ELISA实验常见问题
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
释观测它的恢复性
标准曲线很 好
但是标本的 标本中含的细胞因子水 将标本做稀释并再次实
判读
平超过实验范围
验
值很高
当使用HRP 酶
结合物时， TMB
底物加终止 液后
孔中的试剂显色不充分
显绿色
轻轻震荡板子
边缘效应
工作环境温度不均衡
避免将板子在变化温度 环境中孵育
整个实验应连续操作：
实验过程中出现间断
在实验开始前将所有标 准品和标本做适当的准
是否在规定的时间内检 测。
仪器设定不正确，滤光 检查仪器是否设定正
片不匹配
确，滤光片的使用等
洗涤操作不规范
洗板不充分，使用手工 洗板常出现。最好使用 洗板机，或使用洗瓶洗 涤。每孔应完全充满洗 涤缓冲液，倾出时应迅 速。若使用洗板机，应 校准并设定足够充满每 孔的体积量。板的内侧 不应接触设备。检查每 孔是否有残留的洗液或 每孔加样量的体积是否 正确。在两次洗板之间
板子显色不足
延长底物孵育实验 使 用推荐品牌的底物溶液
操作不慎
回顾ELISA操作流程，消 除任何擅自修改的程序
标准曲线稀释度计算有 核查计算的情况，制备
误
新的标准曲线
标准曲线很好 但是没有任何期
在标本中无相应的细胞 因子
使用内参照重复实验， 重新考虑实验的相应参
数
望的阳性信号产 生
标本基质遮盖检测
将标本至少做1:2相应 的稀释，或进行系列稀
试剂？
是否可增加 或
减少标本的 体积？
商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的， 应按说明说操作，不建议更改所加标本的体积。
是否可重确 定
自己的标准 曲线
的点
可以。说明书上有建议的制备标准曲线时标准品 的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但 是必须在实验范围内，高于试剂盒中最高标准品
的点和低于灵敏度以下的点是无效的
加30秒的浸泡。
高背景（本 底）
实验中孵育温度和时间 确定每一实验步骤的孵
不适当ห้องสมุดไป่ตู้
育温度和时间是否适当
酶加量过多
加酶前验看移液器调节 量是否准确。检查稀释 度，若必要进行效价测
定
封闭不完全
检查封闭液的计算量； 提高封闭时间
标本或标准品中的干扰 物质
做适当的对照
显色剂受光照时间较 显色剂A和B应于使用前
问题
ELISA实验常见问题 可能原因
解决方法
试剂孵育的时间没有按 说明书操作
确定生物素抗体，连接 的HRP试剂或链霉亲和 素-HRP使用的时间是否
适当
不同试剂盒或不同批号 的试剂混用
重新检查试剂的标签， 确准所有组份都属于正 使用的试剂盒中的。不 能混用不同试剂盒或不
同批号的试剂
漏加酶或显色剂
检查操作流程，注意不 要漏加
确定每两步骤间，酶标 板应保持湿润。使用封 板膜封口，注意每步使
用新鲜的封板膜。
高CV值 （CV：
Coefficient of
由于操作失误或板子质 量差（结合不均匀）造
成包板不均匀。
稀释用的PBS中不要加 其它蛋白，检查包被和 封闭液体积、时间和试 剂加入的方法。检查所 使用的酶标板，使用 ELISA板子（不要使用组
细胞成分
用凝血（溶血）标本
缓冲液污染
制备新鲜的缓冲液
酶结合物不足
检查稀释度，必要时进 行效价测定
标准曲线 可
得到，但两 点之
间区别很差 （低
或平地曲 线）
检查所使用的酶标板，
捕获抗体没有很好结合 到板上
使用ELISA板子（不要使 用组织培养板）稀释用 的PBS中不要加其它蛋
白
检测抗体不足
检查稀释度，必要时进 行效价测定
织培养板）
variation）， 花板
移液器不准确，吸头重 复使用
检查并校准移液器。每 次取样必须换吸头。回 顾标本的加入步骤，确 保每次加样的准确性， 保证吸取的液体按所设 定的体积吸入和排出， 连续加样时注意检查吸 头，确保所加液体的体
积。
样品离心处理不全，反 应孔内发生凝集或残留
标本充分离心，严禁使
使用了被污染的试剂 检查试剂是否被污染
显色弱
标准品/标本制备方法 不规范
检查标准品/标本的制 备，标准品应按说明书 进行复溶和稀释。低温 贮存的标本避免反复冻 融，严禁使用溶血标
本。样品用NaN3防 腐，抑制了酶的反应。
显色底物制备不规范
检查底物的制备，如体 积是否正确，混合是否
恰当充分。
检测时间不当
备
漂移
在所有试剂加入孔前，
试剂没有按说明书平衡 确保它们已平衡至室
至室温
温，除非说明书中有另
外的要求
是否可更 改
试剂盒提供 的实
验操作步 骤？
一般厂商为确保最高的灵敏度和特异性，对试剂 盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范
性应按说明书操作
是否可混 用
不同试剂盒 不行。绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的。 中的
使用前看清标签。
缓冲液污染
配制新新鲜的缓冲液
加入试剂的体积和时间 有误
确定所使用的每一个试 剂的体积正确的和加入
的时间是适当的。
试剂、样品用前未能平 用前试剂、样品置室温
衡
平衡10分钟左右
缩短孵育时间能使实验 的信号变弱
检查温育的时间
在温度变化的环境内孵 确定孵育的温度，应避
显色弱
育酶标板
免温度的变化
长，或污染
10分钟从冰箱取出
整批样品放置时间过 样品应保持新鲜，或低
长，样品污染
温保存，防止污染
缓冲液污染
制备新鲜的缓冲液
高背景（本 底）
吸头重复使用，未洗净 或消毒不完全而用于加 吸头尽可能一次性使用
酶或显色剂
按说明书洗板、加样、 操作不慎或洗涤不充分 显色。洗板尤为重要，
如上所述
出现干板，没有使用封 板膜、封板膜重复使用
无颜色
HRP酶污染了叠氮钠
使用新配制的试剂，禁 含叠氮钠
按说明书检查标准品的
标准品有问题（若在标
制备
本孔中有信号）
使用新标准品
某一容器未洗净，残留 灭火酶物质
尽可能用试剂盒内容 器，另觅一定要洁净、
可靠
使用含血清的缓冲液配 制/复溶抗体
重新确认所选用的试剂
将实验重做；严格按说 试剂配制/使用有误 明书操作，每次配制和
标准曲线很 好
但是标本的 标本中含的细胞因子水 将标本做稀释并再次实
判读
平超过实验范围
验
值很高
当使用HRP 酶
结合物时， TMB
底物加终止 液后
孔中的试剂显色不充分
显绿色
轻轻震荡板子
边缘效应
工作环境温度不均衡
避免将板子在变化温度 环境中孵育
整个实验应连续操作：
实验过程中出现间断
在实验开始前将所有标 准品和标本做适当的准
是否在规定的时间内检 测。
仪器设定不正确，滤光 检查仪器是否设定正
片不匹配
确，滤光片的使用等
洗涤操作不规范
洗板不充分，使用手工 洗板常出现。最好使用 洗板机，或使用洗瓶洗 涤。每孔应完全充满洗 涤缓冲液，倾出时应迅 速。若使用洗板机，应 校准并设定足够充满每 孔的体积量。板的内侧 不应接触设备。检查每 孔是否有残留的洗液或 每孔加样量的体积是否 正确。在两次洗板之间
板子显色不足
延长底物孵育实验 使 用推荐品牌的底物溶液
操作不慎
回顾ELISA操作流程，消 除任何擅自修改的程序
标准曲线稀释度计算有 核查计算的情况，制备
误
新的标准曲线
标准曲线很好 但是没有任何期
在标本中无相应的细胞 因子
使用内参照重复实验， 重新考虑实验的相应参
数
望的阳性信号产 生
标本基质遮盖检测
将标本至少做1:2相应 的稀释，或进行系列稀
试剂？
是否可增加 或
减少标本的 体积？
商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的， 应按说明说操作，不建议更改所加标本的体积。
是否可重确 定
自己的标准 曲线
的点
可以。说明书上有建议的制备标准曲线时标准品 的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但 是必须在实验范围内，高于试剂盒中最高标准品
的点和低于灵敏度以下的点是无效的
加30秒的浸泡。
高背景（本 底）
实验中孵育温度和时间 确定每一实验步骤的孵
不适当ห้องสมุดไป่ตู้
育温度和时间是否适当
酶加量过多
加酶前验看移液器调节 量是否准确。检查稀释 度，若必要进行效价测
定
封闭不完全
检查封闭液的计算量； 提高封闭时间
标本或标准品中的干扰 物质
做适当的对照
显色剂受光照时间较 显色剂A和B应于使用前
问题
ELISA实验常见问题 可能原因
解决方法
试剂孵育的时间没有按 说明书操作
确定生物素抗体，连接 的HRP试剂或链霉亲和 素-HRP使用的时间是否
适当
不同试剂盒或不同批号 的试剂混用
重新检查试剂的标签， 确准所有组份都属于正 使用的试剂盒中的。不 能混用不同试剂盒或不
同批号的试剂
漏加酶或显色剂
检查操作流程，注意不 要漏加
确定每两步骤间，酶标 板应保持湿润。使用封 板膜封口，注意每步使
用新鲜的封板膜。
高CV值 （CV：
Coefficient of
由于操作失误或板子质 量差（结合不均匀）造
成包板不均匀。
稀释用的PBS中不要加 其它蛋白，检查包被和 封闭液体积、时间和试 剂加入的方法。检查所 使用的酶标板，使用 ELISA板子（不要使用组
细胞成分
用凝血（溶血）标本
缓冲液污染
制备新鲜的缓冲液
酶结合物不足
检查稀释度，必要时进 行效价测定
标准曲线 可
得到，但两 点之
间区别很差 （低
或平地曲 线）
检查所使用的酶标板，
捕获抗体没有很好结合 到板上
使用ELISA板子（不要使 用组织培养板）稀释用 的PBS中不要加其它蛋
白
检测抗体不足
检查稀释度，必要时进 行效价测定
织培养板）
variation）， 花板
移液器不准确，吸头重 复使用
检查并校准移液器。每 次取样必须换吸头。回 顾标本的加入步骤，确 保每次加样的准确性， 保证吸取的液体按所设 定的体积吸入和排出， 连续加样时注意检查吸 头，确保所加液体的体
积。
样品离心处理不全，反 应孔内发生凝集或残留
标本充分离心，严禁使
使用了被污染的试剂 检查试剂是否被污染
显色弱
标准品/标本制备方法 不规范
检查标准品/标本的制 备，标准品应按说明书 进行复溶和稀释。低温 贮存的标本避免反复冻 融，严禁使用溶血标
本。样品用NaN3防 腐，抑制了酶的反应。
显色底物制备不规范
检查底物的制备，如体 积是否正确，混合是否
恰当充分。
检测时间不当
备
漂移
在所有试剂加入孔前，
试剂没有按说明书平衡 确保它们已平衡至室
至室温
温，除非说明书中有另
外的要求
是否可更 改
试剂盒提供 的实
验操作步 骤？
一般厂商为确保最高的灵敏度和特异性，对试剂 盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范
性应按说明书操作
是否可混 用
不同试剂盒 不行。绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的。 中的
使用前看清标签。
缓冲液污染
配制新新鲜的缓冲液
加入试剂的体积和时间 有误
确定所使用的每一个试 剂的体积正确的和加入
的时间是适当的。
试剂、样品用前未能平 用前试剂、样品置室温
衡
平衡10分钟左右
缩短孵育时间能使实验 的信号变弱
检查温育的时间
在温度变化的环境内孵 确定孵育的温度，应避
显色弱
育酶标板
免温度的变化
长，或污染
10分钟从冰箱取出
整批样品放置时间过 样品应保持新鲜，或低
长，样品污染
温保存，防止污染
缓冲液污染
制备新鲜的缓冲液
高背景（本 底）
吸头重复使用，未洗净 或消毒不完全而用于加 吸头尽可能一次性使用
酶或显色剂
按说明书洗板、加样、 操作不慎或洗涤不充分 显色。洗板尤为重要，
如上所述
出现干板，没有使用封 板膜、封板膜重复使用
无颜色
HRP酶污染了叠氮钠
使用新配制的试剂，禁 含叠氮钠
按说明书检查标准品的
标准品有问题（若在标
制备
本孔中有信号）
使用新标准品
某一容器未洗净，残留 灭火酶物质
尽可能用试剂盒内容 器，另觅一定要洁净、
可靠
使用含血清的缓冲液配 制/复溶抗体
重新确认所选用的试剂
将实验重做；严格按说 试剂配制/使用有误 明书操作，每次配制和