第二章 微生物的保护和保藏

第二章 微生物资源的保护和保藏
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一、微生物资源保护
微生物资源与人类生态系统
微生物资源保护的重要性
微生物资源保护策略
微生物多样性保护策略具有广泛的领域和规模，然而这一过程通常分成三个基本部分：抢救微生物多样性；研究微生物多样性；持续、合理地利用微生物多样性。
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云南大学云南省生物资源保护与利用重点实验室
已建成西南微生物种质资源库、基因与蛋白、微生物发酵和次生代谢产物研究平台。现拥有2栋独立科研大楼，总面积达5800平方米以上。设备总值达3000多万元。
实验室的主要研究方向及研究领域为：
（1）特色生物的物种与遗传多样性：特色生物的基因多样性，物种演化和区系演变的规律及其与地理环境变化的关系；动物、植物与微生物协同进化的关系与规律；特色生物资源保护的策略。
（2）资源微生物利用的基础理论与关键技术：具重要应用前景的微生物资源评估和生物学基础研究；微生物基因工程菌构建及产业化开发；植物寄生线虫微生物农药研究；具活性的微生物次生代谢产物及先导化合物研究。
（3）生物多样性的生态功能与修复：污染及极端环境中植物、微生物的抗性、适应及多样性变化机制；山区土地植被变化与生物多样性维持 ；关键区域受损生态系统的退化机制与恢复。
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微生物资源与人类生态系统
生态系统
在一定时间和空间内，生物与其生存环境以及生物与生物之间相互作用，彼此通过物质循环、能量流动和信息交换，形成的一个不可分割的自然整体。
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微生物与人类生态系统的相互影响
微生物对人类生态系统的影响
自然生态系统的主要分解者
自然界中元素的平衡者
土壤肥力的保持者
人类生态系统对微生物的影响
环境影响自然界微生物的生存
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微生物资源保护的重要性
维持生态系统平衡
推动生物技术发展---生物酶等
基因资源库
大量微生物资源尚需发掘
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微生物资源保护策略
天然微生物资源的保护
保护微生物的栖息生存环境
生产菌种和专利菌种的保护
知识产权保护
加强微生物资源保护法律法规建设和宣传工作
把微生物资源作为国家的战略资源来认识，开发与保护并重
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目的：确保微生物生产性能稳定、不染菌、不死亡等。

原理：“休眠”
二、微生物物种资源的保藏
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（一）菌种保藏的原理
菌种保藏主要是根据微生物生理生化特点，人工制造环境条件，使微生物代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的休眠状态，即采取低温、干燥、缺氧三个条件，使菌种暂时处于休眠状态。
挑选典型

菌种的优良纯种
一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）
创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）
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几个概念
1. 衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。
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2. 复壮(rejuvenation)

狭义的复壮 是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；
广义的复壮 是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种
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菌种的复壮措施
纯种分离
纯菌落的分离方法（平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法）-菌落纯

纯细胞的分离方法（利用培养皿或凹玻片等作分离小室进行单细胞分离；显微操纵器进行单细胞分离；不长孢子的丝状真菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘疏稀的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管插入菌丝尖端，菌丝尖端切割法进行单细胞分离）-菌株纯
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通过宿主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）
对于寄生性微生物的退化菌株，可通过接种至相应的昆虫或动、植物宿主体内的措施来提高它们的致病性。例如，经过长期人工培养的Bacillusthuringiensis，会发生毒力减退和杀虫效率降低等现象。这时，可将已衰退的菌株去感染菜青虫等的幼虫（相当于一种活的选择性培养基），然后可从病死的虫体内重新分离出典型的产毒菌株。如此反复进行多次，就可提高菌株的杀虫效率。
淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）
有人曾对Streptomycesmicroflavus“5406”抗生菌的分生孢子，采用－10～－30℃的低温处理5～7天，使其死亡率达到80％。结果发现，在抗低温的存活个体中，留下了未退化的健壮个体，从而达到了复壮的目的。
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防止菌种衰退的方法
1 控制传代的次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的次数）：意即尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的几率。
2 创造良好的培养条件：在赤霉素生产菌Gebberellafujikuroi的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺、谷氨酰胺、5′-核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，有防止菌种衰退的效果；在Aspergillusterricola（栖土

曲霉）3．942的培养中，有人曾用改变培养温度的措施，即从28～30℃提高到33～34℃来防止它产孢子能力的衰退。
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3 利用不同类型的细胞进行接种传代：对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种。在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用于接种时，就没有这种现象发生。有人在实践上创造了用灭过菌的棉团轻巧地对Streptomycesmi-croflavus“5406”抗生菌进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止菌种衰退的效果；又有人发现，Aspergillusnidulans（构巢曲霉）如以其分子孢子传代就易退化，而改用子囊孢子移种则不易退化。
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4 采用有效的菌种保藏方法：在用于工业生产的菌种中，重要的性状都属于数量性状，而这类性状恰是最易退化的。即使在较好的保藏条件下，还是存在这种情况。例如，链霉素生产菌——Streptomycesgriseus（灰色链霉菌）ЛC-1以冷冻干燥孢子形式经过5年的保藏，在菌群中衰退菌落的数目有所增加，而在同样情况下，另一菌株773#只经过23个月就降低23％的活性。即使在－20℃下进行冷冻保藏，经12～15个月后，上述773#菌株和另一种环丝氨酸生产菌908#菌株的效价水平还是有明显降低。由此说明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌种生产性状的衰退。
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（二）微生物菌种保藏技术
1. 冷冻干燥或真空干燥保藏；
2. 超低温或在液氮中冷冻保藏；
3.?转接培养或斜面传代保藏；
4. 土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。
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1. 冷冻保藏
冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。
通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。
缺点之一： 是培养物运输较困难。
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冷冻保藏种类
(1) 普通冷冻保藏技术(-20℃)

(2) 超低温冷冻保藏技术(-60 ℃～-80℃)

(3) 液氮冷冻保藏技术 (-196 ℃)
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超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。
在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；
2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；
3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；
4．混匀后分装入冷冻试管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。

某些细菌和真菌菌种可通过此法保藏5年而活力不受影响。
方法：菌种培养 → 15~30%甘油

缓冲液悬浮 → 加入保藏管中 → 置 -70℃冰箱保藏
措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油）
适用：细菌、酵母菌
保藏期：约10年
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液氮冷冻保藏技术
方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中 → 置液氮瓶中
措施：超低温（-196℃）、保护剂
适用：各大类
保藏期：>15年

在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。
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2. 冻干保藏
冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一
冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。
大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。
方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安醅管中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg） → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏
措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂
适用：各大类
保藏期：5~15年或更长
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培养物的冻干过程
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3. 其他保藏方法
(1)斜面保藏法
方法：接种适宜斜面培养基 → 培养 → 4℃保藏
措施：低温：4℃
适用：各大类
保藏期：1~6个月
用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间
(2)石蜡油封藏法
方法：斜面或半固体接种 → 培养 → 加无菌液蜡高出培养 基1cm→4~15℃保藏
措施：低温，隔氧
适用：不能利用石油的各大类
保藏期：1~2年
优点：简便
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(3)砂土管保藏法
方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干燥→ 封口 → 保藏
措施：无营养，缺氧，干燥
适用：产孢子（芽孢）微生物
保藏期：1~10年
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4. 基因工程菌的保藏
由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。

一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。
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当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。

基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。
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菌种保藏注意事项
所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。

在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的

可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。
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对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。
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加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。

成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。
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几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称 主要措施 适宜菌种 保藏期 评价
冰箱保藏法（斜面）
冰箱保藏法（半固体）
石蜡油封藏法*
沙土保藏法

冷冻干燥法 低温
低温
低温、缺氧
干燥、无营养

干燥、无氧、低温、有保护剂 各大类
细菌、酵母菌
各大类**
产孢子微生物

各大类 3~6月
6~12月
1~2年
1~10年

5~15年以上 简便
简便
简便
简便

简便、有效

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广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）的基础上，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
(三）菌种保藏机构的任务
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按微生物用途设立的部分保藏机构（国内）
用途分类 机构名称 英文缩写 所在城市
普通菌种 中国典型培养物保藏中心 CCTCC 武汉
普通菌种 中国科学院微生物所 IMCAS 北京
工业菌种 中国食品发酵工业所 IFFI 北京
农业菌种 中国农科院土壤肥料所 ISF 北京
医学菌种 中国药品生物制品鉴定所 NICPBP 北京
抗生素菌种 四川抗生素工业所 SIA 成都
兽医菌种 中国兽医药品监察所 NCIVBP 北京
林业菌种 中国林业科学研究院 CAF 北京
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布达佩斯条约微生物国际保藏单位（部分）
英文缩写 机构英文名称
ATCC American Type Culture Collection （USA）美国典型 微生物菌种保藏中心
CCTCC China Central for Type Collection （China 中国武汉大学）中国典型培养物保藏中心专利微生物保藏机构，受理国内外用于专利程序的微生物保藏
CGMCC China General Microbiological Culture Collection Center（China中国中科院微生物研究所）中

国普通微生物菌种保藏管理中心是中国唯一同时提供一般菌种资源服务和专利生物材料保存的国家级保藏中心。
DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkuituren GmbH （Germany）德国微生物菌种保藏中心
NRRL Agricultural Research Service Culture Collection（USA）美国农业研究菌种保藏中心
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