免疫学--ELISA原理
ELISA完整详解
ELISA完整详解(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于4 50nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D 值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
ELISA实验原理
ELISA实验原理ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测体液中的特定抗原或抗体的存在和浓度。
其原理是将待检测物与特异性抗体进行反应，通过酶标记反应产生可检测的信号。
直接ELISA是最简单的ELISA形式。
首先，待检测物（抗原）被固定在高吸附力的微孔板上。
然后，加入特异性抗体与待检测物结合，形成抗原-抗体复合物。
接着，加入酶标记化的二抗与抗体结合，并经过洗涤去除未结合的分子。
最后，加入底物，酶作用产生可检测的信号。
间接ELISA是通过在待检测物上结合特异性抗体，然后使用酶标记的次级抗体来检测。
首先，待检测物（抗原）与微孔板结合。
然后，加入特异性抗体与待检测物结合，并经过洗涤去除未结合的分子。
接着，加入酶标记化的次级抗体，它可以与特异性抗体结合。
再次经过洗涤，加入底物，酶作用产生可检测的信号。
竞争ELISA用于测定体液中抗原或抗体的浓度。
首先，待检测物（抗原）与微孔板结合。
然后，加入酶标记化的特异性抗体与待检测物结合。
接下来，加入待检测物与抗原竞争结合的未标记特异性抗体。
随后，加入底物，酶作用产生可检测的信号。
待测物浓度越高，未标记抗体与抗原竞争的就越多，导致酶标记抗体的结合减少，从而信号强度减弱。
免疫酶染色法用于定位特定抗原或抗体的位置。
首先，待检测物（抗原）与微孔板结合。
然后，加入特定抗体与待检测物结合，形成抗原-抗体复合物。
接下来，加入酶标记化的二抗与特异性抗体结合，并经过洗涤去除未结合的分子。
最后，加入底物，酶作用产生染色物质，可通过显微镜观察抗原或抗体的位置。
总结起来，ELISA是一种基于抗原-抗体反应并使用酶标记物的免疫学实验方法。
通过调整实验条件和所使用的抗体类型，可以检测不同的待测物，并确定其浓度或位置。
ELISA技术广泛应用于医学、生命科学研究和临床诊断等领域，发挥着重要的作用。
ELISA六种方法类型及原理
ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶标检测）是用于检测免疫学反应的一种技术，全称为酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA），该技术是测定抗体及抗原的特异性相互作用的一种常用的检测方法。
ELISA通过酶联试验来灵敏地检测特异性抗体或抗原的含量。
ELISA检测方法有很多种。
常用的ELISA检测方法有以下六种：一、双抗体沉淀反应ELISA（DAP-ELISA）双抗体沉淀反应ELISA是一种比较简单的ELISA方法，该方法的原理是，在受体表面点涂两种类型的抗体，例如兔抗人IgG，而免疫反应物则是人IgG，受体与免疫反应物结合后，形成抗体-抗原复合物，其上自发形成特异性沉淀。
随着浓度的增加，抗原越多，沉淀凝固物也越多，膜上形成沉淀下降，沉淀量可以通过酶标仪测定，或者免疫发光法检测，大体上，兔抗人IgG及抗原分别点涂及酶标探针可能以1:1:2的比例，也就是在100 L的反应液中加入到受体和兔抗人IgG各10 L，抗原20 L的条件下进行反应。
二、夹心ELISA（Sandwich ELISA）夹心ELISA是一种常见的ELISA检测方法，它利用特殊的标记抗体完成免疫反应，以达到检测目的。
以IgG为例，在受体表面点涂一种特异性抗体,如兔抗人IgG，受体与人IgG结合形成复合物，在这一抗原复合物上再添加第二种特异性抗体，如抗兔IgG，第二种抗体结合复合物，并将复合物结合在受体表面，形成抗原“夹心环”，该免疫反应体系可以通过酶标仪来检测指示物的夹心量，计算受体中抗原的含量。
三、竞争ELISA（Competitive ELISA）竞争ELISA提高ELISA检测的灵敏度，竞争式ELISA也属ELISA技术范畴，该技术通过特异性抗体与抗原间竞争性结合而形成的结果来检测特异性抗原的浓度。
竞争ELISA的原理是：将偶氮羟化物体表膜点涂含有特异性抗原区域的抗体，若添加一定量的抗原（相同的特异性抗原）至反应液，则可形成抗原-抗体复合物，受体与抗原的竞争性结合，而非特异性的抗体-抗原复合物。
ELISA检测方法
ELISA检测方法ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学检测方法，广泛应用于医学、生物科学及环境科学等领域。
该方法利用抗体和酶的相互作用，能够检测和测定特定抗原或抗体的存在和浓度。
下面将详细介绍ELISA的原理、步骤、应用以及优缺点。
ELISA的原理主要基于抗原-抗体结合的原理。
首先，在固体表面（晶髓酶标板等）上吸附或共价结合抗原，形成抗原固相。
然后，将待测样品加入酶标板孔中与固定的抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物。
随后加入特异性的酶标记抗体，使其与复合物形成二抗三重复合物。
最后，通过添加底物，酶催化底物产生可检测的色变反应，测定抗原或抗体的浓度。
1.抗原固定：将已知浓度的抗原加入酶标板中，并使其吸附在固体表面，形成抗原固相。
固相吸附通常通过物理吸附或共价结合实现。
2.试样加入：将待测样品加入酶标板中与固定抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物。
通常需要对样品进行初步处理，如稀释、加入染色剂等。
3.二抗加入：将特异性酶标记的二抗加入酶标板中，与复合物发生特异性反应，形成二抗三重复合物。
4.清洗：通过洗涤剂将非特异性结合物洗去，以减少干扰。
5.基质加入：加入特定底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯二胺）或ABTS（2,2'-联氨基二（2-甲基丙酰氧）乙烷磺酸铵），酶催化产生彩色反应。
6.反应停止：用酸、碱或金属离子等停止反应，阻断底物的氧化反应，维持产色稳定。
7.反应测定：使用光度计测定产生的色素的吸光度或荧光。
ELISA具有广泛的应用。
在医学领域，ELISA常用于检测血液中的抗体和抗原，从而诊断传染病、自身免疫疾病等。
在生物科学研究中，ELISA可用于测定细胞因子、蛋白质等生物大分子的浓度。
此外，ELISA也可以用于检测环境样品中的污染物，如重金属、农药等。
1.灵敏度高：ELISA可以检测到较低浓度的抗原或抗体，常常超过其他方法的敏感度。
2.特异性强：ELISA利用特异性抗体进行识别，可准确检测特定的抗原或抗体。
ELISA原理和实验
ELISA原理和实验ELISA的原理基于免疫学和酶学的原理。
它利用抗原与抗体之间的高度专一性和互相结合的性质，通过将抗原或抗体固定在固相（如微孔板）上，再加入未标记或标记有酶的抗体或抗原，利用酶反应可见色素形成的特性来测定目标物的存在和浓度。
直接ELISA是一种简单的ELISA方法，直接测定样品中的抗原。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，将含有抗原的样品加入微孔板孔中，抗原与涂覆的抗体结合。
接下来，加入与抗原特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗体），洗涤掉非特异性结合物质，并使抗原与酶标记物的抗体发生结合。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗原的存在和浓度。
间接ELISA是一种常用的ELISA方法，用于检测抗体。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗原或蛋白质，使其与微孔板表面结合。
然后，加入样品，例如患者血清，其中包含待测抗体。
接下来，加入与待测抗体特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗人或抗动物IgG抗体），洗涤掉非特异性结合物质。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗体的存在和浓度。
竞争ELISA也称为抗原饱和法，用于测定溶液中的抗原。
首先，在微孔板上涂覆纯化的抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，加入含有已知浓度的抗原的样品溶液和待测抗原样品溶液，它们将竞争与涂覆的抗体结合。
接下来，加入与该抗原特异性结合的抗体（通常是与酶标记物共偶联的抗体），洗去未结合的抗体。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定待测抗原的存在和浓度。
夹心ELISA是一种用于检测特定抗原的双抗体夹心法。
首先，在微孔板上涂覆特异性抗体，使其与微孔板表面结合。
然后，加入待测样品，使其与固定的抗体结合。
接下来，加入另一种特异性抗体（通常与酶标记物共偶联的抗体），使其与抗原结合。
最后，加入适当的底物，通过酶反应产生的可见色素变化测定抗原的存在和浓度。
ELISA的基本原理和方法
ELISA的基本原理和方法ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)，也称为酶联免疫吸附法，是一种常用的免疫学检测方法，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发中。
ELISA的基本原理是利用抗原与抗体之间的特异结合来检测和量化抗原或抗体的存在。
ELISA的基本方法是将待测物（抗原或抗体）与特异性的抗体进行相互作用，然后使用染色反应来测定这种相互作用的程度。
通常，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等不同的变种。
直接ELISA是最简单的一种ELISA方法。
它首先在固体载体（如酶标板）上固定抗原，然后将样品中的抗体添加到载体上与固定的抗原相结合。
随后，用与待测物标记有酶的抗体（通常是辣根过氧化物酶，HRP）与结合的抗体结合。
最后，加入适当的底物，通过测量酶催化反应产生的颜色变化程度来定量检测待测物的浓度。
间接ELISA是一种更常见的ELISA方法。
在这种方法中，首先在固体载体上固定抗原，然后加入待测物，使其与固定的抗原结合。
随后，加入一个与待测物结合的辣根过氧化物酶标记的二抗（通常是兔抗人IgG），这个二抗与待测物结合形成免疫复合物。
最后，加入适当的底物，通过测量酶催化反应产生的颜色变化程度来定量检测待测物的浓度。
相比直接ELISA，间接ELISA可以提高信号的灵敏度。
竞争ELISA是一种用于检测样品中抗原浓度的ELISA方法。
在这种方法中，固定的抗原被标记有酶的与待测抗原存在竞争关系的抗体结合。
然后，待测样品中的抗原与标记抗原竞争与抗体结合。
待测样品中抗原的浓度越高，与标记抗原结合的越少，最终测量得到的信号越低，从而可以根据信号的强度来定量检测待测样品中抗原的浓度。
间接竞争ELISA是竞争ELISA的一种变种。
在间接竞争ELISA中，待测物直接与固定的抗原结合，与待测物结合的酶标记抗体被加入到待测物与固定抗原结合的位置。
ELISA原理及步骤
ELISA原理及步骤ELISA，即酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay），是一种常见的免疫学实验技术，在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。
它基于抗原与抗体的特异性结合，在酶的催化下，通过颜色的变化来检测和定量分析目标分子的存在。
一、ELISA原理1.包被：将抗原或抗体固定在微孔板表面。
2.孵育：加入待测标本，使抗原和抗体充分结合。
3.清洗：去除未结合的物质。
4.检测：加入酶标记的抗体或底物，与已结合的抗原或抗体反应。
5.测定：加入底物后，产生可测量的信号，如颜色变化。
6.分析：对信号进行测量和定量分析。
二、ELISA步骤1.准备试剂和材料：-抗原或抗体：根据需要选择合适的抗原或抗体。
-微孔板：常用的是96孔或384孔微孔板。
-缓冲液：包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。
-酶标记二抗和底物：根据需要选择适合的酶标记二抗和底物。
2.包被抗原或抗体：-将抗原或抗体稀释至合适的浓度。
-加入微孔板孔中，使其吸附在孔底。
-孵育在4℃或37℃下，一般需要数小时或过夜孵育。
3.添加标本和控制样品：-将待测标本和控制样品逐孔加入微孔板中。
-孵育一段时间，使抗原和抗体发生特异性结合。
4.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。
-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。
5.加入酶标记二抗：-将酶标记的二抗加入每个孔中。
-孵育一段时间，使其与已结合的抗原或抗体结合。
6.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。
-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。
7.加入底物：-加入适合的底物。
-孵育一段时间，使底物与酶发生反应。
8.反应停止：-加入适当的溶液，停止底物酶反应。
9.测定信号：-使用光密度测定仪读取每个孔的吸光度。
-记录吸光度值，用于后续数据分析和定量结果。
三、ELISA的注意事项-实验过程中需严格控制温度和时间，尤其是孵育和洗涤步骤。
-各个试剂需事先准备好，避免其中一步骤时间过长导致信号的变化。
elisa间接法原理
elisa间接法原理
Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，它可以用来检测和定量分析目标物质（如抗体、抗原、蛋白质等）的存在和浓度。
Elisa间接法是其中一种常见的Elisa技术。
Elisa间接法的原理基于免疫反应的特性。
它利用特异性的抗体与待测物质发生反应，通过观察或测量信号的强度来确定目标物质的存在和浓度。
下面是Elisa间接法的步骤：
1. 修复：将待测样品固定在试板上，通常是通过加入乙醛或其他化学物质来使样品中的蛋白质固定在试板表面。
2. 阻断：添加阻断剂（如牛血清蛋白）来封闭未被固定的试板表面，以减少非特异性结合。
3. 第一次孵育：加入特异性的初级抗体，这些抗体会与待测物质结合。
初级抗体可以是针对待测物质的抗体，也可以是其他与待测物质无关但具有识别能力的抗体。
4. 第二次孵育：加入与初级抗体结合的辅助抗体。
这些辅助抗体通常是与初级抗体来源物种不同的抗体，可以通过酶标记、荧光标记等方式进行标记。
5. 底物添加：加入合适的底物，底物会与酶标记的辅助抗体发生反应，并产生可观察的信号（如颜色变化、荧光强度）。
6. 反应停止：通过添加反应停止剂，终止底物的反应过程。
7. 信号检测：使用光谱仪、荧光仪或其他相关设备，测量底物反应生成的信号的强度，该信号的强度与目标物质的存在和浓度相关。
Elisa间接法通过利用辅助抗体的酶标记或标记物来放大信号，提高对目标物质的灵敏度和检测能力。
它具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围，在医学诊断、生物学研究和药物开发等领域得到广泛应用。
1。
ELISA的概念、原理、操作步骤
ELISA的概念、原理、操作步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorentAay)的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、��9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05MH9.�短妓嵫伟�被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg ／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0. 1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“ "、“-"号表示。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immuno sorbn ent Assay)的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELI SA间接法。
(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
elisa法原理
elisa法原理Elisa法原理。
ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种广泛应用于生物化学和免疫学领域的实验技术，它通过测定抗体和抗原之间的相互作用来检测特定的蛋白质或其他分子。
ELISA法的原理基于酶标记抗体和底物的相互作用，通过酶的催化作用产生可定量检测的信号。
下面我们将详细介绍ELISA法的原理。
首先，ELISA法的基本原理是将待测样品中的抗原或抗体与已知的酶标记抗体或抗原结合，形成复合物。
然后，将这些复合物通过洗涤等步骤固定在固相载体（如微孔板）上。
接着，加入底物，酶标记物将催化底物的变化，产生可定量检测的信号。
最后，通过测定信号的强度，可以确定待测样品中抗原或抗体的浓度或存在与否。
其次，ELISA法可以根据酶标记抗体或抗原的不同，分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等类型。
直接ELISA是将酶标记抗体直接与待测样品中的抗原结合；间接ELISA是先与待测样品中的抗原结合，再加入酶标记的二抗；竞争ELISA是将待测样品中的抗原与固相载体上的抗原竞争结合，再加入酶标记的抗体；间接竞争ELISA是将待测样品中的抗原与固相载体上的抗体竞争结合，再加入酶标记的二抗。
不同类型的ELISA法适用于不同的实验需求，可以根据具体的实验目的选择合适的类型。
最后，ELISA法具有高灵敏度、高特异性和高重复性等优点，因此被广泛应用于生物医学研究、临床诊断、药物筛选等领域。
同时，ELISA法也存在一些局限性，如对抗体和抗原的特异性要求较高、操作步骤较多等。
因此，在进行ELISA实验时，需要严格按照操作规程进行，以确保实验结果的准确性和可靠性。
综上所述，ELISA法是一种基于酶标记抗体和抗原相互作用的实验技术，具有广泛的应用前景。
通过对ELISA法的原理和类型的深入了解，可以更好地进行实验设计和数据分析，为科研工作和临床诊断提供有力支持。
ELISA的种类及原理
ELISA的种类及原理ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学检测方法，用于测定血清或其他体液中特定物质（例如抗体、抗原、蛋白质等）的存在和浓度。
ELISA有多种类型和原理，包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA和发光ELISA等。
直接ELISA是最简单的ELISA类型之一、在该实验中，微孔板表面涂层有特定抗原，样品中的特定抗体与其结合。
然后，酶标记的二抗（例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗IgG抗体）结合到已结合的抗体上。
最后，用底物（例如TMB）来测定酶的活性并测定反应产物的光密度，以确定特定物质的浓度。
间接ELISA是最常见的ELISA类型之一，用于检测抗体。
在间接ELISA中，微孔板表面涂有特定抗原。
然后，样品中的待测抗体与其结合。
酶标记的二抗（例如HRP标记的抗IgG抗体）结合到已结合的抗体上。
最后，用底物测定酶的活性并测定反应产物的光密度，以确定待测抗体的浓度。
竞争ELISA也称为反竞争ELISA，用于测定抗体或抗原的浓度。
在竞争ELISA中，微孔板表面涂有特定抗原。
样品中的特定抗体与抗原结合，然后酶标记的同种抗体也与抗原结合。
这两种抗体竞争着结合到抗原的位点上，从而影响酶标记的抗体结合。
用底物测定酶的活性并测定反应产物的光密度，可以推断出待测抗体的浓度。
夹心ELISA也称为间接夹心ELISA，用于检测抗原。
在夹心ELISA中，微孔板上涂有待测抗原。
样品中的抗体与抗原结合，并形成复合物。
然后，酶标记的二抗结合到复合物上。
最后，用底物测定酶的活性并测定反应产物的光密度，以确定待测抗原的浓度。
发光ELISA（化学发光ELISA）是一种基于光发射的ELISA类型，在检测中使用荧光底物。
发光ELISA适用于检测低浓度的特定物质，并具有较低的背景信号和高的灵敏度。
酶标记的二抗结合到已结合的抗体上，产生与样品中特定物质浓度相关的荧光信号，通过测量发出的荧光信号来检测待测物质。
ELISA原理和分类(附图解)
一、ELISＡ旳原理ELIＳA旳基础是抗原或抗体旳固相化及抗原或抗体旳酶标记。
结合在固相载体表面旳抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记旳抗原或抗体既保存其免疫学活性，又保存酶旳活性。
在测定期,受检标本(测定其中旳抗体或抗原）与固相载体表面旳抗原或抗体起反映。
用洗涤旳措施使固相载体上形成旳抗原抗体复合物与液体中旳其他物质分开。
再加入酶标记旳抗原或抗体，也通过反映而结合在固相载体上。
此时固相上旳酶量与标本中受检物质旳量呈一定旳比例。
加入酶反映旳底物后,底物被酶催化成为有色产物，产物旳量与标本中受检物质旳量直接有关,故可根据呈色旳深浅进行定性或定量分析。
由于酶旳催化效率很高,间接地放大了免疫反映旳成果,使测定措施达到很高旳敏感度。
二、EＬISA旳类型ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。
在这种测定措施中有三个必要旳试剂:(1)固相旳抗原或抗体,即＂免疫吸附剂＂（immunoｓorbｅnｔ)；（2)酶标记旳抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conｊugate）；（3)酶反映旳底物。
根据试剂旳来源和标本旳状况以及检测旳具体条件,可设计出多种不同类型旳检测措施。
用于临床检查旳ELＩS Ａ重要有如下几种类型:（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用旳措施,操作环节如下：(1）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。
洗涤除去未结合旳抗体及杂质。
（2) 加受检标本,保温反映。
标本中旳抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
(3) 加酶标抗体,保温反映。
固相免疫复合物上旳抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合旳酶标抗体。
此时固相载体上带有旳酶量与标本中受检抗原旳量有关。
(4) 加底物显色。
固相上旳酶催化底物成为有色产物。
通过比色,测知标本中抗原旳量。
在临床检查中，此法合用于检查多种蛋白质等大分子抗原，例如HB ｓＡｇ、HBeAg、ＡFＰ、ｈＣG等。
只要获得针对受检抗原旳异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
ELISA原理及步骤
ELISA原理及步骤ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附法）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的分析技术。
它基于免疫学原理，通过检测特定抗原和抗体的结合来定量测定目标物。
1.直接ELISA的原理及步骤：直接ELISA方法适用于已知抗体，且目标物的抗原性较好的情况。
该方法将特异性的抗原通过硫酸盐或其他方法固定于微孔板上，然后用荧光素标记的抗体与其结合，最后通过测量荧光素的荧光强度来进行定量测定。
步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。
2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。
3）加入荧光素标记的抗体，与抗原特异性结合。
4）洗涤净化微孔板以除去未结合的荧光素标记的抗体。
5）加入底物，并进行发光强度测定。
6）测量荧光素的荧光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。
2.间接ELISA的原理及步骤：间接ELISA方法适用于已知抗原，但目标物的抗原性较差的情况。
该方法在抗原固定之后，加入绕行适体素标记的次级抗体，通过该次级抗体与目标物特异性结合，最后通过测量标记抗体的发光强度来进行定量测定。
步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。
2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。
3）加入特异性的初级抗体与目标物结合。
4）洗涤净化微孔板以除去未结合的初级抗体。
5）加入绕行适体素标记的次级抗体，使其与初级抗体结合。
6）洗涤净化微孔板以除去未结合的次级抗体。
7）加入底物，并进行发光强度测定。
8）测量标记抗体的发光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。
3.竞争ELISA的原理及步骤：竞争ELISA方法适用于已知抗体和已知抗体与抗原的结合关系的情况。
该方法将标记抗原与固定抗原共同加入到微孔板中，通过测量标记抗原与抗体的竞争情况来进行定量测定。
步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。
2）将标记抗原共同加入到微孔板中。
免疫学实验二 ELISA(双抗夹心法)1
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3
ELISA的测定方法包括：
双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法 间接法：检测抗体最常用的方法 竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体 生物素－亲和素系统ELISA法：是在ELISA中引入生物素或亲 和素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法。
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4
直接法
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间接法
5
大于0.05按实际OD值计算判断值。
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15
注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
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16
思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
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13
OPD（邻苯二胺）经酶 作用后的显色反应
终
终
止
止
前
前
终
终
止
止
后
TMB四甲基联苯胺经酶作后
用后的显色反应
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14
结果判断：
计算：判断值＝阴性对照平均OD值×2.1 结果判断：待测样品孔OD值大于或等于判断值为阳性；
小于判断值为阴性。 注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，ppt课件完整6
BAS-ELISA
biotin-avidin-system，生物素-亲和素系统 此法敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。
酶 生物素
待检标本
底物
5.加底物显色
亲和素
4.加酶标记的亲和素
电化学发光免疫分析的原理
电化学发光免疫分析的原理电化学发光免疫分析（ELISA）是一种流行的抗体检测技术，可以检测和测定抗体或抗原。
ELISA最初由发明者迪卡贝尔（Dica Bell）于1970年发明，以前称为发光免疫分析法或发光免疫比色法。
它可以快速准确地检测抗原或抗体在生物样品中的浓度。
ELISA技术的基本原理是：首先将特定的抗原和发光探针分别固定到水凝胶的微孔平板上，然后将待测样品加入微孔平板，抗原识别抗体或抗原与它结合，抗体和发光探针之间形成免疫复合物。
然后，抗体免疫复合物结合到抗原，使抗体免疫复合物和发光探针之间形成发光免疫复合物。
最后，将产生的发光免疫复合物可以在发光分析仪上读取，从而实现抗原检测目的。
ELISA技术的预处理过程是：首先将特异性抗原固定到微孔平板上，然后将抗原固定物体洗涤干净，洗涤后，将含有实验样品的溶液加入。
抗原和实验抗体在抗原上结合，产生免疫复合物。
接下来，将发光探针加入该免疫复合物，使免疫复合物和发光探针形成发光免疫复合物，以发光的方式检测体外抗原的浓度。
ELISA技术的优点是快速、准确、可重复，可以用来检测各种抗原的抗体，如霍乱抗原、疱疹病毒抗原、轮状病毒、肝炎抗原等。
ELISA 技术也可以用来研究抗体的特异性、可稳定性和稳定性，从而为研究抗原提供重要的理论基础。
ELISA技术也有一些缺点，如测定样品抗体或抗原的反应强度不够准确。
此外，ELISA技术的准确性受到实验参数的影响，如反应温度、反应时间，以及抗原和抗体的浓度和稀释比例等。
ELISA技术具有快速、可靠和可重复性等特性，是当今最常用的免疫学检测方法。
它不仅能用于抗原抗体检测，还经常被用于临床检测，用于诊断疾病，如癌症、HIV等。
ELISA技术对对医学和科学领域都具有重要的意义，它可以准确、快速地检测抗原或抗体，为疾病的早期诊断和治疗提供有效的支持。
总之，电化学发光免疫分析（ELISA）技术是一种常见的抗体检测技术，也是当今最常用的免疫学检测方法，可以根据其特定的技术原理来进行抗原检测。
elisa显色和终止原理
elisa显色和终止原理
Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用
于检测和定量分析特定抗原或抗体在样本中的存在量。
Elisa显色
和终止原理主要包括以下几个步骤：
1. 固相吸附，将特异性抗原或抗体固定在试验板上的孔中，形
成固相。
2. 样品孵育，待测样品（可能含有目标抗原或抗体）与固相中
的抗原或抗体结合，形成特异性的抗原-抗体复合物。
3. 洗涤，通过洗涤步骤去除非特异性结合的物质，以减少背景
干扰。
4. 二抗结合，加入与目标抗体或抗原结合的二抗，该二抗与酶
标记结合，形成复合物。
5. 再次洗涤，洗去未结合的二抗。
6. 显色，加入底物，使酶标记发生催化反应，产生可见的色素。
7. 终止反应，通过添加终止剂或改变条件，停止酶反应，防止进一步颜色发展。
Elisa显色和终止原理的关键在于利用特异性抗原-抗体反应，通过酶标记的二抗来放大信号，并通过底物的酶催化反应产生可见的色素。
终止反应的目的是确保反应的结束，以便准确测量和定量目标物的存在量。
总结而言，Elisa显色和终止原理通过固相吸附、样品孵育、洗涤、二抗结合、再次洗涤、显色和终止反应等步骤，利用特异性抗原-抗体反应和酶标记技术，实现对特定抗原或抗体的检测和定量分析。
elisa实验原理
elisa实验原理
ELISA实验原理
ELISA，全称为Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，中文称之为酶标免疫
吸附测定，是一种实验分析中经常使用的技术，主要用于测定抗原（抗体）或是抗体（抗原）在溶液中的浓度大小。
这种技术由华裔美国科学家吴颢德在1970s发明，是免疫学领域中非常重要的一种分析工具，得到了诸多研究者的广泛研究和使用，目前在医学、生物技术与农业等多种领域发挥着重要作用。
ELISA实验原理非常简单，是用抗体或抗原与特异性酶结合来检测抗原（抗体）和抗体（抗原）之间的相互作用，并以该相互作用反应来检测抗体或抗原的存在与否。
首先，将待测样品装入试管，然后将抗体或抗原结合到ELISA板上，以有序的排列格局形成特异性反应，之后将抗体或抗原与特异性酶结合到ELISA板中，在特许度内，将抗体或抗原与特异性酶结合形成抗原抗体复合物，使得特异性酶可以在所检测的物质上催化氧化反应，由此形成荧光信号，根据该荧光强度来确定检测物质的浓度大小。
ELISA实验有着便捷、快速、经济、可靠等一系列优点，已成为实验分析领域
中舒适且可行的一种技术，能够检测抗体与抗原之间的特异性相互作用，既可以用于医学领域又可以应用于基础研究。
然而，ELISA也有着一定的缺点，比如在抑制
竞争实验中，易受到伪阳性干扰，而且测定结果也与其他实验分析技术不太兼容，因此ELISA实验在实际应用中也是有一定的局限性的。
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ELISA原理－－操作规则（新手适用）点击次数：3347 发布时间：2010-7-12 8:45:33
ELISA原理－－操作规则（新手适用）
酶联免疫吸附实验 ELISA
一．实验目的
酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还
原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm
mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。
ELISA的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。
也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。
不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。
本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
2、研究抗酶抗体的合成。
3、显现微量的免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
基本方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（简称洗涤，下同）。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
基本方法二用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
次日洗涤3次。
↓
加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。
（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
↓
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
（二）酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。
是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。
免疫技术常用的酶及其底物
* 终止剂为2mol/L H2SO4
** 终止剂为2 mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。
可催化下列反应： HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体； A——为有色产物。
（三） ELISA常用的四种方法
1．直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面；
加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；
加底物。
底物的降解量＝抗原量。
2．间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面；
加抗体, 形成抗原-抗体复合物；
加酶标抗体；
加底物。
测定底物的降解量＝抗体量。
3．双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
加抗原，形成抗原-抗体复合物;
加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;
加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;
加底物。
底物的降解量＝抗原量。
4. 竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面;
（1）加入酶标抗原；
（2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；
加底物。
对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
三．仪器和材料
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板, 40, 96孔）。
2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS－－Tween－－20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。
6. 洗涤液：同稀释液
7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。
8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制 0.1M 柠檬酸
（2.1g/100ml）, 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O （7.163g/100ml）6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。
9. 终止液：2mol/LH2SO4。
四. 操作步骤
1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。
同时作稀释液对照。
37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10－－15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）。