微生物保藏及基本操作技术
snt26322010微生物菌株常规保藏技术规程
微生物菌株常规保藏技术规程随着生物技术的发展，微生物菌株的保藏和管理变得越来越重要。
良好的菌株保藏技术不仅可以更好地保存微生物资源，还可以保证菌株的纯度和活力，为科研工作提供可靠的支持。
建立规范的微生物菌株保藏技术规程至关重要。
下面将介绍微生物菌株常规保藏的技术规程。
一、菌种的准备1. 材料准备：培养基、试管、培养皿、离心管等实验所需的材料。
2. 菌种的提取：从已有培养物中提取所需的菌株，保证菌株的纯度和活力。
3. 菌种的鉴定：通过形态学、生理生化特性等方法对菌株进行鉴定，确保菌株的准确性。
二、菌种的冻存1. 冻存液的制备：选择适合菌株的冻存液，通常为含有甘油或DMSO 的冻存液。
2. 冻存管的准备：在冻存管中加入适量的冻存液，标明菌株的信息。
3. 菌种的冻存：将培养后的菌株接种在含有冻存液的冻存管中，迅速冷冻保存在-80℃或液氮罐中。
三、菌种的复苏1. 冻存管的处理：将冻存管取出，迅速放入37℃的水浴中进行解冻。
2. 菌种的接种：将解冻后的菌株接种在适合的培养基上，进行培养。
3. 菌种的筛选：通过形态学观察和生理生化实验，筛选出复苏后的活力菌株。
四、菌种的长期保存1. 长期保存液的制备：根据菌株的特性选择适合的长期保存液，通常为甘油、DMSO等。
2. 长期保存管的准备：在长期保存管中加入适量的长期保存液，标明菌株的信息。
3. 菌种的长期保存：将培养后的菌株接种在含有长期保存液的长期保存管中，保存在-80℃或液氮罐中。
这就是微生物菌株常规保藏的技术规程。
通过严格的操作流程和丰富的实践经验，可以确保菌株的保藏质量和稳定性，为科研工作提供可靠的菌种资源。
希望以上规程能够对微生物菌株保藏技术的学习和实践有所帮助，也希望广大科研工作者能够不断总结经验，完善菌株保藏技术规程，共同促进微生物资源的高效利用和可持续发展。
微生物菌株的保藏对于科研工作以及工业生产都有着重要的意义。
通过合理的菌株保藏技术规程，我们可以更好地保存微生物资源，保持菌株的活力和纯度，为科学研究和应用提供可靠的支持。
微生物菌种的保存方法
微生物菌种的保存方法微生物菌种如何保存呢?下面是小编收集整理的微生物菌种的保存方法，希望对您有所帮助!一、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如*奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产*菌种，则应在培养基中添加少量碳*钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传*状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原*、形成生理活*物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
二、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳*杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。
常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。
方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。
保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)，置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。
微生物菌种保藏方法及关键技术
目录
01 一、微生物菌种保藏 方法
02
二、微生物菌种保藏 关键技术
03
三、应用实践及注意 问题
04 四、结论
05 参考内容
微生物菌种是生物科学领域中的重要资源，它们具有广泛的工业和医学应用价 值。然而，微生物菌种的保存和保藏是一项充满挑战性的任务，因为微生物细 胞的生命周期短暂，且对环境条件极为敏感。为了更好地利用和保护这些珍贵 的资源，本次演示将详细介绍微生物菌种保藏方法及关键技术。
2、需要根据菌种的特性和应用需求，选择合适的培养基和培养条件，以保证 菌种的活性和稳定性。
3、在使用液氮保藏方法时，需要注意液氮的纯度和保存容器的密封性等问题， 以免影响菌种的存活率和保藏效果。
4、在菌种保藏过程中，需要注意防止杂菌污染和交叉感染等问题，以保证菌 种的纯度和质量。
5、需要注意菌种的定期检测和维护，及时发现并处理衰退和失活的菌种，以 保持菌种种群的健康和稳定。
三、应用实践及注意问题
在实际应用中，不同微生物菌种的保藏方法具有各自的优势和适用范围。一般 来说，对于一些常见的微生物种类，如细菌、酵母和霉菌等，冷冻保藏和液氮 保藏是常用的保藏方法。在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的保藏方 法和操作条件。此外，还需要注意以下问题：
1、在菌种保藏过程中，需要注意菌种的来源和背景信息的记录和整理，以便 更好地了解菌种的特性和进行相应的管理。
2、种子管理
种子管理是微生物菌种保藏的关键环节之一。良好的种子管理包括对菌种的纯 度、质量、稳定性和活性的监控和维护。在菌种保藏过程中，需要定期对菌种 进行纯度检测，确保菌种的纯度和质量。同时，需要根据菌种的生长特性和环 境条件，制定相应的管理措施，包括培养基的选择、培养温度和湿度的控制等， 以维持菌种的稳定性和活性。
微生物菌种常规保藏技术规程
微生物菌种常规保藏技术规程一、前言微生物菌种的保藏是微生物研究中非常重要的一环，它对于保障菌种的长期保存和研究使用具有重要的意义。
本技术规程旨在规范微生物菌种的常规保藏技术，确保其安全、稳定和可持续使用。
二、常规保藏技术1. 冻干法（Lyophilization）：将培养的微生物菌株悬液在前冷冻过程中给予低温、高真空条件，使其中的水分直接从冰态升华为气态，从而避免了常规冻存法中由于结冰时水晶体的生成对菌体的危害，从而达到保存微生物菌株的目的。
操作步骤：a. 微生物培养物经适当稀释后应当倒入试管中，滴入约1ml 20%乳糖溶液在表面形成一层薄膜，待乳糖凝固后，在加入4ml 0.5-0.7%匀浆的2%干燥乳铁粉液，将试管摇匀，再灌入16ml混合液保持无气泡，放置于冰浴上。
b. 待培养物温度达到0摄氏度，再清洗喷雾器，灌入76％露醇20ml，培养物放入冷板上，适当时间后将试管封口放入冷板上经杀菌后真空泵连接，把真空泵打开，通过真空泵提供的条件慢慢降低压强，一般12小时后真空泵关闭。
c. 提供适当温度下作干燥处理，通常使用倍耐安减压干燥器空干40-80小时，干燥后的干燥灸试管，将试管放入吸气瓶中后置入-40—-50摄氏度低温冷冻管内低温保存(一般保存温度为—40摄氏度或更低)，备用空干矿温度—20摄氏度或更低。
2. 酶解冻存法（Enzymatic freezing）：在培养基中添加蔗糖，结合酶解冻存方法，经冻干后的菌种耐冻性和储存时间明显提高。
操作步骤：a. 将微生物分别接种于琼脂平板上，预培养24小时，取2-3份储备品。
菌液于冻干菊花瓶中进行前冷冻，真空抽气消耗20分钟。
b. 平均地用EP管管接受，采用3次“起冻—冷冻”的方法完全冻干，最后0.1至0.3ml真菌液在5摄氏下冷冻6小时，然后在5摄氏下还原18小时。
c. 移除冻存，延长试验保存时间。
必须在-80摄氏下保存。
3. 液氮冻存法（Liquid nitrogen freezing）：液氮冷冻法是现在应用最广泛的冷冻保存方法，在液氮的作用下，微生物菌种在-196摄氏度下冷冻，保持良好的生物活性。
菌种保藏的方法
菌种保藏的方法菌种保藏是一种重要的微生物资源保护方式，对于研究、应用和开发微生物具有重要意义。
以下是几种常见的菌种保藏方法及其操作步骤。
一、低温冷冻保藏法低温冷冻是一种常用的微生物保藏方法，适用于大多数真菌、细菌和酵母菌。
其主要原理是将菌株保存在低温下，使其生理活动缓慢，以延长菌种的保藏时间。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，常用的保存液有甘油、甘露醇等。
4. 菌种保存：将菌株用保鲜膜包裹，放入保存管中，加入保存液，密封保存管。
5. 冷冻保存：将保存管放入低温冰箱或液氮罐中进行冷冻保存。
二、干燥保藏法干燥保藏法是一种简便、经济的保藏方法，适用于真菌、细菌、放线菌等微生物。
其基本原理是将菌种与干燥剂混合，使其水分含量降低，从而实现微生物的休眠状态。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备干燥剂：根据不同菌株的需要，选择合适的干燥剂，如硅胶、氧化钙等。
4. 菌种混合：将菌株与干燥剂按照一定比例混合均匀。
5. 干燥保存：将混合物均匀地散布在无菌培养基上，置于通风干燥的环境中进行保存。
三、冷冻冻干保存法冷冻冻干保存法是一种较为复杂的菌株保藏方法，适用于难保存的微生物，如厌氧菌、放线菌等。
其主要原理是将菌株在低温下冻结干燥，从而保护微生物的活力。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，如甘油、甘露醇等。
4. 冷冻过程：将菌株加入保存液中，放入冷冻机冷冻至低温（通常为-80℃）。
5. 冻干过程：将冷冻的菌株经过真空排气、结冰降温等步骤进行冻干处理。
微生物的菌种保藏
培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培
养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，
垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。
— 1—
• 菌种保藏方法
微 生
3.砂土管保藏法
物
将砂与土分别洗净、烘干、过筛，
的 菌 种
装于小试管中，砂土的高度约1cm， 121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3
保 藏
次。50℃烘干后经检查无误后备用。 将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子
— 1—
斜面低温保藏法操作步骤
1.斜面低温保藏法 2.固体穿刺保藏法 3.液体石蜡保藏法 4.沙土管保藏法 5.甘油保藏法
— 2—
• 菌种保藏方法操作步骤
微
生
1.斜面低温保藏法
物 的 菌
（1）贴标签 将注有菌株名称和日期的标签贴于试管斜面的正下方。 （2）接种 将待保藏的菌种用斜面接种法移接至注明菌名的试管
悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也
可直接刮下孢子与载体混匀，而后置
于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰
熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥
器中，在室温或4℃冰箱内保藏。
— 1—
• 菌种保藏方法
微
生 物 的
4.甘油悬液保藏法 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本
菌 种 保
法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用－20℃， 保藏期约为0.5～1年，而采用－70℃，保藏期可达10年。
— 2—
• 菌种保藏方法
微
生 物 的
1.斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长
菌 种 保
完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定 时间再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
微生物菌种保存方法及技术要点
微生物菌种保存方法及技术要点摘要：微生物保存是依据菌种变异快的特点，通过一定方法降低微生物的代谢活性，从而延长其保存期限。
本文对微生物菌种保存方法进行概述，并分别阐述药品微生物菌种的主要保存方法和工业微生物菌种主要保存方法。
只要选择恰当的保存方法，才达到良好的保存效果，真正实现保存的目的。
关键词：微生物菌种;保存方法;技术要点现阶段，微生物产业已具相当大的规模，其中在发达国家占有生产总值比重较高。
在微生物产值的不断增长的前提下，其中在工业、医药、农业等多个领域发挥着重要作用。
本文主要对工业微生物菌株和药品微生物菌株的保存方法进行分析研究，可以得出其保存方法是否合理对保持菌株的优良特性十分重要。
1、微生物菌种保存方法概述微生物菌种是一个基本的分类单元，其表型特征极其相似，并且与同属其他菌种有差异很大[1]。
环境条件对微生物菌种的繁殖过程有一定的影响，其保存的主要目的是保持菌种的原有活力和形状，更好的完成微生物检验等工作。
基于此，要做好优良的菌种的选择工作，将其代谢水平降低到最低，保证菌种不发生变异并保持相应的活性。
菌种保存方法还要考虑到保存方法的经济性与便捷性，主要是操作成本以及生产推广使用的可行性。
2、药品微生物菌保存方法阐述2.1 斜面低温保藏法此方法是一种经常使用的保藏法，主要是将微生物菌种转移培养到斜面培养基中，待到微生物菌种全部覆盖于整个斜面之后，将其低温保藏，温度一般为4℃。
通过一段时间之后，对微生物菌种按照相同的方法进行转培，通过保藏方法以及不断转培进行菌种的保藏。
该方法具有的优势主要体现在操作简单、对操作设备要求低，并且菌种的存活率比较高。
此方法适用于多种微生物菌种的短期保藏，其保存菌种的时间为几个月，并不适合需要长期保藏的菌种。
在温度为4℃的情况下，菌种一般还具有一定的代谢水平，会使菌种的活性降低。
同时，反复多次的培养菌种，容易使菌种发生变异，引发感染现象等。
2.2 石蜡油封藏法此方法主要适用于培养成熟微生物菌种斜面，采用做过无菌处理并去除水分的石蜡，将培养斜面进行封存[2]。
微生物培养及保藏标准操作规程
1. 目的规范微生物使用及保藏的相关操作，避免二次污染。
2. 范围适用于企业内所有微生物的使用及保藏3. 职责微生物保管人员负责保藏，质量监督员监督执行情况。
4. 内容4.1培养基需经验证合格后准许使用，使用前需灭菌。
4.2质检菌种的培养及菌种保藏4.2.1大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌的活化及培养固体平板法：选用适用细菌培养的培养基（如：LB培养基；营养琼脂培养基等）灭菌。
酒精灯旁打开融化的无菌培养基瓶口，在酒精灯火焰上通过2~3次后，打开无菌平皿上盖，在酒精灯火焰上在开口处灼烧2~3次，将培养基到入平皿中，盖上平皿上盖，水平放在超净台上冷却完全凝固后使用。
每次倒平板尽量将培养基到完，并及时放回冰箱4℃保存。
点燃酒精灯，酒精灯外焰灼烧接种针（环），烧至通红，冷却后，在酒精灯旁用接种针（环）轻轻挑取待活化的菌种，进行划线培养。
待长出单菌落，挑取单菌落进行液体振荡培养过夜。
平板制备示意图菌种划线培养示意图4.2.2黑曲霉的培养黑曲霉的培养选择马铃薯葡萄糖培养基，将土豆洗净去皮，切成小块，加入水煮沸20min 后，纱布过滤，清液中加入琼脂粉加热溶解后加入葡萄糖。
待葡萄糖溶解后，分装在试管中，塞上管塞，高压蒸汽灭菌后，将试管摆斜面等凝固后接种使用。
接种时用接种环挑沾取黑曲霉孢子，并在试管斜面上由内向外划波浪线。
接种完毕后塞回试管塞并在霉菌培养箱中进行培养，一般5-7天长出孢子。
孢子长出后，放置在4℃冰箱中保藏。
斜面固体培养基的制备接种环的灼烧示意图试管斜面的接种示意图4.2.3菌种的保藏菌种保藏可分为液体甘油保藏及试管斜面保藏。
大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌都采用甘油菌保藏法。
黑曲霉孢子悬液可做甘油保藏。
甘油保藏：接种环灼烧冷却后，挑取单菌落进行过夜增值培养16-18h。
移液器吸取1ml 新鲜培养物于1.5ml离心管中，4500r/min常温离心5min，弃上清。
医学微生物菌种保藏管理方法
医学微生物菌种保藏管理方法一、菌种保藏的基本原则1.保鲜原则：菌种在采集和分离过程中应尽量保持其原汁原味，避免外源菌的混入和污染。
2.单株原则：保藏时应保证每支菌株是单株，以保证其纯度和稳定性。
3.多种原则：对同一种微生物的不同菌株应采取多中多位保藏，以增加菌种的多样性。
4.全程可控原则：采取全程可追溯和可控制的管理方法，确保菌种的安全保藏和利用。
5.国际标准原则：按照相关国际标准和规范进行菌种保藏和管理，以提高交流和合作的效率。
二、菌种保藏的方法1.冷冻保存法：将纯菌株悬浮液或细胞片通过添加保护剂如甘油或DMSO等，将菌株冷冻保存在低温下，通常是-70°C或液氮中。
此方法简单易行，适用于细菌和真菌的保存。
2.干燥保存法：将菌落或菌株通过无菌技术处理后，放在无菌培养基上晾干后保存。
此法适用于真菌和酵母菌等耐干燥的菌种，保存条件较为简单。
3.血清冻干保存法：将微生物菌株通过添加保护剂的方法制备成冻干粉末，然后放置在低温干燥器中冻干保存。
此法适用于需长时间保存且具有较高生物学活性的病毒和细菌。
4.深层培养保存法：将纯菌株制备成深层培养基中的斜面培养或沉淀法保存。
此法适用于常规保存，保存条件较为简单。
5.液体亚培养保存法：将菌种接种到液体培养基中，通过调整培养基成分，采取亚培养保存的方式，保持菌种的生存状态。
此法适用于对菌株的要求较高的特殊菌株。
2.制度规范：建立菌种保藏和管理的工作制度和操作规范，明确工作流程和责任分工，保证工作的科学性和规范性。
3.定期检测：对保存的菌种进行定期检测，保证其纯度、活性和遗传稳定性，及时发现和处理菌种变异和污染等问题。
4.定期更新：对长时间保存的菌种进行定期更新，保持菌种的活力和可持续利用能力，与其他菌种资源中心进行流通和交换。
5.安全保障：建立菌种保藏和管理的安全保障制度，包括物理安全、信息安全和生物安全等方面的管理措施，保证菌种和研究人员的安全。
综上所述，医学微生物菌种保藏管理是一项综合性较强的工作，需要遵循基本原则，采用适合的保存方法，并且进行科学的管理和规范的操作，以确保菌种的质量和可持续利用能力。
微生物保藏及基本操作技术
人员操作水平要求高； 保藏(bǎocáng)成本高。
第二十五页，共35页。
不同保藏方法(fāngfǎ)的比较
第二十六页，共35页。
菌种保藏(bǎocáng)技术进展
程序(chéngxù)降温控制技术
Quanti Cult (REMEL)
EZ-CFU one step (MicroBioLogics)
Culti Loops (REMEL)
KWIK-STIK (MicroBioLogics)
Complicated
Standard Strains (ATCC/NBRC etc.)
Low
Accuracy
液体石蜡法
指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培 养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再 直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行保存(bǎocún) 的一种菌种保藏方法。
第九页，共35页。
❖ 操作步骤：
液体石蜡预处理
斜面培养(péiyǎng) 物制备
灌注石蜡
保藏
第十页，共35页。
细胞，细胞一旦固定化，便可采取传统的冻干保藏方法进
行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中，并延伸至
线虫和藻类。
Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate. © M.Ryan / Mycologist 15: 66-69
第二十九页，共35页。
普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）, 中国科学院微生物 研究所
农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵(fā jiào)
微生物菌种常规保藏技术规程
微生物菌种常规保藏技术规程一、引言微生物菌种的保藏是微生物学研究中至关重要的环节之一。
通过合理的保藏技术，可以确保微生物菌种的长期存活和保存，为后续的研究提供可靠的物质基础。
本文旨在介绍微生物菌种常规保藏技术规程，以期提供一个标准化的操作指南。
二、菌种的采集和处理1. 采集菌种时，应选择生长旺盛、纯度高的菌落或液体培养物。
2. 采集后的菌落应立即进行处理，避免外界污染。
3. 处理前应先进行菌种的鉴定和纯化，确保菌种的准确性和纯度。
三、菌种的保存方法1. 冷冻法：将菌种悬液加入20%甘油溶液中，制备成冷冻菌种。
存放于-80℃的冰箱中。
2. 干燥法：将菌种培养物均匀涂布在无菌滤纸上，放置于无菌培养皿中，置于干燥箱中进行干燥。
3. 冷冻干燥法：将菌种悬液加入5%蔗糖溶液中，制备成冷冻干燥菌种。
存放于低温干燥器中。
四、菌种的保存条件1. 冷冻菌种应存放于-80℃的冰箱中，避免频繁解冻。
2. 干燥菌种应存放于干燥、通风、避光的地方，避免潮湿和高温。
3. 冷冻干燥菌种应存放于-20℃的冰箱中，避免频繁解冻。
五、菌种的复苏和活化1. 冷冻菌种的复苏：将冷冻菌种悬液快速解冻后，加入适量培养基，进行孵育。
2. 干燥菌种的复苏：将干燥菌种涂布于含有适量水分的培养基上，进行孵育。
3. 冷冻干燥菌种的复苏：将冷冻干燥菌种悬液快速溶解后，加入适量培养基，进行孵育。
六、菌种的质量控制1. 质量控制应包括菌种的纯度、活力和遗传稳定性等指标的检测。
2. 检测方法可包括菌落形态观察、生理生化特性测定、PCR扩增和测序等。
七、菌种的分发和共享1. 分发前应对菌种进行复苏和活化，确保其活力和纯度。
2. 分发时应注意避免菌种的交叉污染和变异。
八、结论微生物菌种常规保藏技术规程是保证菌种长期保存和共享的重要保障。
通过规范的操作流程和条件控制，可以确保菌种的质量和可靠性。
在菌种的保藏和使用过程中，还应注意遵守相关法律法规和伦理规范，保护知识产权和科学道德。
《微生物菌种常规保藏技术规程》
《微生物菌种常规保藏技术规程》微生物菌种是生命科学中研究和应用广泛的重要资源。
为了确保微生物菌种的品质和数量，常规保藏技术规程是非常重要的。
本文将介绍微生物菌种常规保藏技术规程的相关内容，以期为微生物菌种的研究和应用提供参考。
一、微生物菌种常规保藏技术规程的意义微生物菌种常规保藏技术规程是为了在微生物菌种的研究和应用中提供常规保藏技术而制定的。
微生物菌种的保藏技术对微生物菌种的研究和应用具有重要意义。
通过常规保藏技术，可以有效地保藏微生物菌种，并确保其品质和数量的稳定性。
此外，常规保藏技术还可以提供可靠的微生物菌种资源，为微生物菌种的研究和应用提供支持。
二、微生物菌种常规保藏技术规程的基本要求微生物菌种常规保藏技术规程的基本要求包括以下几个方面：1.微生物菌种的收集微生物菌种的收集是常规保藏技术的第一步。
微生物菌种的收集需要尽可能地获取新鲜的微生物菌种。
此外，还需要注意微生物菌种的纯度和质量。
2.微生物菌种的保藏微生物菌种的保藏是常规保藏技术的核心。
微生物菌种的保藏需要采用适当的保藏方法和条件，如适当的温度、湿度、pH值和保藏条件等。
此外，还需要注意微生物菌种的包装和运输，以保证其品质和数量。
3.微生物菌种的鉴定和评价微生物菌种的鉴定和评价是常规保藏技术的重要环节。
通过鉴定和评价，可以确定微生物菌种的品质和数量，并对其进行比较和分析。
此外，还可以通过鉴定和评价，发现微生物菌种的缺陷和不足，为微生物菌种的研究和应用提供参考。
三、微生物菌种常规保藏技术规程的应用微生物菌种常规保藏技术规程在微生物菌种的研究和应用中具有重要作用。
通过常规保藏技术，可以有效地保藏微生物菌种，并确保其品质和数量的稳定性。
此外，常规保藏技术还可以提供可靠的微生物菌种资源，为微生物菌种的研究和应用提供支持。
四、结论微生物菌种常规保藏技术规程是保证微生物菌种品质和数量的重要手段。
通过常规保藏技术，可以有效地保藏微生物菌种，并确保其品质和数量的稳定性。
微生物与食品保藏—食品保藏中的防腐与杀菌措施(食品微生物控制技术课件)
二、冷冻保藏
保藏在冰点以下，一般冷冻保藏温度为-18℃ 微生物不能活动，AW值降低 冷冻速度慢，会导致细胞失水，细胞破坏 尽量采用快速冷冻
快速冷冻 保鲜！
二、冷冻保藏
芽孢对冷冻及冷藏的抗性最强，90%可存活 真菌孢子、酵母菌、G+抗冻 冷冻保藏温度越低，保藏期就越长 几个月甚至几年
•二、食品pH与微生物生长的适应性
• 大多数细菌最适生长的pH值是7.0左右 • 酵母菌和霉菌生长的pH值范围较宽 • 非酸性食品适合于大多数细菌及酵母菌、霉菌 的生长 • 酸性食品腐败变质主要是酵母和霉菌的生长
•三、食品的水分活性与微生物生长的适应性
• 游离态、结合态；影响生长繁殖的主要是游离态水 • AW，数值在0-1之间，反映食品中游离水量占总水量的比例 • 不同类群微生物生长对AW的要求不同 • 酵母菌需要的AW值比细菌低 • 多数酵母菌需要的AW值比霉菌高
严 禁 食 用 ！
蛋白质 淀粉 脂肪
•一、食品的营养成分与微生物生长的适应性
• 取决于微生物的酶系是否与食品的营养成分一致 • 分解蛋白质的微生物：多数细菌，许多霉菌 • 分解碳水化合物的微生物：绝大多数微生物利用简单的(CH2O) • 分解脂肪的微生物：种类不多，大部分霉菌,，少数细菌
真有营养，快来吃 呀，多多生宝宝！
三、SO2和亚硫酸盐
一般使用亚硫酸盐或亚硫酸氢盐 方便、安全、稳定 主要用于果汁、果酒和水果 可抑制酮酸杆菌、多种酵母菌和霉菌
四、硝酸盐和亚硝酸盐
抑菌、发色剂、独特风味 在人体内转化成亚硝胺，致癌 用量限制严格，有些国家禁用于食品 肉制品防腐 抑制肉毒梭菌 我国，作为发色剂
五、乳酸链球菌素
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液体石蜡法
医疗器械无菌检验与洁净室管理技术培训班，北京，2011
指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件 下培养好后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个 斜面，再直立放置于低温（4～6℃）干燥处进行 保存的一种菌种保藏方法。
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❖ 操作步骤：
液体石蜡预处理 斜面培养物制备
将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保存的一种 长期菌种保藏方法。
准备冷冻管 准备保护剂 （ 10%-15%甘油） 准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液） 制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）
保藏（ -80℃，2～5年）
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-80℃冰箱冻结法
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安瓿管的准备
清洗
选用中性玻璃材质的安瓿管； 2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次； 置于烘箱中烘干。
棉塞
打棉塞，160℃定型2h；
标签
激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。
真空干燥
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在开动真空泵后应使真空度在15min内达到66.5Pa，随 后逐渐达到26.6～13.3Pa，在此条件下，样品将保持冻 结状态，其中水分则不断升华，干燥才能顺利地进行。
终止干燥时间应根据下列情况判断：
安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状 真空度接近空载时的最高值 样品温度与管外温度接近 选用1～2支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为
退化 不易退化
保藏成本 高 较高 低 较低 高
操作性 简单 比较简单 复杂 复杂 复杂
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菌种保藏技术进展
程序降温控制技术
冷冻速度慢：细 胞内水分外渗多， 细胞脱水，体积 收缩。 冷度速度快：细 胞内水分没有足 够时间外渗，细 胞内结冰。 冷冻速度非常快： 细胞内冰晶非常 小或称玻璃化状 态。
Teliospores : Puccinia spp。 Source: /~pi/enpp/p athology/images/dayl.
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菌种保藏技术进展
❖ 包埋固定化技术
是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液 加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取 传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中， 并延伸至线虫和藻类。
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微生物菌种保藏
微生物菌种保藏方法
基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休 眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的 环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优 良特性。
基本措施是低温、真空、干燥。
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冻干样品制备
制备斜面培养物； 将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜
面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。 用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，
操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底 部，勿使菌液沾在管壁上。
对于1微米直径的纯净水滴，只有当冷却速率高达107℃/秒时才 能实现“玻璃化”。
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保藏菌株要求
药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内 或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标 准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。
2010版中国药典《药品微生物实验室规范指导原则》
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国内认可的菌种收藏机构
1979年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种 保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设7个全国性菌种保藏 管理中心及机构所在地：
普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）, 中国科学院微生物研究所 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所 抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所 兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所 林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院
菌株代数
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美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一 次即称为一代，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5 代”。
United States Pharmacopoeia (USP) provides that: "to microbial inoculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation," and provides that
干燥、低温、无氧、保护 剂
－80℃冰箱冻结法 低温(－80℃)、保护剂
超低温(－150℃或－196 液氮超低温冻结法
℃)、保护剂
保藏时间 3～6 月 1～2 年 8～10 年 2～5 年 10 年以上
保藏设备 冰箱
菌种活性 易退化
冰箱
退化
－80℃冰箱、真空冷冻干燥 机、封管设备
退化
－80℃冰箱 程控降温仪、 液氮运输罐及液氮罐
灭菌
121 ℃，30min.
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保护剂的准备
保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管； 灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌
20min； 打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅
速放入凉水中冷却； 30℃培养2天，无菌检查合格后备用。
干燥完结
预冻
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制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h； 分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，
使菌液完全冻结； 可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30
分钟，再放入－80℃冰箱冻30min； 采用离心式冻干装置时勿需预冻。
❖ 使用方便； ❖ 保藏时间较长； ❖ 对设备要求高(-80℃冰箱)； ❖ 运输不方便。
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液氮超低温冻结法
指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于－196℃ 的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存的一种长期菌种 保藏方法。
操作步骤
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冷冻管准备 保护剂制备 保藏培养物准备 预冻
同“－80℃冰箱冻结法”
— 将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温 速率降至-35℃； — 使用程序降温盒。
保藏
将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)或液相(-196℃)。
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"esxtcreaeinds5ofgethneerpaatisosnag. e“s (from the original strain from freeze-dried powder) must not
我国的GMP认证中也如此要求，并且中国药典2005年版药典也已做出“菌种 的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”这个明确的规定。
液氮超低温冻结法
❖ 保藏时间长； ❖ 保藏效果好，菌种不易退化； ❖ 对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平
要求高； ❖ 保藏成本高。
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不同保藏方法的比较
保藏方法 定期移植法
保藏原理 低温(4℃)
液体石蜡法
低温(4℃)、阻断氧气
真空冷冻干燥法
灌注石蜡 保藏
液体石蜡法
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❖ 操作简单，使用比较方便； ❖ 对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；· ❖ 菌种易退化、污染。
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真空冷冻干燥法
指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经 预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存 后保存的一种长期菌种保存方法。
微生物保藏及基本操作技术
中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC 姚粟 博士
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微生物菌种保藏
菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是 发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重 要生物资源。
菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种 的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏 的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌 种的污染或死亡。
Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate. © M.Ryan / Mycologist 15: 66-69
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菌种保藏技术进展
玻璃化技术
就是用极快的冷却速率，使细胞及其所处的溶液来不及形成冰 晶，一下子以“非晶体”的方式固化下来，可以阻止冰晶体对细胞的 破坏作用。
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