DNA提取过程中各种试剂的作用及原理学习资料
DNA提取过程中各种常用试剂的作用
DNA提取过程中各种常用试剂的作用
1.破碎细胞的试剂
细胞破碎是DNA提取中的第一步，它破坏细胞壁和细胞膜，释放出胞外DNA。
常见的细胞破碎试剂有:
-细胞裂解液:包含高浓度的盐离子，用于破坏细胞膜和胞外结构。
-磷酸盐缓冲液:调节溶液的pH值，维持酶的活性和反应性。
2.脱脂肪试剂
脂肪在DNA提取过程中会干扰其纯化和测量结果。
因此，需要使用脱脂肪试剂来去除脂肪。
常见的脱脂肪试剂有:
-酚/氯仿:用于分离DNA溶液中的有机相，其中含有脂肪和蛋白质。
-异丙醇/乙醇:能够沉淀DNA，可去除脂肪和蛋白质。
3.蛋白质降解试剂
蛋白质的存在会对DNA的纯化和测量产生干扰。
因此，在提取DNA之前，需要使用蛋白酶来降解蛋白质。
常见的蛋白质降解试剂有: -蛋白酶K:能够特异性地降解蛋白质，而不会对DNA产生破坏。
4.DNA沉淀和纯化试剂
在DNA提取的最后阶段，需要使用试剂使DNA沉淀并纯化。
这些试剂帮助去除杂质，如蛋白质、RNA和其他杂质。
常见的DNA沉淀和纯化试剂有:
-氯化钠:用于提高DNA的溶液的离子强度，促进DNA的沉淀。
-吐温-20:用作高盐缓冲液的成分，以帮助稳定沉淀的DNA。
-乙醇/异丙醇:用于沉淀DNA。
由于DNA具有亲和力，可以与乙醇或异丙醇结合形成可见的沉淀。
5.纯净水和缓冲液
纯净水是在整个实验过程中用来制备溶液和洗涤DNA的必要试剂。
此外，缓冲液用于维持溶液的pH值，以提供适宜的环境来发挥其他试剂的作用。
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理修订稿
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理修订稿下面是DNA提取过程中各种试剂的作用及原理的详细解释：1. 胰蛋白酶（Proteinase K）：在DNA提取过程中，胰蛋白酶主要用来消化蛋白质。
在胰蛋白酶作用下，会将蛋白质降解为小片段，从而释放出DNA。
胰蛋白酶对于许多细胞外蛋白质以及细胞核和线粒体内的蛋白质都有较高的活性，因此在DNA提取中常常使用胰蛋白酶来消化蛋白质。
2.细胞裂解缓冲液：细胞裂解缓冲液主要含有一些表面活性剂和盐，它的作用是破坏细胞膜和核膜，释放出细胞内的DNA。
其中的表面活性剂可以破坏细胞膜的脂质双层结构，使细胞裂解，而盐对于细胞内的离子平衡起到保护作用。
3.蛋白质沉淀剂（如盐和高浓度乙醇）：DNA提取过程中，蛋白质沉淀剂的主要作用是沉淀DNA溶液中的蛋白质。
这些沉淀剂可改变DNA和蛋白质的溶液环境，使DNA与蛋白质相互作用并形成沉淀。
通过离心可以分离出DNA沉淀。
4.蛋白酶抑制剂（如蛋白酶抑制剂PMSF）：蛋白酶抑制剂的作用是抑制在DNA提取过程中可能存在的DNA酶类，避免它们降解提取的DNA。
PMSF是一种有效的蛋白酶抑制剂，具有抗蛋白酶A、蛋白酶K和胰蛋白酶等多种蛋白酶的活性。
5.去蛋白化剂（如十二烷基硫酸钠，SDS）：去蛋白化剂的作用是在细胞裂解后去除DNA溶液中的蛋白质。
SDS是一种表面活性剂，可以破坏蛋白质的结构，使其失去功能，并分散在DNA溶液中。
这样，可以将蛋白质与DNA分离。
6.胱硫酸：胱硫酸的作用是抑制DNA提取过程中可能存在的DNA酶类的活性。
DNA酶是一类能够降解DNA的酶，胱硫酸具有抑制DNA酶的活性。
通过加入胱硫酸可以保护提取的DNA不受DNA酶的降解。
7.离心管：离心管在DNA提取过程中主要用于离心，通过离心可以将DNA与其他物质分离。
离心过程中，DNA颗粒被推向离心管底部，其他物质则沉淀在上层。
离心过程中加入离心管中的试剂会与DNA颗粒一同移动，从而实现DNA的纯化。
核酸提取常见试剂的作用原理
异硫氰酸胍--（二）强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。
胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。
含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。
在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。
盐酸胍、尿素盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它并不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的RNA 从富含RNase的组织中提取出来。
4-8M可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起N-D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。
高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸钠使蛋白质解体变性巯基试剂1防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。
DTT，DDTE、巯基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的还原剂，同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。
DNA提取中，常使用巯基乙醇，维持缓冲液的还原环境，防止多酚类氧化，由于具有一定的毒性，浓度不应高于2%。
巯基乙醇β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键）。
1 还原蛋白质二硫键，使Rna酶变性2 抑制酚类氧化，若氧化，核酸会变成灰黑色，苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3 保护蛋白质的巯基蛋白质提取中需要巯基乙醇还原二硫键，使RNA酶失活化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键，不能使蛋白质彻底变性加上还原剂巯基乙醇或DTT，能还原二硫键，使RNA彻底变性DTT二硫苏糖醇刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理大家好，今天我们来聊聊DNA提取过程中的各种试剂，它们到底是怎么发挥作用的呢？别着急，我会用最简单易懂的语言，让大家轻松掌握这些知识。
我们要了解DNA是什么。
DNA,就是脱氧核糖核酸，是生物体内遗传信息的载体。
那么，DNA提取又是什么呢？简单来说，就是从生物体中提取出DNA分子的过程。
这个过程包括了很多步骤，而试剂则是其中的关键环节。
接下来，我们就来看看这些试剂都是怎么发挥作用的吧！1. 细胞破碎剂在DNA提取过程中，首先要将生物体破碎成碎片，这样才能方便后续的提取操作。
而细胞破碎剂就是用来实现这个目的的。
它们的作用就是破坏细胞膜和细胞壁，让细胞内的DNA分子释放出来。
常用的细胞破碎剂有胰蛋白酶、胶原蛋白酶等。
大家可能会问，这些酶是怎么把细胞破碎的呢？其实，这些酶能够识别并分解细胞内的特定蛋白质，从而达到破坏细胞的目的。
不同的酶对不同类型的细胞也有不同的作用效果，所以在实验中需要根据实际情况选择合适的酶种。
2. 洗涤剂在细胞破碎后，我们还需要将释放出来的DNA分子进行纯化。
这时候，洗涤剂就派上用场了。
洗涤剂的作用就是去除细胞碎片、蛋白质等杂质，使得DNA分子更加纯净。
常用的洗涤剂有TE缓冲液、PBS等。
这些洗涤剂都有一个共同的特点，那就是能够溶解很多物质，包括DNA分子在内。
因此，通过多次洗涤，我们就可以有效地去除杂质，提高DNA的纯度。
3. 聚乙二醇(PEG)在纯化DNA的过程中，还有一个关键的试剂就是聚乙二醇(PEG)。
PEG是一种非常特殊的溶剂，它可以与水形成氢键，使得DNA分子在水中保持悬浮状态。
这样一来，我们就可以通过离心等方法将不同纯度的DNA分离开来。
而且，PEG还可以调节DNA 的亲和力，使得某些特定的DNA结合得更加紧密。
这对于后续的PCR扩增等实验非常重要。
4. DNA连接酶在纯化出目标DNA后，我们还需要将其与其他DNA片段进行连接。
这时，DNA 连接酶就派上用场了。
DNA提取个步骤作用原理
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液I :50mM 葡萄糖，25mMTris-HCI(pH8. "0)，10mMEDTA(pH8."0)。
1MTris-HCI<!--[if !supportAnnotations]-->[t1]<!--[endif]--> (pH8."0)12."5mI，0."5M EDTA(pH8.0）10ml，葡萄糖4."730g,加ddH20至500ml。
在10lbf/in2 高压灭菌15min，贮存于4C。
dna提取试剂盒原理
dna提取试剂盒原理DNA提取试剂盒是一种用于从生物样本中提取DNA的化学试剂盒，其原理是利用试剂盒中的各种试剂和材料，通过一系列化学反应和物理处理，将DNA从细胞中分离出来，从而实现DNA的提取和纯化。
首先，DNA提取试剂盒中通常包含有裂解液，用于破坏细胞膜和核膜，释放细胞内的DNA。
裂解液中的成分通常包括离子性洗涤剂和蛋白酶，能够有效地破坏细胞膜和核膜，使DNA得以释放。
接着，试剂盒中还包含有沉淀剂，用于沉淀DNA。
沉淀剂通常是乙醇或异丙醇，能够与DNA形成复合物，使DNA沉淀到溶液底部。
此外，试剂盒中还包含有洗涤缓冲液，用于去除沉淀物和其他杂质，最终得到纯净的DNA。
在实际操作中，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取通常需要按照以下步骤进行，首先，将待提取的生物样本加入裂解液中，使细胞裂解并释放DNA。
接着，加入沉淀剂，使DNA沉淀到溶液底部。
然后，将上清液倒出，加入洗涤缓冲液进行洗涤，最终得到纯净的DNA。
DNA提取试剂盒的原理简单而有效，能够快速、高效地从各种生物样本中提取DNA。
它广泛应用于分子生物学、遗传学、法医学等领域，为科研和临床诊断提供了便利。
同时，随着技术的不断进步，现代的DNA提取试剂盒已经具有了更高的纯度和更快的操作速度，为科研工作者和临床医生提供了更好的工具和支持。
总的来说，DNA提取试剂盒的原理是基于化学和物理的方法，通过一系列的步骤将DNA从生物样本中提取出来。
它的应用范围广泛，操作简便，是现代生物学研究和临床诊断中不可或缺的工具之一。
随着科学技术的不断发展，相信DNA提取试剂盒会在未来发挥更加重要的作用，为人类健康和科学研究做出更大的贡献。
DNA提取方法和试剂作用详解
1试剂的作用氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
2 DNA提取分为三个基本步骤每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。
.细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。
方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。
利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。
加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA 结合的组蛋白。
将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。
另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。
DNA提取的几种方法(1).浓盐法A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1. 细胞裂解缓冲液（Cell Lysis Buffer）：作用：细胞裂解缓冲液用于破坏细胞膜和细胞核膜，并释放细胞内的DNA分子。
原理：细胞裂解缓冲液主要含有非离子性洗涤剂（如Triton X-100和Tween-20）和盐溶液（如NaCl）。
洗涤剂可以溶解和破坏细胞膜，并释放内部的细胞器和DNA。
高盐浓度可破坏细胞核膜，进一步释放核内的DNA分子。
2. RNase A缓冲液（RNase A Buffer）：作用：RNase A缓冲液用于降解细胞内的RNA分子，以避免在DNA提取过程中的RNA污染。
原理：RNase A是一种内切核糖核酸酶，可以特异性地水解单链的RNA。
在DNA提取中，RNase A会降解细胞裂解液中的RNA分子，使其无法干扰后续DNA的纯化步骤。
3. 蛋白酶K缓冲液（Proteinase K Buffer）：作用：蛋白酶K缓冲液用于分解和去除DNA周围的蛋白质。
原理：蛋白酶K是一种特异性的蛋白酶，可以水解蛋白质。
在DNA提取中，蛋白酶K会分解细胞裂解液中的蛋白质，包括DNA结合蛋白和酶，以便纯化DNA。
4. 盐溶液（Salt Solution）：作用：盐溶液用于沉淀DNA分子，将其从细胞裂解液中分离出来。
原理：DNA可以在高盐浓度下形成沉淀，并从溶液中沉淀出来。
通过加入盐溶液，DNA分子会和盐结合形成可见的凝胶状物质（DNA凝胶）。
5. 酒精沉淀缓冲液（Ethanol Precipitation Buffer）：作用：酒精沉淀缓冲液用于使DNA形成可见的物质，并沉淀下来。
原理：通过将酒精加入DNA溶液中，可以改变溶液的物理性质，使DNA凝析成不可溶的颗粒，从而方便后续的离心沉淀。
6. 纯化缓冲液（Purification Buffer）：作用：纯化缓冲液用于洗涤和纯化沉淀下来的DNA样品。
原理：纯化缓冲液中含有适当的离子浓度和pH值，可以提供适当的条件，以去除影响DNA纯化的杂质。
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
DNA提取过程xx各种试剂的作用及原理1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖xx的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液xxpH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。
用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。
前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
DNA提取过程中所用试剂的机理
DNA提取过程中所用试剂的机理1.溶菌酶的作用机制是溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。
也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。
对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。
溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。
简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。
2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。
SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；c. 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。
质粒提取常见问题1．溶液I—溶菌液：a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
C. EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
各种检材DNA的提取
酚-氯仿法——注意事项
酚-氯仿法是目前最常用、最可靠的方法之一，无论 是血液还是血痕标本均适用 所提取的DNA纯度高，可满足各种分子生物学检测技 术的需要
但该法操作较为繁琐、耗时长，影响了其在实践工作 中的广泛应用。
（三）碱性裂解法
碱性裂解法是指在强碱作用下，使构成细胞的蛋白质 成分谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸残基等迅 速发生电离，从而快速破坏蛋白质的一级结构。 检材在强碱性pH条件及一定温度状况下能迅速破碎细 胞膜及核膜，使核酸酶变性及DNA释放。
Chelex-100法——步骤
取适量血痕检材置1.5ml EP管中，加入1ml 灭菌无菌 水浸泡20min，>10000rpm离心3min，用1000ul进样器 小心地吸去上清液。 加5％chelex-100 200u1，于水浴锅中56℃水浴30min， 振荡混匀。 沸水中煮10min，取出后立即置于冰上3min，>10000 rpm离心1min。上清液即为DNA提取液，可在2-6℃保 存1个月，在-20℃长期保存。
酚-氯仿法——步骤
取适量血痕检材置于1.5ml EP管中，加入1ml 无菌水 浸泡20min，>10000rpm离心3min，弃去上清。 加入500μ l STE液悬浮沉淀物，加入20μ l 10 % SDS 及10 mg/ ml 蛋白酶K 4 μ l ，54℃水浴消化3小时
离心取上清液至另一EP管中，加入500μ l苯酚/氯仿/ 异戊醇混合物，振荡到出现絮状物，>10000rpm离心 3min。
各种检材DNA的提取
夏
水
秀
一、DNA的提取方法
核酸提取常见试剂地作用原理
核酸提取常见试剂地作用原理核酸提取是分离纯化DNA或RNA的过程，以获得高质量的核酸样品用于进一步的分子生物学实验。
核酸提取的常见试剂主要有细胞裂解缓冲液、蛋白酶、溶剂和混合物。
下面将详细介绍这些常见试剂的地作用原理。
1.细胞裂解缓冲液：细胞裂解缓冲液主要包含盐、缓冲剂、洗涤剂和螯合剂等成分。
其主要作用是破坏细胞膜和核膜，使细胞释放出核酸。
细胞裂解缓冲液中的盐通过渗透压作用使细胞膜破裂，使细胞内部的核酸暴露在外。
缓冲剂可以调节溶液的酸碱度，使其维持在适合核酸稳定的范围内。
洗涤剂的作用是将细胞中的脂质和蛋白质溶解，进一步破坏细胞膜。
螯合剂能够与金属离子形成配合物，阻止金属离子催化核酸降解反应。
2.蛋白酶：蛋白酶一般用于去除核酸提取过程中的蛋白质污染物。
蛋白酶能够水解蛋白质，将其分解成氨基酸和小肽，从而达到去除蛋白质的目的。
在核酸提取过程中，蛋白酶通常添加在核酸的溶解和洗涤步骤中，以去除细胞中的蛋白质。
3.溶剂：在核酸提取过程中，常用的溶剂有酚、异丙醇和乙醇等。
这些溶剂的作用是通过改变核酸和其他杂质的溶解特性，从而实现纯化目的。
酚能够溶解DNA，并与蛋白质形成复合物，其中DNA会在酚的上层，而蛋白质则在下层。
异丙醇和乙醇主要用于沉淀和纯化核酸。
添加这些溶剂后，核酸会从溶液中析出形成沉淀，然后可以通过离心沉淀核酸，将杂质剔除。
4.混合物：核酸提取中常用的混合物有实验用试剂盒等。
实验用试剂盒通常包含多种试剂和材料，提供了从细胞裂解到纯化核酸的全部步骤。
这些试剂盒经过精心配置，能够实现快速、高效和可靠的核酸提取。
其中的各种试剂按照特定的顺序和比例添加，以实现细胞裂解、去除蛋白质、去除杂质、沉淀核酸等步骤。
总的来说，核酸提取的常见试剂通过不同的地作用原理实现细胞裂解、去除蛋白质和杂质、纯化核酸等功能。
这些试剂能够有效地提取出高质量的DNA或RNA，为后续的分子生物学实验提供可靠的基础。
DNA提取过程中所用试剂的机理
1.溶菌酶的作用机制是溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。
也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。
对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。
溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。
简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。
2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。
SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；c. 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。
质粒提取常见问题1．溶液I—溶菌液：a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
C. EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1-溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖昔水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的B-1,4糖昔键，因而真总溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压'防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2+. Ca2+等金属离子，拗制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作舷）；（2） EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2.溶液 II-NaOH-SDS 液：NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH>12或pH〈3时，就会引起双链之间氢鍵的郴而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0. 2mol /L,加抽提液时，该系统的pH就高达 12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解趣胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为RP-S03-…R+-蛋白质的复合物，蟆蛋白质变性磁旋下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3.溶液HI—3mol/L NaAc （pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节 pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。
用pH4. 8的NaAc溶液是为了把pH12. 6 的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
而髙盐的3mol / L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。
前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS—蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
DNA提取中各种实验试剂作用原理
DNA提取中各种实验试剂作用原理1.细胞破碎缓冲液：细胞破碎缓冲液主要由高渗溶液（如盐溶液）和蛋白酶等组成。
高渗溶液的作用是通过渗透压的变化使细胞膜破裂，从而释放细胞内的DNA。
蛋白酶则可以降解细胞膜和细胞核等蛋白质，以避免蛋白质的干扰。
2.蛋白酶：蛋白酶是一种水解蛋白质的酶，可以降解DNA提取过程中的蛋白质，如细胞膜和核蛋白等。
蛋白酶的作用是将蛋白质分解成小分子，使其能够被其他试剂更容易地去除或分离。
3.EDTA缓冲液：EDTA是一种螯合剂，可以与金属离子形成稳定的络合物。
在DNA提取中，EDTA能够与细胞质中的酶和其他金属离子结合，从而抑制DNA的降解和酶的活性。
此外，EDTA还具有稳定细胞膜结构的作用，有助于维持细胞的完整性。
4.蛋白酶K：蛋白酶K是一种特定的蛋白酶，能够降解细胞膜和细胞核中的蛋白质。
在DNA提取中，蛋白酶K的作用是去除细胞膜和细胞核中的蛋白质，使DNA从细胞内被释放出来。
5.胰蛋白酶：胰蛋白酶是一种常用的消化酶，能够特异性地水解蛋白质的胶原、凝血蛋白和纤维蛋白等。
在DNA提取中，胰蛋白酶的作用是降解细胞膜和细胞核中的蛋白质，从而使DNA充分暴露，并便于后续的提取步骤。
6.盐溶液（如NaCl溶液）：在DNA提取中，盐溶液的作用是通过渗透压的变化使细胞膜破裂，从而释放细胞内的DNA。
盐溶液具有高渗透压，能够使细胞膜发生渗透压失衡，导致细胞膜破裂并释放细胞质，包括DNA分子。
7.酒精：酒精是DNA提取中用于沉淀DNA的试剂。
通过在DNA溶液中添加酒精，可以使DNA分子结合成不溶于水的颗粒。
酒精中的醇与DNA结合时会形成弱的静电吸引力，促使DNA分子聚集，形成可见的白色颗粒。
8.离心管：离心管在DNA提取过程中用于离心沉淀DNA。
通过离心作用，DNA分子被迅速沉淀到管底，而其他杂质则留在上层液体中。
离心能够有效分离DNA和其他组织细胞碎片等杂质，使得DNA可以更纯净地得到提取。
综上所述，DNA提取中各种试剂的作用原理不同，但它们的共同目标都是使DNA从细胞中得到分离和提取。
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。
用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。
前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
DNA提取所用试剂作用
DNA提取所用试剂作用DNA提取是对细胞中的DNA分子进行纯化和分离的一种实验操作，以获得高质量的DNA样本，并用于后续的分析和研究。
DNA提取的目的是通过破坏细胞膜和蛋白质、溶解核酸蛋白复合物等步骤，将DNA从细胞中释放出来，并去除其他的细胞组分。
对于DNA提取，常用的试剂有细胞裂解液、蛋白酶、脂脢酶、EDTA、盐溶液、异丙醇、以及各种洗涤缓冲溶液等。
首先，细胞裂解液是DNA提取过程中最重要的试剂之一，它能够破坏细胞膜和核膜，以将DNA释放出来。
细胞裂解液通常是由含有各种离子和酶的缓冲溶液组成，它们可破坏细胞膜的完整性，并用于去除细胞蛋白等杂质。
常见的细胞裂解液有含有离子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲盐溶液），TE（三甲基乙酸和EDTA）缓冲液。
这些离子对细胞膜有破坏作用，有助于释放DNA。
其次，蛋白酶是DNA提取中的另一个重要试剂。
蛋白酶可以降解蛋白质，去除细胞中的蛋白质杂质和核酸蛋白复合物。
常见的蛋白酶有蛋白酶K和蛋白酶酶解剂，它们能够迅速降解细胞中的核酸蛋白复合物，使DNA从中得以解脱。
脂脢酶是DNA提取中常用的试剂之一，它可以降解细胞膜上的脂肪酸酯，以防止DNA粘连在脂层上。
脂脢酶会切断细胞膜上的磷脂酰胆碱酯键或磷脂酰酸酯键，从而破坏脂质层结构，使DNA能够容易地释放出来。
EDTA（乙二胺四乙酸）是DNA提取中常用的螯合剂，它可以减少细胞裂解液中的金属离子对DNA酶的抑制作用。
EDTA可以与金属离子（如Mg2+和Ca2+）形成络合物，从而降低它们与DNA酶的结合，减少酶的抑制作用，有助于保护DNA不被降解。
盐溶液在DNA提取中也起到重要的作用。
盐溶液可以用于调节DNA溶液的离子强度，促使DNA分子在溶液中形成凝胶状，从而有利于DNA的分离和纯化。
常见的盐溶液有NaCl溶液和TE缓冲液。
异丙醇是一种有机溶剂，常用于DNA提取的沉淀步骤中。
在向DNA溶液中加入异丙醇时，DNA会从水相逐渐转移到有机相中，形成可见的DNA沉淀。
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D N A提取过程中各种试剂的作用及原理
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理
1．溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降
DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利
2．溶液II－NaOH－SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有：
（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中
（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH
4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。
用pH4.8的NaAc溶液是为了把
pH12.6的抽提液，调回pH至中性，
使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、
RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。
前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，
后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，
乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。
因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。
但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，
尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。
折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，
最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。
也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。
一般在室温下放置15－30分钟即可。
5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？
在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，
减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，
只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，
其效果也不好。
在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，
必须要进行洗涤或重沉淀。
6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？
加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。
也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。
在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。
7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？
在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。
磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定。
氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫。
氯仿是强蛋白质变性剂，抑制RNA酶的活性，除去蛋白质污染。
基因组DNA- CTAB法
CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.
在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.
注:CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃.
基因组DNA- CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;
CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除
基因组DNA- CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.
基因组DNA的提取核酸分离,纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提供相应的缓冲体系采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔离心分离两相时,应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取核酸分离,纯化
蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS,异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯化
多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高盐可溶解多糖.用多糖水解酶将多糖降解.在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 .用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ,冰浴20min.核酸分离,纯化
多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇,抗坏血酸,半胱氨酸,二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合
盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNasepH值为8.0,可防止DNA发生酸解。
基因组DNA提取常见问题
DNA中含有蛋白,多糖,多酚类杂质DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子有RNA的存留原因对策重新纯化DNA,过吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等杂质重新沉淀DNA,让酒精充分挥发增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)加入RNase降解RNA
问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应.DNA提取常见问题材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融。
尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富
的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融
问题二:DNA降解.DNA提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时DNA丢失。
尽量选用新鲜(幼嫩)的材料动植物要匀浆研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁.高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量).增加吸附的时间,或低温沉淀小心操作
问题三:DNA提取量少.。