免疫学原理及检测

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★ 抗HBc IgG 其阳性滴度高,表明患有乙型肝炎,
指正在感染;低滴度为既往感染指标,体内时间 长。
乙型肝炎病毒各项标志物
检测的临床意义
1 、 HBsAg 阳性,常为慢性 HBsAg 携带者、急 性乙型肝炎潜伏期、慢性迁延性肝炎与慢性活 动性肝炎、肝硬化。 乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)
2 、 HBsAg 阳性还可见于输血后肝炎病人的血 中,有少数急性黄疸性肝炎的病人血中 HBsAg 呈阳性反应,随着病情的好转HBsAg消失。
免疫学反应
是抗原与抗体的反应,仅在高等脊椎 动物中存在。 这是已知的最精妙复杂的 身体抵御外部物质的系统。
抗原(Antigen)
抗原是指能刺激机体免疫系统产生 免疫应答而生成抗体和致敏淋巴细胞等 免疫应答产物,并能与之发生特异性结 合的物质。 具有免疫原性和反应原性。一般抗 原都是外来物,如细菌、病毒、寄生虫、 大分子蛋白等 。
抗体(Antibody)
机体受外来抗原物质刺激后,产生 的一种能与该抗原发生特异性结合的免 疫球蛋白(Ig)。
免疫球蛋白分类
Ig通常是指具有抗体活性和(或)抗体样结 构的球蛋白。应用免疫电泳与超速离心分析可将 Ig分5类: IgG、IgA、IgM、 IgD、 IgE。
IgG:含量最多或最主要的Ig(75%),唯一 能够通过胎盘的Ig。主要由脾脏和淋巴结中的浆 细胞合成与分泌。
HBeAg与HBeAb共存
★ 血清转换过程中。 ★ 检测敏感性提高。 ★ 野生株与变异株同时存在。
HBcAb
★ 反映肝细胞受到HBV侵害的一种指标,主要包括
IgM、IgG、IgA。
★ 抗HBc IgM阳性是最早出现的特异性抗体,是诊
断急性乙型肝炎和判断病毒复制活跃的指标,并 提示病人的血液有强传染性。也见于慢性活动性 肝炎。
乙型肝炎e 抗体 2 、 HBeAb 阳性率增高,表明多数患者乙型肝炎病 (HBeAb) 毒感染的时间可长达7-27年。 3 、 HBeAb 阳性仍会有一定的传染性。在 HBeAb 阳 性的孕妇分娩婴儿中可有20%感染乙型肝炎病毒。
1 、慢性乙型肝炎 HBeAb 阳性占 48.3% ,肝硬化为 68.3%,肝癌为80%。
临床二对半检测常见模式
HbsAg -HBs HBeAg -HBe -HBc
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+ + - + - -

- - - - - +

- - - - - -

+ + + - - +

+ - + + + +
模式 1 :急肝、慢肝活动期,有传染性, (大三阳)。 模式 2:急性乙肝、病毒复制减弱;慢性乙 肝、传染性弱(小三阳)。 模式 3 :急性 HBV 感染,趋向恢复,慢性 HbsAg携带者。 模式4:近期既往感染,急性HBV感染恢复 期。 模式 5:急肝、慢肝表面抗原携带者,传染 性弱。 模式 6:急性窗口期,既往感染过。 模式7:康复期,近期感染过HBV,有免疫 力。 模式 8:既往感染过,乙肝恢复期,仍有免 疫力。 模式 9:康复期或被动免疫后 。 模式10:现在或过去未感染乙型肝炎病毒。
艾滋病血清学检测
★ 初筛试验:酶联免疫吸附试验(ELISA) 用于对检测对象感染情况的初步筛查,检测结 果可能会有假阳性,不能发抗体阳性报告。 ★ 确认试验:免疫印迹法(Western Blot) 确定检测对象是否有HIV抗体,可发抗体阳性 报告。
第一wk.baidu.com ELISA 试剂



标本因素(内源必干扰)

类风湿因子(假阳性) 检测抗原时可用2-巯基乙醇 加入到标本稀释液中,使其降解或F(ab)2代替完整IgG。 补体(假阳性) 可用EDTA稀释标本或灭活补体。 嗜异性抗体、自身免疫性抗体、交叉反应物质等。

操作时影响因素

加样应加在孔的下1/3处,注意不可溅出或有 气泡产生。 加样应每人一吸头,防止交叉污染。 样本的稀释(目的是减少非特异性反应) 要先 加稀释液再加标本并用微量振荡器混匀30秒。 加试剂时应摇匀并弃去第一滴。
HBsAb
阳性就万无一失了吗?
低滴度应注意假阳性 单一HBsAb阳性HBV DNA检出率0-11.8%:
★ 先后感染了不同的HBV亚型
★ S基因变异
★ X基因变异
HBsAb阳性HBV DNA阴性
并不排除肝细胞内HBV的存在
HBsAg 与 HBsAb共存
★ 可出现在HBV感染的恢复期,此时HBsAg未 消失,HBsAb已产生,大部分归功于检测敏 感性的提高。 ★ S基因发生变异,野生株HBsAb不能将其清 除; ★ HBsAb阳性者感染了不同亚型HBV或免疫逃 避株。
HBeAg
★ 是重要的免疫耐受因子,大部分情况下其存 在表示患者处于高感染低应答期。
★ HBeAg与HBV DNA有良好的相关性。
★ 阳性标本检出率90%左右。
HBeAg与HBeAb
HBeAg的存在表示病毒复制活跃且有较强的 传染性。
HBeAg消失而HBeAb产生称为血清转换。
HBeAb阳转后,病毒复制多处于静止状态, 传染性降低。长期HBeAb阳性者并不代表病毒复 制停止或无传染性,研究显示20%~50%仍可检测 到HBV DNA,部分可能由于前C区基因变异,导 致不能形成HBeAg。
免疫学原理及检测
技术支持部
胡贺
主要内容

免疫学基本内容 血清学一般特点 ELISA方法的技术根据 ELISA方法的种类 影响因素 中山生物产品 各类产品简介
免 疫 学
一门自然科学,从研究机体对传染病 的抵抗力开始,是微生物学的一个分支, 但随着科技的发展,成为了一门独立的学 科。
酶联免疫吸附试验
enzyme linked immunosorbent assay ELISA
ELISA方法的技术根据
抗原或抗体能结合到固相载体的表面,并保 持其免疫活性。
抗原或抗体与酶连接所形成的结合物仍保持 免疫学和酶的活性。 在测定时待测血清与固相载体的抗原或抗体 结合,然后再加入酶标记的抗原或抗体,形成复 合的结合物,最后加入底物溶液,与酶反应的颜 色深浅与标本中相应抗原或抗体的量成比例。
1 、 HBeAg 增高说明患有乙型肝炎具有较强的传染 性,它的出现往往是乙型肝炎的早期或者是活动期。 2 、如 HBeAg 阳性持续时间大于 10 周以上或更长时 乙型肝炎e 抗原 间,病人可能进展为慢性持续性感染,肝组织常有 (HBeAg) 较严重的损害,急性乙型肝炎容易演变成慢性肝炎 或肝硬化。 3 、 HBeAg 阳性孕妇有垂直传染性, 9% 以上的新生 儿将受乙型肝炎病毒感染,HBeAg也为阳性。
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9

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建议每个病人都要进行 HBV DNA检测

HBV DNA检测的临床意义
1、诊断方面: ⑴ HBV DNA是HBV存在最直接的依据 ⑵ HBV DNA是HBV复制的标志 ⑶ HBV DNA是患者具有传染性的标志
(4) 对HBV-M起补充作用:
① HBeAg(﹣)/ HBeAb(﹢)乙型肝炎
1 、 乙 肝 核 心 抗 体 IgM 增 高 可 诊 断 急 性 乙型肝炎。 2 、单纯核心抗体 IgG 增高常表示有既往 感染。
乙型肝炎核心抗体 (HBcAb)
3 、 HBcAb 的出现表明肝内乙肝病毒复制 活跃,肝细胞受损较重,并且传染性 较强。 4、HBcAb对乙型肝炎无保护作用,其持 续阳性可长达数十年甚至保持终身。
ELISA 方法的种类
双抗体夹心法 间接法 双抗原夹心法 HBsAg、HBeAg HCV、Dengue-IgG HBsAb、HIV、TP
竞争性抑制法
中和抑制法 捕获法
抗-HBc
HBeAb HBc-IgM、HA-IgM
双抗体夹心 ELISA 法示意图
影响因素

试剂因素 标本因素(内源性、外源性) 操作因素
志。HCV RNA亦可定量,定量测定有助于了解
病毒复制程度、抗病毒治疗的选择及疗效评估等。
为什么要同时检测 抗HCV 及 HCV RNA?
★ 抗病毒治疗的要求。 ★ 防止漏诊。
有 报 道 223 例 丙 型 肝 炎 病 例 中 , 抗 HCV 和 HCV RNA 同时阳性 86 例,单纯抗 HCV 阳性 118例,单纯HCV RNA 阳性19例。 表明单做其中一项可能导致漏诊。


试剂因素

选择优良的检测试剂,操作前平衡到室温 不同批号的试剂不能混用


在有效期内使用
标本因素(外源性干扰)

标本应避免溶血,细菌的污染(假阳性); 抗凝不完全的标本(假阳性),建议尽量不用抗凝剂血 尤其是肝素抗凝剂; 标本保留时间过长(间接法本底值增高),如需保存一 周以上,则应-20℃保存,融解后应充分混匀; 标本间应避免交叉污染,不应与生化标本共用同一管 标本; 不能用NaN3防腐。
为什么建议每个病人都要进行 HBV DNA检测?

HBsAg和HBeAg均阳性而HBV DNA阴性
可能的原因:


干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制受抑制。
PCR所用引物相应的DNA序列发生突变,此引 物与突变DNA不能配对结合。 病毒DNA整合于宿主肝细胞染色体而血中游离 HBV DNA很少或缺乏。
可能性越大。
★ 血液与肝组织的HBsAg含量并不完全相关。
为什么血清HBsAg阴性不能排除HBV感染?
★ 检测试剂不够敏感。 ★ S基因变异(抗原性发生改变)。 ★ X基因变异(转录受抑制)。 ★ 重叠HCV感染(干扰HBsAg合成)。
如何诊断血清HBsAg阴性的HBV感染?
★ 提高检测敏感性
★ 采用针对变异抗原的检测试剂 ★ HBV DNA的检测 ★ 组织中标志物的检测
2、抗原、抗体的结合是分子表面的结合,这 种结合虽相当稳定,但是可逆的。 3、抗原、抗体的结合是按一定比例进行的, 只有比例适当时,才能出现可见反应。
最适比例示意图
血清学反应的一般特点
4、血清学反应大体分为两个阶段进行,但其 间无严格界限。第一阶段为抗原抗体特异性结合 阶段,反应速度很快,只需几秒至几分钟反应即 可完毕,但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗 原抗体反应的可见阶段,表现为凝集、沉淀、补 体结合反应等。反应速度慢,需几分、几十分以 至更长时间。
IgM:分子量最大,由5个IgM单体通过J链连 接。是最早出现的Ig,是抗原刺激后最早出现的 抗体,其杀菌、溶菌、溶血、促吞噬以及凝集作 用比IgG高500~1000倍
IgG抗体的结构及 与抗原的反应
血清学反应的一般特点
1、抗原、抗体的结合具有特异性,但当有共 同抗原、抗体存在时,会出现交叉反应。
1 、 HBsAb 阳性证明以往有过乙型肝炎病毒感 染的历史,机体产生了一定的免疫力。
乙型肝炎表面抗体 (HBsAb) 2 、注射乙型肝炎疫苗或打过 HBsAb 免疫球蛋 白, HBsAb可呈阳性反应。
3 、 HBsAb 是保护性抗体,血中抗体滴度在 1: 64 或 P/N>10以上时才对机体有保护作用。


洗涤应彻底。
中山生物产品
乙肝两对半(缺少e抗原) 丙肝
梅毒
EB病毒
登革热
G6PD
乙型肝炎病毒血清标志物检测
HBsAg
★ 常用ELISA法检测。
★ 目前HBsAg诊断试剂质量较高,灵敏度可达
0.2ng/L。从全国室间质控评价结果显示,阳 性标本率达到或超过98%。
★ HBsAg滴度越高,HBeAg、HBV DNA阳性的

丙型肝炎
HCV抗体不是保护性抗体,是存在HCV感染
的标志。抗HCV IgM在发病后即可检测到,一般
持续1~3个月。如果抗HCV IgM持续阳性,提示
病毒持续复制,易转为慢性。低滴度抗HCV IgG
提示病毒处于静止状态,高滴度提示病毒复制活
跃。
HCV RNA
HCV RNA阳性是病毒感染和复制的直接标
(前C区变异)
② HBsAg(﹣)乙型肝炎
(S区变异)
③ 低水平感染
单项抗HBc(﹢)乙型肝炎
HBV DNA检测的临床意义
2、 疗效判断: HBV DNA 是目前判断乙肝抗病毒药物疗效 最敏感的指标 。 3、预后判断: HBV DNA水平与病情有一定的关系。
HBV DNA检测的临床意义
调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处 于HBV复制期,具有传染性;也不是所有“小三 阳”的病人 HBV 都无复制。因此,要准确知道 HBV是否处于复制状态,最准确的方法还是通过 检测HBV DNA来决定。
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