中国医科大学研究生选修课 细胞生物学实验技术
细胞生物学实验技巧总结
细胞生物学实验技巧总结细胞生物学是一门研究细胞结构、功能和生命过程的学科，实验是探索和验证细胞生物学理论的重要手段。
为了更好地进行细胞生物学实验，我们需要掌握一些实验技巧和方法。
本文将总结一些常用的细胞生物学实验技巧，帮助读者更好地开展相关实验。
一、细胞培养技巧1. 细胞选取与分离：在细胞培养实验中，正确选择和分离细胞是非常重要的。
首先，根据实验的要求选择适当的细胞系或原代细胞。
其次，使用无菌技术将细胞转移到培养皿中，并确保培养容器的无菌状态。
2. 培养基的配制：细胞培养基的配制要根据细胞类型和实验要求进行合理的选择。
通常包括基础培养基和补充物。
在配制过程中，要注意严格按照要求添加培养基成分，保证培养基的质量。
3. 细胞培养条件的控制：细胞的生长和繁殖需要特定的环境条件。
在培养细胞的过程中，要注意控制温度、湿度和二氧化碳浓度等参数。
此外，定期更换培养基，并检查细胞的形态和活性。
二、细胞染色技巧1. 原位染色：原位染色是观察细胞形态和分子定位的重要方法。
其中，荧光原位杂交技术（FISH）可以用来检测基因的表达和定位。
使用特定的探针与目标DNA高度特异地结合，然后使用荧光探针显色，利用荧光显微镜观察染色体和核酸分子的位置。
2. 免疫染色：免疫染色是通过特异性抗体与目标分子结合，然后使用荧光标记的二抗进行检测，用于检测蛋白质的定位和表达。
在进行免疫染色时，需要注意选择适当的抗体和染色方法，并进行有效的洗涤步骤，以避免非特异性染色。
三、细胞分离和提取技巧1. 胞内蛋白提取：细胞内的蛋白质提取是许多分子生物学研究的基础。
为了获得高质量的胞内蛋白样品，可以使用细胞裂解缓冲液使细胞破碎，并添加蛋白酶抑制剂来保护蛋白质免受降解。
此外，离心操作可以用来去除细胞碎片和细胞器。
2. DNA/RNA的提取与纯化：DNA/RNA分离是研究基因组和转录组的重要步骤。
对于DNA的提取，可以使用DNA提取试剂盒，按照说明书进行提取和纯化。
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25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
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61、辍学如磨刀之石，不见其损，日 有所亏 。 62、奇文共欣赞，疑义相与析。
63、暧暧远人村，依依墟里烟，狗吠 深巷中 ，鸡鸣 桑树颠 。 64、一生复能几，倏如流电惊。 65、少无适俗韵，性本爱丘山。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
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光学显微镜
透射电镜
(2) 超薄切片的制备 A 固定 戊二醛:蛋白质 锇酸:脂类
B 脱水 上升梯度 乙醇：30% 50% 70% 80% 90% 95%
100% C 包埋 环氧树脂 D 切片 500 –700 Å
E 重金属染色 U(醋酸双氧铀) (柠檬酸铅)
生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力 弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进 行染色。
（2）荧光显微镜的基本构造 A 紫外光光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长
波光线 C 滤光片
（3）常用的荧光染料 荧光素 罗丹明
（4）应用 A 免疫荧光显微技术 （） 抗体 + 荧光染料
B 绿色荧光蛋白
4.相差显微镜 （ ）
(1)原理
波长
颜色
振幅
亮度
速度
相位
⑴普通显微镜: 光通过染色标本时，波长和振幅发生变化，人眼才能观察到。
分辨率： 典型的动物细胞 ——— 10～
20 m 一般的细菌和线粒体—— 0.5 m
(500) 普通显微镜 ———— 0.2μm(200) 暗视野显微镜———— 0.0040.2μm(4-200)
应用：
6.显微电影摄影
—记录细胞或细胞器运动过程和速度
用显微电影摄影术或电视录像以一定 间隔拍摄一次细胞状态，当影片或电视 录像以正常速度反映时，所拍摄的情节 就被大大加快了，用这种方法可以准确 地记录细胞或细胞其的运动过程和速度。
R=
0.61 λ
光学显微镜的n s分in辨θ 极限0.2μm
n :聚光镜和物镜之间介质的折射率. 空气为1,油为1.5
θ: 标本对物镜镜口 张角的半角. θ的最大值为1
医学细胞生物学实验
细胞毒性实验
原理
评估化学物质、药物对细胞 的毒性影响。
技术
包括细胞存活率、细胞毒性 指标的测量方法。
应用
用于研究药物筛选、环境污 染物评估等。
细胞信号传导实验
原理
研究细胞内外信号传递 的分子机制，如细胞膜 受体激活、信号转导途 径等。
技术
包括Western blot、ELISA 等分析方法。
应用
医学细胞生物学实验
医学细胞生物学实验是研究细胞结构和功能的重要手段。本演示将介绍几种 常见的细胞实验以及它们在医学领域的应用。
细胞分离实验
1
原理
通过酶溶解组织样本中的细胞间质，使细胞分散成单个细胞。
2
应用
用于分离研究特定细胞类型，如癌细胞，干细胞等。
3
技术
包括悬浮液培养法、胶原酶消化法等。
细胞培养实验
用于研究细胞生长、分 化、细胞死亡等。
细胞分化实验
原理
研究细胞从幼稚状态到成熟 细胞的进程。
技术
包括诱导分化、干细胞培养 等方法。
应用
用于研究胚胎发育、组织再 生等。
细胞凋亡实验
原理
探究细胞凋亡的信号通 路和调控因子。
技术
包括细胞凋亡检测方法、 荧光染料等的使用。
应用
用于研究肿瘤治疗、器 官发育等领域。
细胞色素实验
Hale Waihona Puke 1原理通过染色体标记的方法研究细胞的遗传变异和突变。
2
应用
用于检测遗传性疾病、突变的发生与演化。
3
技术
常用的染色体标记方法有FISH、GISH等。
1 目的
在体外创建适宜的环境条件来培养和繁殖细胞。
2 技术
中国医科大学
中国医科大学细胞生物学实验手册前言这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科.七年制临床专业和研究生班。
细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践.观察分析和解决问题的能力。
为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。
大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。
选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微测量.细胞活力测定.细胞计数.细胞组分的分级分离.细胞组分的化学反应.细胞生理活动.细胞染色体技术.细胞培养.细胞融合.免疫荧光技术.电镜技术等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。
全书内容共23个实验，五年制本科.七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况选择基本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附实验报告一册。
本教材由王芸庆主编.谢荣林副主编，参加编写的有陈兴.谢荣林.宁刚.刘冬杰.黄东阳.纪晓辉.时伟红.朱亚勤.黄集前.王明武.毕卫真.张婕.三维琴和王世藩。
荆永显.李虹.王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。
教材初稿曾于1989年《全国医学细胞生物学实验课培训班》试用，参加该班的教师提出许多宝贵的经验及修改意见，谨此致谢。
现在第四版在1993年第三版基础上对部分实验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示”实验。
由于经验不足，水平有限，本教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。
目录前言实验室规则 (1)常用实验动物了解和解剖器械的使用 (2)细胞生物学实验绘图方法与要求………………………………………（4）实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量…………………………………（5）实验二线粒体的活体染色及电镜照片观察……………………………………（8）实验三液泡系的活体染色及电镜照片观察……………………………………（10）实验四细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察 (11)实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察..........................................（13）实验六细胞生理活动的观察............................................................（16）实验七细胞组分的化学反应............................................................（20）实验八细胞核与线粒体的分级分离...................................................（23）实验九细胞分裂的形态观察............................................................（26）实验正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备 (31)实验一细胞融合…………………………………………………………………（36）实验二应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本…………………………（38）实验三培养细胞的形态观察和计数……………………………………………（40）实验四细胞的原代和传代培养…………………………………………………（43）实验五酸性磷酸酶的显示………………………………………………………（46）实验六肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定..........................................（48）实验七电镜生物标本的制备及镜下观察.............................................（50）实验八整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察.........（54）实验九免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原..........................................（56）实验二姊妹染色单体互换标本制备与分析..........................................（58）实验二一银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察 (60)实验二二染色体扫描电镜标本制备及观察……………………………………（63）实验二三细胞显微摄影…………………………………………………………（65）附录一离心机转数与离心力的换算表………………………………（67）附录二溶液的配制……………………………………………………（68）主要参考资料……………………………………………………………（77）实验室规则一.遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。
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46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
中国医科大学研究生选修课 细胞生物
ห้องสมุดไป่ตู้
学实验技术
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
细胞生物学实验技术.ppt
色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。
3. 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再 将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 4. 5. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。
二、免疫细胞化学 immunocytochemistry
LCSM
• 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描； • 能显示细胞样品的立体结构； • 分辨力是普通光学显微镜的3倍；
• 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成
立体图像。
laser confocal scanning microscope, LCSM
LCSM Image of a Xenopus Melanophore
级电子信号。
SEM LIGHT PATHWAY
人类红细胞
酵母
三、显微操作技术 micromanipulation technique
• 是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操
作的一种方法。
• 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及 显微切割等。
– 细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等 将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。
机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度
的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘 液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。
三、细胞电泳
• 原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电 荷，能在外加电场的作用下发生泳动。 • 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量 有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同 。
核苷酸；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，来自于嗜热
细胞生物学实验技术的使用方法
细胞生物学实验技术的使用方法细胞生物学是研究生物体内细胞结构和功能的科学，而细胞生物学实验技术是研究细胞的关键工具。
在细胞生物学研究中，实验技术的正确使用是提取准确数据和得出可靠结论的基础。
本文将介绍几种常用的细胞生物学实验技术的使用方法。
1. 细胞培养技术细胞培养是一种人工创建和维持细胞生长的方法。
首先，选择合适的培养基和细胞系。
培养基中应包含适当的营养物质和生长因子，细胞系则应是目标研究所需要的。
接着，将细胞接种到培养皿中，控制培养皿中的温度、湿度和二氧化碳含量等环境参数，以促进细胞生长。
定期更换培养基，定期观察和记录细胞的生长状态。
2. 免疫荧光染色技术免疫荧光染色技术是一种通过标记抗体或亚抗体来检测特定蛋白质在细胞中的分布和定位的方法。
首先，选择特异性的一抗体或亚抗体，将其标记上荧光染料。
然后，用标记好的抗体或亚抗体与目标蛋白发生特异性结合。
最后，在显微镜下观察细胞，并使用相应荧光滤光片来观察和记录细胞中的荧光信号。
3. 流式细胞术流式细胞术（Flow cytometry）是一种可以同时分析和计数数以千计的单个细胞的技术。
首先，收集目标细胞样品，将其制备成细胞悬液。
然后，使用荧光标记的抗体与细胞中特定分子或蛋白质结合。
接下来，将细胞悬液通过流式细胞仪，其中一束激光照射细胞，产生散射和荧光信号。
流式细胞仪会对这些信号进行检测和记录，得出不同类型细胞的比例和相应标记物的表达水平。
4. 蛋白质电泳技术蛋白质电泳是一种通过电场将蛋白质分离的方法。
首先，将目标细胞中的蛋白质提取出来。
然后，使用SDS-PAGE电泳将蛋白质分离成不同的条带，条带的迁移速度与蛋白质的分子量成反比。
接着，可以使用染色剂如Coomassie蓝将蛋白质染色，以便可视化分离出的蛋白质。
最后，使用相应的成像设备记录电泳结果，可以通过比较不同实验组之间的蛋白质表达差异来研究细胞的生理和病理状态。
5. 基因编辑技术基因编辑技术是一种用于修改细胞基因组的方法。
细胞生物学实验技术与应用
细胞生物学实验技术与应用细胞生物学是研究生物体最基本的单位——细胞的结构、功能和活动规律的学科。
实验是细胞生物学研究中至关重要的部分，通过实验可以获取关于细胞的各种信息，揭示其内部机制和生物学功能。
本文将讨论几种常见的细胞生物学实验技术，并探讨它们在生物医学研究和生物技术领域的应用。
一、细胞培养技术细胞培养是将细胞体外培养，在人工设置的培养条件下，使细胞生长和繁殖的技术。
常见的细胞培养方法有悬浮培养和附着培养，可以用于体外细胞研究、生物药物研发及临床应用等领域。
通过细胞培养，研究人员可以观察细胞的生长、分裂、死亡等生物学行为，还可以研究细胞对特定刺激的响应反应和基因表达的变化。
二、细胞染色技术细胞染色是一种通过特殊的染色剂将细胞内的结构、形态或特定分子标记出来的技术。
常见的细胞染色方法有荧光染色、组织化学染色和核酸染色等。
例如，通过核酸染色可以观察到细胞核的形态和分裂情况，准确判断细胞的生理状态和病理变化。
荧光染色则可以用于研究特定蛋白质的表达以及定位。
三、流式细胞术流式细胞术（flow cytometry）是一种通过激光散射和荧光信号检测细胞的技术。
它可以用于分析和鉴定细胞的表型特征，如大小、形态、蛋白质表达等，还可以测定细胞数量和活力，检测细胞凋亡和细胞周期等。
流式细胞术在临床诊断、免疫学研究和细胞表型筛选等方面具有广泛的应用。
四、原位杂交技术原位杂交是一种通过特异性探针与细胞内特定序列的相互作用，检测和定位目标DNA或RNA序列的技术。
它可以用于检测基因突变、染色体异常和病原体感染等。
原位杂交技术在遗传学研究、肿瘤病理学和生殖医学等领域有着重要的应用价值。
五、CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9是一种新兴的基因编辑技术，通过设计特定的单导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白质复合物来实现对基因组位点的精确编辑。
它可以用于研究基因功能、基因治疗以及农业生物技术等领域。
CRISPR-Cas9技术的出现，极大地推动了细胞生物学研究的进展，并为相关应用提供了新的可能性。
细胞生物学实验技术与方法的介绍
细胞生物学实验技术与方法的介绍细胞是构成生命的最基本单位，细胞生物学是研究生命起源、发展以及各种疾病的基础科学。
细胞生物学实验技术与方法是了解和研究细胞的重要手段。
本文将介绍几种常见的细胞生物学实验技术与方法。
1. 细胞培养细胞培养是研究细胞生物学的基本手段之一。
通常采用试管中、培养皿中等人工制备出的营养液，来模拟细胞的生长环境，使非体外的细胞保持生长。
步骤：①准备试管或培养皿、细胞培养基和待培养的细胞；②取出保存于低温下的细胞苗，并加入培养基中，摇晃培养基混合均匀；③用移液管将细胞培养基和细胞种植在试管或培养皿中；④将试管或培养皿放置于恒温培养箱中，定期更换培养液。
2. 荧光显微镜荧光显微镜是一种特殊的显微镜，通过使用荧光染料对细胞进行染色，并可观察细胞所发出的荧光信号，以此来研究细胞。
步骤：①首先，制作待观察的细胞样本；②用荧光染料对细胞染色；③放置已染色细胞的显微镜下，观察发出的荧光信号。
荧光显微镜可用于考察细胞染色质的分布、亚细胞定位和细胞内路线图的制作等。
3. 聚合酶链反应 (PCR)PCR 是一种通过复制DNA分子的一小段，扩大其数量的方法，该技术广泛应用于多个领域，包括医学、生物学、犯罪学等。
步骤：①准备PCR反应搭配的DNA模板、引物、聚合酶和核苷酸；②按照PCR反应液配制表制备反应液；③反应器中加入反应液；④开始PCR反应。
PCR反应的成功与否，可以通过电泳、测序等方法进一步确认。
4. 转染转染是一种将外源性DNA或RNA分子引入细胞的方法，以研究细胞生物学、基因治疗等方面的问题。
步骤：①准备转染所需的载体DNA和细胞；②制备转染试剂，将DNA载体溶解于转染试剂中。
将细胞与转染试剂混合，搅拌均匀；③处理转染细胞，并进行下一步实验。
转染方法可以根据所需研究的领域不同，选择不同的转染方法。
总之，细胞生物学实验技术与方法非常多，但是在实际操作时要注意彻底消毒器械，掌握化学操作常识，以及对于实验的结果进行准确的记录。
细胞生物学实验技术研究及其应用
细胞生物学实验技术研究及其应用细胞是组成身体的基本单位，研究细胞生物学是了解身体健康和疾病发生机制的必要途径。
细胞生物学研究需要用到一系列实验技术，如细胞培养、细胞分离、染色、显微镜观察等。
这些技术在细胞生物学研究中发挥了至关重要的作用。
一、细胞培养技术细胞培养是指将组织细胞、细胞系等在特定条件下进行培养和生长。
细胞培养技术是细胞生物学中最基本、最重要的技术之一，被广泛应用于细胞生物学研究、生物医学研究、疾病诊断和治疗等领域。
细胞培养技术根据培养细胞的不同来源和用途可以分为原代细胞培养、细胞系培养、混合细胞培养等。
二、细胞分离技术细胞分离技术是指将混合细胞体系中的不同种类细胞分离出来的方法和技术。
细胞分离技术广泛应用于细胞生物学研究、药物筛选、干细胞研究、克隆研究、组织工程等领域。
细胞分离技术分为生理性分离、化学酶解法、机械分离法、激光切割法等不同方法。
三、细胞染色技术细胞染色技术是指将细胞或细胞核着色，使其在显微镜下更加明显、清晰而具有特异性的方法和技术。
细胞染色技术是细胞形态分析中必不可少的技术之一，广泛应用于细胞生物学、解剖学、生理学、病理学、医学等领域。
细胞染色技术分为活细胞染色和死亡细胞染色。
四、显微镜观察技术显微镜观察技术是指利用显微镜对样本进行观察和研究的技术。
显微镜观察技术广泛应用于医学、生物学、环境学、纺织学等领域，是研究细胞及其微观结构形态的基本手段之一。
显微镜技术包括传统透射光学显微技术、荧光显微技术、电子显微技术和原子力显微技术等多种技术。
细胞生物学实验技术在医学、生物医学研究、药物研发、疾病诊断和治疗等领域中发挥了重要作用。
例如，细胞培养技术可以用于制备生物制品，如疫苗、生长激素、抗生素和多肽类药物。
细胞分离技术可以用于肿瘤细胞的分离和纯化，为癌症治疗和肿瘤细胞基因研究提供了便利。
细胞染色技术可以用于分析细胞的分子结构和功能，为病理诊断和治疗提供了依据。
显微镜技术可以帮助科学家观察和分析生物体内的微观结构，促进了生物医学研究的发展。
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计算机图像三维重组获样品立体图像
"显微CT"
（2）应用
A 细胞的三维重建
B 细胞定量荧光检测
DNA RNA 蛋白质含量 C 细胞内Ca2+ pH动态检测 D 细胞间通讯
果蝇胚胎原肠胚
（二）电子显微镜技术
利用电子与固体样品作用时所发出的信息, 对样品进行微区观察和分析的技术 亚显微结构 超微结构 1.电子显微镜的特点 高分辨率
随样品表面 结构的高低 起伏，重金 属形成不同 厚度的薄膜， 显示了投影 效果，给出 了一个样品 表面结构的 三维图像。
冰冻蚀刻电镜-观察生物膜结构
A 冰冻组织( N2)
B 真空中升华
C 重金属喷镀(Pt) D 喷碳加固(C) - SEM E 复型 - TEM
优点
* 样品不经固定、脱水、包埋，更接近自然状态 * 对样品无损伤
100μm
0.2μ m
2.光镜标本切片的制备
(1) 固定
定义：将组织浸入化学试剂中，通过在细 胞中大分子间形成交联，保持细胞 中原有结构的形态和位置的过程。 固定的目的： A 防止组织自溶或腐败 B 保持细胞原有的形态 C 保持细胞各种成分的原有位置 常用固定剂：乙醇、甲醛、戊二醛
(2) 包埋
原理:
利用特殊装
置使照射光斜照到 样品上，照射光无 法进入物镜，故呈
暗视野。只有从样
品发出的散射光才 能进入物镜被放大, 在暗的背景中呈现 明亮的像。
分辨率：
典型的动物细胞 ——— 10～20 m 一般的细菌和线粒体—— 0.5m (500nm) 普通显微镜 ———— 0.2μ m(200nm) 暗视野显微镜———— 0.004-0.2μ m(4-200nm)
背向集电器，图像越暗
(3)样品的制备
A B C D 固定 脱水 干燥 临界点干燥 染色 离子溅射镀膜
Au
Pt
临界点干燥的原理 当温度、压力达到一定的数值时，气体的密度可增大到与液态一样， 此时气相与液相的界面消失，液体的表面张力亦会随之消失，这
种情况称为临界状态。
临界点干燥：利用物质在临界状态下液体表面张力被消除的特性， 克服样品干燥过程中的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。
理论上 实际上 生物标本 R = 0.002 nm R = 0.1 nm R = 2 nm
高放大倍率
1,000,000
2.透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM） (1)基本构造
阴极(钨丝)
阳极 聚光镜（电磁透镜）
物镜 中间镜 投影镜 照相底片 电镜照片
应用——肌营养不良症
1.正常PF面 2.DMD的PF面 3.正常EF面 4.DMD的EF面
1～4
骨骼肌细胞冷冻蚀刻样品
负染电镜技术-观察纤维状\颗粒状成分
原理：用只沉积于样品周围的、比样品密度高的 物质(如磷钨酸)对样品进行染色，使样品和背景 形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方 法叫负染。 应用：适用于颗粒或纤维等游离的样品。特别是 在病毒性致病因子的超微病理诊断中广泛应用。
(2)应用
活体细胞观察
倒置相差显微镜
载物台的上方：
光源
长焦距聚光器
载物台的下方：
物镜
应用：直接对培养的
细胞进行观察
5.暗视野显微镜（dark-field microscope ）
——在日常生活中，室内飞扬的微粒尘土不易被看见，但在暗的房间中若有一 束从光线从门缝斜射过来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。
+ substrate
抗原 + 抗体
antigen
** *
* * *
antibody
酶标记（酶联免疫吸咐实验 ELASA） 荧光标记
*
*
*
*
*
*
3.荧光显微镜技术
(1) 原理
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波 长的短波光线，并发射出比原来吸收波长 更长的光
紫外光 short
可见光 λ
红外光 long
（２）由癌细胞建立的“癌细胞系” 特点:可在培养皿中以极高的密度增殖， 没有扩展的余地时,可向空间生长。
Hela人宫颈癌细胞
（３）正常细胞经诱导建立的“转化细胞系” 肿瘤病毒 放射线 化学致癌物 用癌基因转染正常细胞
7.激光扫描共焦显微镜
（ Laser Scanning Confocal Microscope）
(1)原理
在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置， 共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。
单色激光光源
照明针孔形成点光源
分层扫描 三维重建
激光作扫描光源
扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台 上下移动,改变焦平面 得不同层次的切面图像
(1)原理
波长 振幅 速度
（phase contrast microscope）
颜色 亮度 相位
⑴普通显微镜: 光通过染色标本时，波长和振幅发生变化，人眼才能观察到。 但光通过活细胞时，波长和振幅几乎无改变，这就无法用人眼观察。 ⑵相差显微镜：细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不 过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把这种“相位差”变成 “振幅差”，即图像的明暗差。
1.细胞培养的条件 (1) 固体表面：培养瓶、培养皿
(2)培养基
常见培养基：1640 DMEM
(3)无菌 无菌操作：超净工作台、火焰消毒等 培养液中加入抗菌素 器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤）
(4)其他
温度 37℃ 湿度 100% CO2浓度 5%
2.细胞培养的传代
原代培养:直接取材于有机体的细胞培养 取材 切割 消化 培养 传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中 取出，以1:2以上的比例扩大培养
工作原理及过程: A 制备组织切片 B 镜下将组织切片覆以薄膜 C 激光束切割特定细胞或区域 D 收集管收集
三、细胞培养技术
（Cell定的细胞，在一定的 条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以 至增殖的方法
in vitro 用培养细胞做实验 in vivo 用动物做实验
1959年，Brenner和Horne用负染法发现了人的腺病 毒和脊髓灰质炎病毒。 ——正式命名negative staining
磷钨酸染色
X射线衍射技术（x-ray diffraction）
应用： 测定分子中原子的三维排列的唯一方法 原理及方法： * 制备结晶 * 选择波长 * 获得衍射图
* 计算和分析
电子束在扫描线圈驱动下，在试样表面按一定时间、空间
顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用，产生二次 电子发射。二次电子发射量随试样表面形貌而变化；
二次电子信号被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步
扫描成像。
a.样品表面形貌 表面越突出，图像越亮 表面越凹陷，图像越暗
b.样品与集电器的关系
面向集电器，图像越亮
核磁共振技术（NMR） 特点：测定蛋白质的液相空间结构。
二、细胞分离技术 （
cell separation）
从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法
1.制备单一细胞悬液 组织 消化
EDTA
细胞间连接 细胞外基质
胰酶
单一细胞
二、细胞分离技术 （
cell separation）
从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法
* 研究膜分子结构的唯一显示方法
* 可获得立体结构图象
P(F)： protoplasmic fracture face 内裂面 E(F)： extracellular fracture face 外裂面 PS：protoplasmic surface 内表面 ES：extracellular surface 外表面
（2）荧光显微镜的基本构造
A 紫外光光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 滤光片
（3）常用的荧光染料
荧光素 罗丹明 FITC
（4）应用
A 免疫荧光显微技术
（Immunofluorescence microscopy）
抗体 + 荧光染料
B 绿色荧光蛋白
GFP
4.相差显微镜
荧光标记
B 样品制备
细胞悬液制备 细胞固定 细胞染色
B 应用
* 细胞分选 cell in 1000 5000 cells/sec * 细胞大小测量 * DNA 含量测定 * 免疫表型分析 * 细胞功能分析 * 细胞凋亡研究
细胞周期分析
(4) 激光捕获显微切割技术 （Laser capture microdissection，LCM） 从组织切片中精确分离获取单一细胞的方法
细胞生物学实验技术
cellular level
Subcellular level
Molecular level
显微技术
细胞分离技术
细胞培养技术 细胞组分的分级分离 细胞示踪技术 细胞分子生物学技术
一、显微镜技术 microscopy
μm 微米 = 10-6 m nm 纳米 = 10-9 m Å 埃 = 10-10 m
1.制备单一细胞悬液 组织 消化
EDTA
细胞间连接 细胞外基质
胰酶
单一细胞
2.分离不同类型细胞 (1) 离心
大小
小
大 （centrifugation）
密度
轻
重
形状
不规则
圆形
(2) 亲和表面
①
轻微震荡 消化基质
②
(3) 流式细胞仪
( flowcytometer)
能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或 化学特性的技术 A 原理: 抗原+抗体*