中国医科大学研究生选修课 细胞生物学实验技术

电镜三维重建技术
2.扫描电子显微镜
（Scanning electron microscopy, SEM）
(1)原理 二次电子 (2)分辨率 3-10nm
扫描电镜的成像原理
阴极钨丝加热后产生的电子束经过栅极和阳极加速和会聚，
再经二级聚光镜及物镜会聚形成具有一定能量、一定束流强 度和束斑直径的微细电子束；
+ substrate
抗原 + 抗体
antigen
** *
* * *
antibody
酶标记（酶联免疫吸咐实验 ELASA） 荧光标记
*
*
*
*
*
*
3.荧光显微镜技术
(1) 原理
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波 长的短波光线，并发射出比原来吸收波长 更长的光
紫外光 short
可见光 λ
红外光 long
(1)原理
波长 振幅 速度
（phase contrast microscope）
颜色 亮度 相位
⑴普通显微镜: 光通过染色标本时，波长和振幅发生变化，人眼才能观察到。 但光通过活细胞时，波长和振幅几乎无改变，这就无法用人眼观察。 ⑵相差显微镜：细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不 过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把这种“相位差”变成 “振幅差”，即图像的明暗差。
原理:
利用特殊装
置使照射光斜照到 样品上，照射光无 法进入物镜，故呈
暗视野。只有从样
品发出的散射光才 能进入物镜被放大, 在暗的背景中呈现 明亮的像。
分辨率：
典型的动物细胞 ——— 10～20 m 一般的细菌和线粒体—— 0.5m (500nm) 普通显微镜 ———— 0.2μ m(200nm) 暗视野显微镜———— 0.004-0.2μ m(4-200nm)
(2)应用
活体细胞观察
倒置相差显微镜
载物台的上方：
光源
长焦距聚光器
载物台的下方：
物镜
应用：直接对培养的
细胞进行观察
5.暗视野显微镜（dark-field microscope ）
——在日常生活中，室内飞扬的微粒尘土不易被看见，但在暗的房间中若有一 束从光线从门缝斜射过来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。
细胞生物学实验技术
cellular level
Subcellular level
Molecular level
显微技术
细胞分离技术
细胞培养技术 细胞组分的分级分离 细胞示踪技术 细胞分子生物学技术
一、显微镜技术 microscopy
μm 微米 = 10-6 m nm 纳米 = 10-9 m Å 埃 = 10-10 m
扫描电镜的特点
高
的
分
辨 率
很
强
的 立
体
感
放大倍率范围广
针 尖 细 菌
应用范围广
样 品 适 应 性 大
透射电镜 利用穿透标本的电子进行成像 (散射) 观察组织的二维切片 扫描电镜 利用标本表面发射的二次电子成像
观察组织的表面三维结构
冰冻断裂电镜-观察生物膜结构
A 冰冻组织(液氮) B 重金属喷镀(Pt) C 喷碳加固(C) - SEM D 复型 - TEM
应用——肌营养不良症
1.正常PF面 2.DMD的PF面 3.正常EF面 4.DMD的EF面
1～4
骨骼肌细胞冷冻蚀刻样品
负染电镜技术-观察纤维状\颗粒状成分
原理：用只沉积于样品周围的、比样品密度高的 物质(如磷钨酸)对样品进行染色，使样品和背景 形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方 法叫负染。 应用：适用于颗粒或纤维等游离的样品。特别是 在病毒性致病因子的超微病理诊断中广泛应用。
理论上 实际上 生物标本 R = 0.002 nm R = 0.1 nm R = 2 nm
高放大倍率
1,000,000
2.透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM） (1)基本构造
阴极(钨丝)
阳极 聚光镜（电磁透镜）
物镜 中间镜 投影镜 照相底片 电镜照片
计算机图像三维重组获样品立体图像
"显微CT"
（2）应用
A 细胞的三维重建
B 细胞定量荧光检测
DNA RNA 蛋白质含量 C 细胞内Ca2+ pH动态检测 D 细胞间通讯
果蝇胚胎原肠胚
（二）电子显微镜技术
利用电子与固体样品作用时所发出的信息, 对样品进行微区观察和分析的技术 亚显微结构 超微结构 1.电子显微镜的特点 高分辨率
定义：将组织块包入包埋剂使组织硬化的过 程。 常用的包埋剂：液体石蜡、树脂
(3) 切片
1-10 μm
（4）染色
采用某些化学物质特异性或选择性地与细 胞内的某些成分相互作用，从而原位显示 细胞某种成分或结构的方法
A 选择性染色
考马斯亮蓝 – 蛋白质 Brachet反应
HE染色
B 特异性染色
酶 + 底物
核磁共振技术（NMR） 特点：测定蛋白质的液相空间结构。
二、细胞分离技术 （
cell separation）
从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法
1.制备单一细胞悬液 组织 消化
EDTA
细胞间连接 细胞外基质
胰酶
单一细胞
二、细胞分离技术 （
cell separation）
从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法
应用：
能观察物体轮廓,分不清内部的微细结构。 用以观察活细胞内的细胞核、线粒体, 以及 液体介质中的细菌等微粒的运动 。
6.显微电影摄影
—记录细胞或细胞器运动过程和速度
用显微电影摄影术或电视录像以一定 间隔拍摄一次细胞状态，当影片或电视 录像以正常速度反映时，所拍摄的情节 就被大大加快了，用这种方法可以准确 地记录细胞或细胞其的运动过程和速度。
1959年，Brenner和Horne用负染法发现了人的腺病 毒和脊髓灰质炎病毒。 ——正式命名negative staining
磷钨酸染色
X射线衍射技术（x-ray diffraction）
应用： 测定分子中原子的三维排列的唯一方法 原理及方法： * 制备结晶 * 选择波长 * 获得衍射图
* 计算和分析
100μm
0.2μ m
2.光镜标本切片的制备
(1) 固定
定义：将组织浸入化学试剂中，通过在细 胞中大分子间形成交联，保持细胞 中原有结构的形态和位置的过程。 固定的目的： A 防止组织自溶或腐败 B 保持细胞原有的形态 C 保持细胞各种成分的原有位置 常用固定剂：乙醇、甲醛、戊二醛
(2) 包埋
(一) 光学显微镜技术
利用光线照明,将微小 物体形成放大影像的 仪器
1.显微镜的分辨率
显微镜或人眼在25cm的明视距离处,能分辨
被检物体微细结构最小间隔的能力。
R =
0.61 λ
n sinθ
光学显微镜的分辨极限0.2μm
n :聚光镜和物镜之间介质的折射率. 空气为1,油为1.5 θ: 标本对物镜镜口 张角的半角. sinθ的最大值为1 λ: 照明光源的波长.白光为0.5 μm
电子束在扫描线圈驱动下，在试样表面按一定时间、空间
顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用，产生二次 电子发射。二次电子发射量随试样表面形貌而变化；
二次电子信号被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步
扫描成像。
a.样品表面形貌 表面越突出，图像越亮 表面越凹陷，图像越暗
b.样品与集电器的关系
面向集电器，图像越亮
1.制备单一细胞悬液 组织 消化
EDTA
细胞间连接 细胞外基质
胰酶
单一细胞
2.分离不同类型细胞 (1) 离心
大小
小
大 （centrifugation）
密度
轻
重
形状
不规则
圆形
(2) 亲和表面
①
轻微震荡 消化基质
②
(3) 流式细胞仪
( flowcytometer)
能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或 化学特性的技术 A 原理: 抗原+抗体*
（2）荧光显微镜的基本构造
A 紫外光光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 滤光片
（3）常用的荧光染料
荧光素 罗丹明 FITC
（4）应用
A 免疫荧光显微技术
（Immunofluorescence microscopy）
抗体 + 荧光染料
B 绿色荧光蛋白
GFP
4.相差显微镜
真空、上下颠倒
透射电镜的成像原理
• 电子束通过标本时，根据标本各部位密 度的不同，部分电子发生散射，只有剩 余的电子成像，经物镜和投射镜放大后 投射到照相底片或荧屏上。 • 由于散射的电子不参加成像，故标本中 密度大的部分成像后形成电子流量减少 的暗区；相反密度小的部分散射电子少 而形成明区。
光学显微镜
（２）由癌细胞建立的“癌细胞系” 特点:可在培养皿中以极高的密度增殖， 没有扩展的余地时,可向空间生长。
Hela人宫颈癌细胞
（３）正常细胞经诱导建立的“转化细胞系” 肿瘤病毒 放射线 化学致癌物 用癌基因转染正常细胞
7.激光扫描共焦显微镜
（ Laser Scanning Confocal Microscope）
(1)原理
在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置， 共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。
单色激光光源
照明针孔形成点光源
分层扫描 三维重建
激光作扫描光源
扫描焦平面上样品，得样品切面像 载物台上微量步进马达使载物台 上下移动,改变焦平面 得不同层次的切面图像
荧光标记
B 样品制备
细胞悬液制备 细胞固定 细胞染色
B 应用
* 细胞分选 cell in 1000 5000 cells/sec * 细胞大小测量 * DNA 含量测定 * 免疫表型分析 * 细胞功能分析 * 细胞凋亡研究
细胞周期分析
(4) 激光捕获显微切割技术 （Laser capture microdissection，LCM） 从组织切片中精确分离获取单一细胞的方法
* 研究膜分子结构的唯一显示方法
* 可获得立体结构图象
P(F)： protoplasmic fracture face 内裂面 E(F)： extracellular fracture face 外裂面 PS：protoplasmic surface 内表面 ES：extracellular surface 外表面
背向集电器，图像越暗
(3)样品的制备
A B C D 固定 脱水 干燥 临界点干燥 染色 离子溅射镀膜
பைடு நூலகம்Au
Pt
临界点干燥的原理 当温度、压力达到一定的数值时，气体的密度可增大到与液态一样， 此时气相与液相的界面消失，液体的表面张力亦会随之消失，这
种情况称为临界状态。
临界点干燥：利用物质在临界状态下液体表面张力被消除的特性， 克服样品干燥过程中的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。
随样品表面 结构的高低 起伏，重金 属形成不同 厚度的薄膜， 显示了投影 效果，给出 了一个样品 表面结构的 三维图像。
冰冻蚀刻电镜-观察生物膜结构
A 冰冻组织( N2)
B 真空中升华
C 重金属喷镀(Pt) D 喷碳加固(C) - SEM E 复型 - TEM
优点
* 样品不经固定、脱水、包埋，更接近自然状态 * 对样品无损伤
工作原理及过程: A 制备组织切片 B 镜下将组织切片覆以薄膜 C 激光束切割特定细胞或区域 D 收集管收集
三、细胞培养技术
（Cell culture）
从活体组织中分离出特定的细胞，在一定的 条件下进行培养，使之能够继续生存、生长以 至增殖的方法
in vitro 用培养细胞做实验 in vivo 用动物做实验
1.细胞培养的条件 (1) 固体表面：培养瓶、培养皿
(2)培养基
常见培养基：1640 DMEM
(3)无菌 无菌操作：超净工作台、火焰消毒等 培养液中加入抗菌素 器械、溶液消毒（烤箱、高压灭菌、过滤）
(4)其他
温度 37℃ 湿度 100% CO2浓度 5%
2.细胞培养的传代
原代培养:直接取材于有机体的细胞培养 取材 切割 消化 培养 传代培养:将原代培养存活的细胞从培养瓶中 取出，以1:2以上的比例扩大培养
原代培养 传代
传代培养
培养细胞的特点： 功能：保持原分化特性 形态：多不保持原有细胞形态 成纤维样细胞
上皮样细胞
3.细胞系（Cell line）
原代培养细胞成功传代即为细胞系。来源： （1）在细胞培养中，偶然情况下产生的具有无 限繁殖能力，能够无限传代的细胞群。 变异细胞
无限繁殖
细胞系
3T3 小鼠成纤维细胞
透射电镜
(2) 超薄切片的制备
A 固定 戊二醛:蛋白质
锇酸:脂类
B 脱水 上升梯度 乙醇：30% 50% 70% C 包埋 环氧树脂 D 切片 500 –700 Å
80%
90%
95%
100%
E 重金属染色 U(醋酸双氧铀)
Pb(柠檬酸铅)
生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力 弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进 行染色。