CNV，如果父母本身没有任何表型，胎儿本身也不存在超声结构异常，我们大多认为偏良性。
自闭症相关拷贝数变异检测及临床意义解读研究进展论文
ｘ
２
ｄｉｓｏｒｄｅｒ，ＡＤＨＤ）患者ＣＮＶｓ的重合程
度也显著高于对照（Ｐ＝４．７７×１０。），即便是去除ＡＳＤ特异 性易感位点也是如此（Ｐ＝８．２８×１０。）。与对照相比，生物 学通路在ＡＳＤ患者的ＣＮＶｓ中有显著聚集性，ＡＳＤ患者的 ＣＮＶｓ影响的基因参与３个生物学通路，包括烟碱乙酰胆碱 受体信号通路、细胞分化和药物反应‘１…。Ｐｉｎｔｏ等‘１列也观察 到ＣＮＶｓ影响的基因会在细胞增殖、移动以及ＧＴＰａｓｅ／Ｒａｓ 信号传导等通路聚集，而新发ＣＮＶｓ的基因会聚集在神经元 信号传导和发育、突触功能和染色质调控的相关通路上。其 他发现的ＡＳＤ相关通路还包括泛素通路、突触发育、轴突寻 靶等‘１
ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒａｓ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎｓ
ｐｒｏｔｅｉｎ
ＣＮＶｓ在不同个体中会表现出外显率的差异，患者中有 近４０％的家族特异性ＣＮＶｓ遗传自无明显ＡＳＤ临床表型的 父母０１６ ３。ＣＮＶｓ外显率也具有性别差异，相较于男性患者， ＡＳＤ女性患者携带的ＣＮＶｓ外显率更高‘１…。研究表明与神 经系统疾病相关的ＣＮＶｓ在健康对照人群中发生的频率很 低，且每条ＣＮＶ可与多种神经系统疾病相关联，如ＡＳＤ、双 向障碍、智力低下、癫痫、ＡＤＨＤ等。１“。一些外显率差异的 ＣＮＶｓ包括１ｑ２１．１的微扩增、１６ｐ１１．２的微扩增以及 ２２ｑ１１．２的微缺失，１５ｑ１１．２的缺失是更为典型的例子，此区 域的缺失被认为与ＡＳＤ发生有重要相关性，但同样在健康 对照和未患病亲属中检测到此缺失¨“。有研究发现携带 ＡＳＤ等神经精神疾病相关ＣＮＶｓ的个体的认知水平处于精 神分裂症患者和健康对照之间，表明这些在正常的人群中存 在的ＣＮＶｓ，确实能产生临床效应，在一定程度上否定了正常 人群中存在的ＣＮＶｓ就是良性多态ＣＮＶｓ的观点¨””ｏ。将 ＣＮＶｓ基因型与表型明确联系起来，还要考虑到ＣＮＶｓ的影 响的可能并不是所有对应表型。现已知ＣＮＶｓ与ＡＳＤ表型 关联主要在智力障碍方面，而不是社会认知方面。不同 ＣＮＶｓ区域影响的基因及基因剂量差异，对神经发育性疾病 致病风险不一样’１…，同时表型的差异还决定于多个方面，如 生长环境和营养等。另外，高外显率的基因的表达也受其他 遗传因素调节，这些因素包括罕见突变、常见（多基因）突变 或表观遗传调控、基因座异质性和多效性等。２“。因此， ＣＮＶｓ对ＡＳＤ的影响是受多因素调控的。 （三）新发ＣＮＶｓ在ＡＳＤ发生中的作用 早期的连锁研究发现了很多具有微弱统计学意义的风 险位点，疾病在家系中的分离也不符合经典的孟德尔遗传规 律，尽管也有研究表明一些罕见的符合孟德尔遗传规律的突 变在ＡＳＤ中被检测到，但不能确定这些具有较大影响的罕 见突变在特发性ＡＳＤ致病中的作用。ＡＳＤ为复杂性疾病， 不符合经典的孟德尔遗传模式，因此关于ＡＳＤ致病ＣＮＶｓ的 研究也关注于非孟德尔遗传的因素，比如新发突变（ｄｅ
一文读懂全外显子测序家系突变筛选策略
一文读懂全外显子测序家系突变筛选策略最近老师和同学经常问针对外显子测序的家系遗传病如何进行突变筛选,今天小編就撰稿一篇,希望对老师和同学有所帮助,话不多说,直接看下面的干货。
小编碎语：DNA测序中从测序区域的大小分为全基因组重测序，全外显子测序，靶向区域测序。
全外显子大概占DNA全部碱基对的1%，即大概30M的碱基，目前大部分测序的全外数据量为10G，测序深度大概为100X-150x左右，不同的试剂盒导致不同的捕获效率的不同，不同试剂盒的均一度的不同导致不同区域实际深度不同，由于全外显子测序检测数据量适中(约10G)，与全基因组相比(约90G)，因为人类疾病有90%在外显子区域,全外显子测序十分具有性价比，可以发现与人类疾病关系密切的外显子部分的相关基因突变。
全外显子的测序应用十分广泛，整体从技术上来说，1)可以检测 SNV 的 germ line 突变;2)也可以在一定程度上检测肿瘤的somatic 突变(深度200X以上);3)可以检测外显子区域的CNV, 融合等突变;从外显子测序技术延伸出的临床应用来说，可以应用于以下的方面：1)确定孟德尔遗传疾病相关基因；2)风险易感基因的发现(与全基因组关联分析类似);3)癌症相关研究(高深度情况下);全外显子测序的高通量分析流程如下：不同试剂盒导致捕获效率的不同，不同试剂盒均一度的区别导致不同区域实际深度差异,下表为目前市场上主流试剂盒的比较。
孟德尔遗传疾病相关研究(家系筛选)通过全外显子生物信息分析，通过初步将得到一些可能的致病突变;如果知道样本家系属于何种致病模式，可以使用不同的筛选模式进行筛选。
筛选模式有：1)常染色体隐性遗传甲、乙：隐性遗传表现为双亲都没病，孩子患病。
患病个体亲代是突变携带者但表型正常，子代患病，如果不存在近亲结婚或生殖隔离等因素，往往患者同一致病基因的不同位点存在致病突变，即患者带有复合杂合突变（compound heterozygous mutations）。
全外显子测序实验步骤
全外显子测序实验步骤简介全外显子测序是一种高通量测序技术，可以对人类基因组中的所有外显子进行测序。
外显子是基因组中编码蛋白质的部分，全外显子测序可以帮助我们了解基因组中的变异和突变，从而揭示与疾病相关的基因变异。
全外显子测序实验涉及多个步骤，本文将详细介绍这些步骤，包括样本准备、DNA提取、文库构建、测序和数据分析等。
步骤1. 样本准备全外显子测序实验首先需要准备样本，通常是从患者或实验动物中获取的血液、组织或细胞样本。
样本的选择应根据研究目的和样本可获得性进行。
2. DNA提取从样本中提取DNA是进行全外显子测序的关键步骤。
DNA提取方法可以根据样本类型选择，常见的方法包括酚氯仿法、盐析法和商用DNA提取试剂盒等。
3. 文库构建文库构建是将提取的DNA样本转化为可以进行测序的文库的过程。
文库构建的主要步骤包括DNA片段化、末端修复、连接测序适配体和文库富集等。
•DNA片段化：将提取的DNA样本通过超声波或酶切等方法打断成较小的片段，通常大小为200-300碱基对。
•末端修复：对DNA片段的末端进行修复，包括去除3’和5’的过度突出部分，以及在末端添加磷酸基团。
•连接测序适配体：将修复的DNA片段与测序适配体连接，适配体含有测序引物和标识序列，用于后续的测序反应。
•文库富集：通过PCR扩增等方法富集连接好的文库，以增加测序效率和准确性。
4. 测序文库构建完成后，接下来进行测序。
全外显子测序通常采用高通量测序技术，如Illumina HiSeq或NovaSeq等。
•测序前处理：将文库中的DNA片段固定到测序芯片上，通常使用PCR扩增和桥式PCR等方法。
•测序反应：在测序芯片上进行碱基的顺序测定，根据测序适配体上的引物和标识序列识别碱基。
•数据生成：测序仪器会生成原始测序数据，通常以FASTQ格式存储。
5. 数据分析测序完成后，需要进行数据分析以获得有用的信息。
数据分析的主要步骤包括：•数据质控：对原始测序数据进行质量评估和过滤，去除低质量的序列。
拷贝数变异
拷贝数变异（CNV）是指基因组中有些DNA片段在不同的人里面重复或缺失的次数不一样，就像一本书里面有些段落被多复制或少复制了一些。
这些DNA片段可能包含一些基因，也可能不包含。
拷贝数变异（CNV）是一种常见的基因组变异，就像单核苷酸多态性（SNP）一样，它们可以让我们的基因组有多样性和差异性。
拷贝数变异（CNV）可以影响我们的身体和健康，因为它们可以改变基因的表达量和功能，从而导致不同的性状和疾病。
例如，有些拷贝数变异（CNV）可以增加我们对某些药物的反应或耐受性，有些拷贝数变异（CNV）可以增加我们患某些癌症或神经病的风险。
拷贝数变异（CNV）的检测和分析是一个很重要的研究领域，它可以帮助我们更好地了解我们的基因组和生物学。
目前，有一些方法可以检测拷贝数变异（CNV），例如使用芯片或测序技术对基因组进行扫描和比较。
但是，这些方法也有一些局限性和挑战，例如不能检测到很小的拷贝数变异（CNV），或者不能准确地区分不同类型的拷贝数变异（CNV）。
最近，有一项新的研究开发了一种新的计算方法，在英国生物数据库中发现了很多新的拷贝数变异（CNV），并且发现了它们与人类性状和疾病之间的关系。
这项研究为拷贝数变异（CNV）的研究提供了一个新的视角和机会。
DNA变异数据分析的常用方法与流程
DNA变异数据分析的常用方法与流程DNA变异是指DNA序列中的碱基发生改变或插入/缺失的现象。
DNA变异的研究对于了解基因功能、遗传病发病机制以及个体间的遗传差异具有重要意义。
随着高通量测序技术的快速发展，越来越多的DNA变异数据被生成，因此，开发和应用各种方法来分析DNA变异数据变得至关重要。
本文将介绍DNA变异数据分析的一般流程和一些常用的方法。
1. 数据获取DNA变异数据可以通过多种方式获取，包括全基因组测序（WGS）、全外显子组测序（WES）、目标区域测序、基因芯片等。
根据研究目的和预算限制，选择适当的测序方法获取DNA变异数据。
2. 数据预处理DNA测序数据通常包含大量的碱基序列和相应的质量信息。
在分析之前，需要进行数据预处理来去除测序中的噪声和错误。
常见的预处理步骤包括：去除低质量序列、去除接头序列、剪切读长、去除受到测序仪器引入的读长偏差等。
3. 变异检测变异检测是DNA变异数据分析的核心步骤。
它旨在发现与参考基因组或已知变异位点不同的碱基或插入/缺失事件。
常用的变异检测方法包括： - SNV（单核苷酸变异）检测：通过比较碱基的不同来识别SNV。
常见的SNV检测工具有GATK、samtools、FreeBayes等。
- CNV（拷贝数变异）检测：通过测序深度或其他分析方法来识别基因拷贝数的改变，如增加或减少。
常用的CNV检测工具有ExomeDepth、CoNIFER、CNVnator等。
- Indel（插入/缺失变异）检测：编码区域插入/缺失变异可能导致产生错义突变或框移。
常用的Indel检测工具包括GATK、samtools、Platypus等。
4. 数据注释数据注释是将变异与已知的功能和相关信息进行关联的过程。
通过注释，可以了解变异的可能功能和相关的遗传信息。
常用的数据注释工具包括ANNOVAR、Variant Effect Predictor（VEP）、SnpEff等。
5. 变异过滤和解读在DNA变异数据分析中，经常会通过设置筛选条件来过滤掉一些无关或不可靠的变异。
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医学外显子组测序检测遗传病拷贝数变异的初步探索张彦;孙樱桐;许艺明;丁红珂;张巍;尹爱华【摘要】[目的]评价医学外显子组高通量测序技术用于拷贝数变异(CNV)检测的可行性.[方法]两个不相关的遗传病家系案例,患者除了有智力障碍的类似症状外,无其他明显共同点.通过脆性X染色体综合征基因筛查、染色体G显带技术、染色体微阵列技术以及医学外显子组测序技术等对患者及其家属进行遗传学检测.[结果]在两个家系的患者中均发现染色体拷贝数变异,片段大小从11.4 kb到13.03 Mb不等.拷贝数变异得到了其他技术的验证.[结论]医学外显子组高通量测序技术用于拷贝数变异相关的遗传病临床辅助诊断是可行的,但其有效性和准确度有待进一步大量数据的评估和验证.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2019(040)001【总页数】6页(P144-149)【关键词】高通量测序;医学外显子组;拷贝数变异;孟德尔遗传病【作者】张彦;孙樱桐;许艺明;丁红珂;张巍;尹爱华【作者单位】广东省妇幼保健院医学遗传中心,广东广州511442;广州嘉检医学检测有限公司,广东广州510300;广州嘉检医学检测有限公司,广东广州510300;广东省妇幼保健院医学遗传中心,广东广州511442;广州嘉检医学检测有限公司,广东广州510300;广东省妇幼保健院医学遗传中心,广东广州511442【正文语种】中文【中图分类】R446.9遗传病种类繁多，临床表现大多不特异，常规手段诊断困难，常常需要对整个基因组或基因组特定区域进行检测才能起到辅助诊断的作用。
染色体微阵列技术和高通量测序技术作为基因组检测技术的代表，对于遗传病的临床诊断具有重要价值［1-2］，但由于费用和检测周期等问题，临床病例急需一种相对单一的解决方案。
对于孟德尔遗传病，除了种类繁杂的单核苷酸变异（single nucleotide variation，SNV）相关的遗传病外，拷贝数变异（copy number variation，CNV）也与多种遗传病相关［3］。
高通量测序技术虽然针对不同种类的疾病有不同的检测方案，但大多是针对SNV的检测，对于CNV的检测，仍然有较多的争议，大多数的检测方案是依据全外显子组（whole exome）或特定基因包（panel）进行算法优化［4-5］。
虽然不同的算法在特定的病种或群体中显示出一定的有效性，但并未得到广泛认可。
医学外显子组（medical exome）测序，也叫临床外显子组（clinical exome）测序，是指针对目前已知的与遗传病相关的所有基因的编码区及其侧翼区进行捕获后测序［6］。
不同的检测机构依据的数据库版本有差异、采用的捕获策略不同，因此方案设计上会有部分区别，但对于大多数遗传病的检测，尤其是SNV的检测，设计上的差别基本上可以忽略。
然而对于CNV的检测，目前可获得的资料相对较少。
本单位从2015年开始应用医学外显子组测序进行遗传病基因诊断，逐渐建立了较为完善的CNV检测方法，已经在较多病例中得到不断验证。
本文仅以两个家系为例对医学外显子组测序在CNV相关的遗传病基因检测中的可行性进行分析。
1 材料与方法1.1 研究对象家系1（图1A）正常个体1-II-3于2017年8月来我中心咨询，自诉有智力低下家族史：2位哥哥（1-II-1和1-II-2）均为患者。
患者1-II-1（36岁）和1-II-2（34岁）表现为头型偏长（似长方形），智力轻度低下，语言能力差，运动能力正常。
患者1-II-2伴有单侧眼睑下垂，可识汉字，读书到小学5年级，期间成绩较差。
家系2（图1B）患者2-II-1，男，9岁，2016年8月来我中心咨询。
患儿出生时手指、脚趾偏长，指关节屈曲。
1岁时大脑CT提示脑发育异常（未见影像资料），智力评估低下，发育落后，并伴有房间隔缺损，三尖瓣反流（未见影像资料）。
父母带患儿来我中心咨询时身高126 cm，体质量19 kg，身型较瘦，呈特殊面容，眉毛粗短，左眼斜视，舌无法正常外伸，不会讲话，外耳廓呈半圆形，耳位偏低（图2）。
患者弟弟2-II-2正常，男，7岁。
1.2 方法1.2.1 样本采集经患者及家属知情同意，采集家系1、2患者和父母及部分正常个体外周血2 mL（EDTA-Na抗凝）。
取得家系1患者基因结果后，抽取个体1-II-3妻子腹中胎儿1-III-1脐血1 mL（孕26+周时）。
使用德国Qiagen公司生产的Qiamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒进行基因组DNA提取（操作步骤参照试剂盒说明书）。
1.2.2 脆性X综合征基因检测 FMR1基因CGG三碱基重复数检测，采用德国Roche公司生产的Expand Long Template PCR System试剂盒进行PCR扩增，反应条件：98 ℃ 10 min，循环数1；97 ℃ 35 s，64 ℃ 35 s，68 ℃ 4 min，循环数 10；97 ℃ 35 s，64 ℃ 35 s，68 ℃ 4 min（每个循环增加20 s），循环数25；68℃10 min。
后经毛细管电泳（ABI 3 500-XL测序仪）进行片段长度判断，最后计算CGG三碱基重复数。
图1 两个家庭的家系图Fig.1 Pedigree for the two families图2 病例2-Ⅱ-1部分表型Fig.2 Photos of patient 2-Ⅱ-11.2.3 染色体核型分析采用G显带技术对外周血进行常规核型分析（500～550条带）。
1.2.4 染色体微阵列分析（chromosome microarray analysis，CMA）使用美国Affymetrix公司生产的CytoScan 750 k芯片和扩增、杂交试剂盒进行CMA检测。
参照Infinium HD Assay标准操作流程进行操作，检测结果使用Chromosome Analysis Suite（Ch AS；version 2.1）软件进行分析。
结果判读参照DGV、ISCA、OMIM、DECIPHER等数据库。
1.2.5 医学外显子组测序取质检合格的1 μg基因组DNA于Q800R超声破碎仪中打断，电泳质检打断后DNA片段大小为500 bp以下，峰值在350 bp左右。
参照KAPA library Preparation kit Illumina platforms条件及方法进行文库构建：在DNA扩增酶的作用下进行末端修复，3’端加“A”，并在两端加上特定序列的接头，不同样本连接不同序列的barcode，经PCR对带有接头的文库扩增。
Qubit测定文库浓度，每例样本取300 ng进行混合。
往混合后样本中加入基于NimbleGen SeqCap技术的定制探针（Roche NimbleGen，Madison，Wis），杂交 24 h后，采用 Streptavidin Dynabeads进行目标区域捕获，并将捕获后产物进行纯化，PCR富集目标区域基因。
琼脂糖凝胶电泳测定文库大小，Qubit3.0及荧光定量PCR测定文库浓度。
将质检合格的文库稀释至上机测序浓度，使用Illumina Nextseq 500测序仪进行测序分析。
1.2.6 捕获区域CNV分析使用NextGene对测序原始数据进行转换，生成质控文件，对低质量的测序数据（样本编码序列平均覆盖度小于3×的数据）进行剔除。
然后，通过均一化计算，分析出单（多）个外显子的拷贝数变化，方法依据Feng 等［7］发表文献，简要如下：收集每个样本的单个外显子所有DNA单个碱基信号，得出单个外显子的平均覆盖深度，然后对比参考样本中特定外显子的覆盖深度，进而得到拷贝数变异数据。
理论上，正常水平标注为1，即正常；缺失一个拷贝标注为0.5，即杂合缺失；缺失2个拷贝标注为0，即纯合/半合缺失。
实际检测到的杂合缺失平均值为0.55±0.07。
参考序列版本号：GRCh37/hg19，根据美国医学遗传学学会（American college of medical genetics，ACMG）指南［8］，对 SNVs和 CNVs进行评估和致病性分类。
2 结果2.1 家系12.1.1 脆性X染色体综合征基因检测首先对患者1-II-2进行脆性X基因检测，结果为阴性（结果未显示）。
2.1.2 医学外显子组测序考虑家系正常个体1-II-3妻子当时已妊娠20周，为节省检测时间，征得家属同意后，行核心家系临床医学外显子组（约4 000个已知致病基因）的综合检测和分析（1-I-1、1-I-2、1-II-2）。
共检测50 585 个编码区，8 423 367 bp。
平均覆盖深度344×±218，大于10×覆盖区间占99.1%，大于20×覆盖区间占98.8%。
结果发现患者1-II-2 7q36.3区域有约3.14 Mb的杂合缺失片段（chr7：155 595 594-158 738 470；图3A），16p13.3区域有大约11.4 kb的杂合缺失片段（chr16：215997-227410；图3B），同时19p13.3区域有大约330.8 kb的重复片段（拷贝数为3）（chr19：589946-920748；图3C）。
其中7q36.3区域3.14 Mb片段的杂合缺失和19p13.3区域330.8 kb片段的重复未在父母中检测到，16p13.3区域11.4 kb片段的杂合缺失遗传自母亲。
图3 利用NGS覆盖深度进行综合CNV分析Fig.3 CNV analysis data after medical exome sequencing图4 家系2患者胞弟（2-II-2）外周血核型图Fig.4 Karyotype of 2-II-22.1.3 染色体微阵列分析为明确家系患者病因，根据高通量测序结果，对患者1-II-1、正常个体1-II-3及其妻子腹中胎儿1-III-1同时进行了CMA检测。
结果发现患者1-II-1存在7q36.2-q36.3区域约4.5 Mb的杂合缺失片段（chr7：154655991-159119707）合并19p13.3区域约841 kb的重复片段（chr19：260911-1102063）；正常个体1-II-3及其胎儿未检测到明确异常。
2.2 家系22.2.1 医学外显子组测序核心家系（2-I-1、2-I-2、2-II-1）进行临床医学外显子组（约4000个已知致病基因）综合检测和分析。
共检测50585个编码区，8423367 bp。
平均覆盖深度220×±127，大于10×覆盖区间占99.0%，大于20×覆盖区98.7%。