微生物检验的基本操作技术

微生物检验的基本操作技术

一、无菌操作技术

1、定义

是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；

无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。

2、内容

无菌操作技术主要包括两方面：

1）创造无菌的培养环境。包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；

2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。

3、无菌操作原则

1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；

2）在操作前20～30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；

3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；

4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；

5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；

6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。

二、无菌操作的环境要求

1、无菌室

（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；

（2）无菌室的消毒和防污染

•每日（使用前）紫外线照射（0.5~1小时）；

•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；

•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时），特殊情况下可增加熏蒸频次。

（3）无菌室使用要求

①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；

②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；

③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。

2、超净工作台

超净台的使用与保养：

（1）风速稳定，且符合要求；

（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上；

（3）让超净台预工作10－15分钟；

（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。

3、无菌器材

（1）灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等；

（2）消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。

（3）无菌间一般只允许放置无菌操作台、转椅等物品；无菌操作台上一般只允许摆放以下物品：酒精灯、打火机、接种针、消毒棉球、洗耳球、镊子、油性笔、灭菌平皿、试管架、灭菌吸管、电子天平、250ml灭菌三角瓶、培养基、均质器等。

三、无菌操作的基本技术

1、无菌接种操作

培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上，这个过程叫做无菌接种操作。

在实验室检验中的各种接种必须是无菌操作。

2、微生物检验过程中的无菌操作要求

（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；

（2）使用玻璃器皿应轻取轻放；

（3）在正火焰上方操作；

（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；

（5）在接种培养物时，协作应轻、准；

（6）不能用嘴直接吸吹吸管；

（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。

3、无菌操作技术详细图解

（1）取菌技巧

（2）接种技巧

（3）错误示范

一、接种

1、接种定义

接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。

2、接种工具

在实验室中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。

1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀

3、微生物检验常见接种方法

（1）划线接种法

平板划线分离法--分区划线分离法

①用接种环先将培养物涂布于平板1区并作数次划线，再在2、3……区依次划线；

②每划完一个区域，转动培养皿约70度角，并将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域；

③每一区域的划线均接触上一区域的接种线1～2次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落；

④其他操作与上述曲线划线分离法相同。

（2）斜面接种法

主要用于经划线分离培养所获得的单个菌落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。

以菌种移种为例，其接种方法是：

①取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于外侧，培养基管位于内侧；

②右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌接种环；

③以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过火焰1~2次；