ELISA实验操作中常见问题分析

ELISA实验操作中常见问题分析

1 标本及采集、贮运因素

严峻溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时刻快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不完全、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。

血清标本宜在新奇时检测，严峻溶血标本禁用。一样说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中储存时刻过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃储存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并幸免产动气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，因此测抗体的血清标本如需储存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

2、试剂的阻碍

ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的缘故，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采纳了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏锐度不够，稳固性也成问题。也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏锐度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就HCV-ELISA 试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，要紧是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品差不多上采纳了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳固、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代试剂的敏锐度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下：

基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：

a.分子量大。合成肽采纳化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。

b.稳固性好。包被的抗原的稳固性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4 个月，采纳基因工程抗原后效期大大延长了。

c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。

d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。

合成多肽抗原是依照蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点： a.分子量太小；b.一样只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳固性差。

国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏锐性分别为89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳固比较差。使用质劣的试剂必定导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。

•选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳固性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的要紧依据。

•要注意试剂的批号和出厂日期，尽管试剂的有效期多为1年。最好选择刚出厂的试剂使用。

不同厂家的试剂不能混用。

不同方法学的检测试剂，会使两对半结果显现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg 结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。

3、操作技术的阻碍

操作过程的操纵：

⑴严格按照试剂说明书进行操作。操作前将试剂在室温下平稳30～60min。

⑵加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按说明步骤严格操纵操作时刻，防止孵育时刻人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗完全。

(3)封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的显现。

(4)用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择洁净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的显现。

(5)合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时刻长。

(6)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

(7)显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。

(8)加样时保持显色剂不外流；A、B液应幸免接触金属器械。加终止液时应幸免产动气泡。

(9)应保证酶标板清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施能够使“花板”降至最低限度。从而提高检测的特异性。并得到更准确、可靠的实验结果。

加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直截了当阻碍检测结果。由于吸嘴构造专门，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，幸免加在孔壁上部，并注意不可溅出。

温浴阻碍，在建立ELISA 方法作反应动力学研究时，实验说明，两次抗原抗体反应一样在37℃经1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为幸免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平稳。应注意温育的温度和时刻应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采纳水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判定结果，将质控放在非边缘位置。96孔酶标板结构专门；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。

洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 确实是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。能够说在ELISA 操作中，洗涤是最要紧的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。

洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，各种试剂盒的洗液不要混用。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一样是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。洗液需要稀释，应按要求稀释。配制洗液应用新奇的和高质量的纯化水，电导率小于1.5μs/cm，洗液假如结晶应待其融解后配制。手洗条件一致性较差，对结果阻碍较大，防止洗液在孔内形成气泡。半自动与全自动冼板机使用不当也会阻碍结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全堵塞或半堵塞状态，造成未结合标记酶洗脱不完全，导致“花板”造成假阳性或假阴性；因此操作洗板机过程中要不时观看洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。

保证洗板浸泡时刻为40 秒左右，孔内液体被洗板机吸得越洁净洗涤成效更好，手工洗板

4.显色和比色

TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，赶忙逐步减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色坚持较长时刻（12-24 小时）不褪，是目视判定的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，现在可用特定的波长（450nm）测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA 结果吸光度的光度计。酶标仪的要紧性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范畴、线性等等。优良的酶标仪的读数一样可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照耀下，操作时室温宜在15 -30℃，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳固。

测读A 值时，要选用产物的敏锐吸取峰，如OPD用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏锐波长（W2），两次测定间不移动ELISA