生物传感器和生物芯片_生物大分子诊断的领域

文章编号:1007-4287(2005)04-0645-04

生物传感器和生物芯片:生物大分子诊断的领域

易　萍,李　力

(第三军医大学大坪医院野战外科外研所妇产科,重庆400042)

基金项目:973项目资助(2001C B510305)

1　生物传感器

111　生物传感器的概述　用固定化的生物体成分(酶、抗

原、抗体、激素)或生物体本身(细胞、细胞器、组织)作为敏感元件,对待测物质进行分析和检测的传感器称为生物传感器[1]。传感器主要由敏感器(分子识别元件)、信号转换器

(换能器)和电子线路三部分组成[2]。当待测物质经过具有

分子识别功能的敏感器时,传感器所感受的一个变化(如构象、质量等变化)由信号转换器将其转换为与待测物质有关的可测量的信号(如电信号或光信号等)输出,通过电子系统进行处理和显示。生物传感器的质量取决于敏感器的特异性、转换器的灵敏度以及它们的响应时间、可逆性寿命和电子系统的可靠性。

生物传感器一般可以从下面三个角度[1,2]分类:(1)根据传感器输出信号的产生方式分类,可分为催化型生物传感器和亲和型生物传感器。催化型生物传感器是基于固定化的大分子(如酶等)识别底物分子后,将它们转化成可被换能器件响应或检测的化学物质。亲和型生物传感器是基于生物大分子与被测物质的特异性亲和结合作用,如抗原和抗体、互补的DNA 单链等,使换能器件上固定化基质的物理特性

(电磁性能、热学性能、光学性能,以及质量和厚度等)发生变

化。(2)根据生物传感器分子识别元件上的敏感元件分类,可分为免疫传感器、DNA 传感器、酶传感器、组织传感器、细胞器传感器、微生物传感器等。(3)根据生物传感器的信号,转换器可分为电化学生物传感器(电位型、电流型、电导型)、光学式生物传感器(包括荧光、表面等离子体共振SPR )、热学型生物传感器和质量式生物传感器(包括压电晶体和表面声波型)等。

112　生物传感器的发展状况　上世纪60年代由于酶学研

究的进步,美国电化学分析专家Clark [3]将酶法与各种电化

学传感器结合起来,构成一种新型分析装置“酶电极”(Enz 2yme elecrode )。酶电极是发展最早一类的生物传感器。70年

代G uilbault [4]用压电晶体检测技术直接测定有机磷,灵敏度达到ppb 级。进入80年代后,由于微电子技术的发展,先后开发了化学电阻器、场效应管、光纤、热敏电阻等新型传感器,1983年在有关的论文中首次提出了传感器(sens or )的专业名词。90年代至今,生物技术的迅速发展,生物传感器研究速度、规模和种类更令人瞩目,已发展成为现代生物技术的重要领域之一。目前生物传感器的检测对象从单糖、氨基

酸、核苷酶等发展到更为复杂的多种生物大分子,如多糖、蛋白质、核酸等。在功能方面也已从检测单一指标发展到多通道的多功能生物传感器芯片、集成生物传感器和微型化生物传感器。

2　生物芯片

生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统,使这些分析过程连续化、微型化、集成化和信息化,以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片的概念来自计算机芯片,迄今已有近百家公司从事生物芯片相关工艺、设备及检测手段和软件的发展。是传感器分析的组合。芯片点阵中的每一个单元都是一个传感器的探头,所以传感器技术的精髓都被应用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效率,减少工作量,增加可比性。所以芯片技术也是传感器技术的发展[5,6]。

211　生物芯片的产生　由于最初的生物芯片主要目标用于DNA 序列的测定、基因表达谱和基因突变的检测和分析,因

此当时也称之为基因芯片或DNA 芯片。目前芯片技术已扩展到抗原、组织、活体细胞等非核苷酸领域,以及芯片实验室领域的迅速发展,所以按现状称为生物芯片更符合发展的趋势。基因芯片的概念可追溯到S outhern 印迹技术、N orthern 印迹技术以及点杂交技术,这三种技术都是将核酸样品固定在滤膜上。基因芯片是利用核酸杂交原理检测未知分子,实质是已预先设计的方式固定在载玻片或硅片、塑料片、尼龙膜等上的高密度的寡核苷酸阵列。

俄罗斯科学院恩格尔哈得分子生物研究所和美国阿贡实验室的科学家们最早提出了用杂交法测定核苷酸序列的想法[7]。英国牛津大学生化系的S outhern 等取得了在载体固定寡核苷酸及杂交法测序的国际专利[8]。随后Saiki 等用以膜为载体的反向斑点杂交技术(Reverse D ot Blot ,RDB )对

PCR 扩增的DNA 进行遗传学分析,其实这是低密度膜芯片

原始模型[9]。

1991年A ffymetrix 公司F odor 领导的小组利用光刻技术

与光化学合成技术相结合制造了世界上第一块寡核苷酸基因芯片,并在Science 杂志上首次提出基因芯片的概念[10]。

1995年,第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片在美国S tan ford 大学诞生,标志着基因芯片技术步入了广泛研究和

应用的时期[11]。目前DNA 芯片作为研究最多的一种生物芯片,目前在载体、点样、探针标记、检测技术等许多方面取得了迅速进展。

212　生物芯片的国内外现状　A ffymetrix公司是生物芯片技术的开拓者,早在七八年代即开始研究光引导的原位合成技术,这一技术导致了第一代生物芯片的诞生[10]。高密度基因芯片是最重要的第一代生物芯片,现已扩展到抗原、组织、活体细胞检测等领域。生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统(micro total analytical system)或称芯片实验室(laboratory2on2a2chip),即第二代生物芯片,它具有体积小、重量轻、便于携带、无污染、分析自动化、分析速度快、所需样品和试剂微量化等诸多优点,其潜在应用范围包括高效筛选、环境监测、临床监测、空间生物学、现场分析、生物战争试剂检测、高效DNA测序等等。虽然目前仍处于研究阶段,但由于它显著的优点和潜在的商业价值,代表了生物芯片的发展方向,从刚出现至今发展迅速。目前已见产业化曙光。

当前生物芯片还没有正式进入临床诊断,世界各国科学家正在进行科研竞赛,以便在这个新的“淘金”领域抢得先机。在过去的十年里,美国在这一领域共投入了近20亿美元。美国政府自1998年正式启动生物芯片计划以来,已有美国国立卫生研究院、能源部、国防部、司法部等政府机构,斯坦福大学、MIT、阿尔贡实验室等著名科研机构,以及A ffy2 metrix、Hyseq、Nanogen、Incyte、Caliper等著名生物芯片技术公司参与该项计划。英国剑桥大学、欧亚大公司如G eneric C o. UK、Sequenonom等也正在从事该领域的研究。世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、药物开发和筛选等领域进行了大量的研究,大多数都建立了自己的芯片设备及技术。A ffymetrix公司1998年生产可用于检测HI V抗药性突变以及P53基因突变的高密度生物芯片,目前已有用于研究药物新陈代谢时基因变化的P450芯片及可检测1000种人类S NPs的基因芯片,都已投入商业使用。目前第一代生物芯片已进入实用化、产业化阶段,应用最多的仍然为基因表达谱分析。

我国正式进入生物芯片研究领域是在1998年,现有20多家科研机构及公司从事生物芯片的开发。联合基因公司成功制作了国内第一块基因表达谱芯片和HC V诊断芯片,已申请3200多项基因药物发明专利,包括肿瘤相关基因、肥胖基因受体相关基因、高血压血管紧张素相关基因和老年痴呆症相关基因等极具临床应用和药物开发前景的重要功能基因;中国科学院对光生物传感芯片做了大量的研究;清华大学生物芯片中心,对第二代生物芯片进行大量的研究,已成功研制出可用于样品处理和检测的主动式电磁生物芯片,已在美国获得专利,目前正在从事生物芯片的配套设备和软件的开发,缩微芯片实验室,用于研究分析的各门类微陈列芯片,用于药物筛选和开发的生物芯片平台技术和可植入人体的生物芯片等领域研究,从而标志着国内在芯片研制上已达到世界先进水平,并走向产业化进程。

213　第一代生物芯片　根据芯片检测的对象可分为:DNA 芯片、蛋白芯片、多糖芯片、细胞芯片、组织芯片。因此这些芯片能够从各个层次揭示生命的奥秘。MacBeath和Schr2eiber[12]首先报道了利用蛋白质微型方阵研究蛋白质相互作用及与小分子作用的研究。蛋白芯片是将许多序列不同的多肽或蛋白分子按照预定的位置固定于芯片载体上,通过蛋白或多肽与其特异结合分子的相互作用而实现对样品蛋白或其它配体作用特异性的研究,包括抗原表位分析、蛋白定量检查等。目前蛋白质芯片要解决的问题有:11保持蛋白的活性;21保证蛋白质正确定位;31与现在的mRNA微型方阵研究工具要相兼容[13]。下面只对DNA芯片作一简单的介绍。

最早实现商品化的生物芯片是以基因序列为分析对象的基因芯片。往往称之为DNA微阵列。使用时,待测样品用荧光等方法标记成探针,将探针与芯片上的基因进行杂交、洗涤,杂交后的芯片进行扫描、测定,然后通过计算机处理来检测待测样品的遗传信息,揭示基因与疾病发生、发展的内在关系。DNA芯片技术主要分为三个部分:样品制备、生化反应和结果检测。尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展,得到世人的瞩目,但仍然存在着许多难以解决的问题,例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围较狭窄等问题。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面[14]。

214　第二代生物芯片　芯片实验室是系统集成、微刻技术与纳米生物传感器技术共同发展的结晶,利用微刻技术,诸如微电极、凝胶元件、微陷阱等构成的元件型微阵列和由微通道或反应池等构成的通道型微阵列以及传感器技术已经被整合到芯片实验室中。将生命科学研究中的许多不连续的分析过程,如样品制备,生化反应和结果检测等,移植到芯片中并使其连续化和微型化。一些新型生物芯片如生物电子芯片、凝胶元件微阵列芯片、药物控释芯片、毛细管电泳或色谱芯片、PCR芯片及生物传感芯片等应运而生。下面举出几个比较重要的例子。

21411　生物电子芯片　其基本原理是在硅片上构建电极微阵列,利用电场增强分子之间的杂交。1998年,我国学者程京领导的科研小组用电子式芯片,首次对病人全血进行分析,在电场作用下,血中的大肠杆菌富集到电极上,以高电压脉冲裂解菌体,用蛋白酶K消化后得到纯化的DNA,再转移到另外一张芯片上杂交,证实了大肠杆菌DNA的存在[15]。1999年,G illes等[16]在硅片上蚀刻出电子回路和电极构成芯片,经扩增的病人DNA样品在上芯片转运、浓缩并吸附到特定的电极上形成阵列,并于荧光标记的探针杂交,快速精确的区分了人甘露糖结合蛋白基因中复杂的四等位单核苷酸多态性。电子芯片的最大特点是杂交速度快,可大大缩短分析时间,但制备复杂,成本较高。

21412　凝胶元件微阵列芯片　该芯片又称凝胶组分微阵列芯片,由美国能源部阿尔贡国家实验室和俄罗斯恩格哈特分子生物研究所联合研制。方法是先在玻璃片基上制备聚丙烯酰胺凝胶垫板,用划线器雕刻出凝胶元件微阵列,再用毛细管把DNA加载到凝胶元件上形成分子阵列,并于荧光标记的靶DNA杂交。理论上1平方厘米的片基上可容纳2～3万个40微米×40微米的凝胶元件。该芯片可直接用于突变