实验六 基因克隆及序列分析

实验六、基因克隆及序列分析

1.目的片段回收

取5 μl PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测，如果扩增产物大小与原来一致，在紫外灯管下用刀片切下目标带，然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit 试剂盒（上海生工）进行回收。具体回收过程如下：从琼脂糖凝胶中精确切下包含有目标片段的胶块，放入到1.5 ml离心管中，加入500 µl Binding Buffer II，50℃~60℃水浴锅中放置10 min，使胶彻底熔化，然后将熔化的胶溶液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，8000 r/min离心1 min，倒去收集管中的废液，在UNIQ-10柱中加入500 µl Washing Solution，室温8000 r/min离心1 min，加入新鲜的Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液，室温12000 r/min离心15 s。在UNIQ-10柱中加入Elution Buffer 30 µl（直接滴到过滤膜上），37℃放置2 min，放到一个新的1.5 ml离心管后离心收集（12000 r/min，1 min），所得溶液用于连接反应。

2 片段连接反应

采用pGEM® -T Easy Vector试剂盒（Promega，A1360）进行目标片段的克隆。取1.5 µl PCR产物，加入0.5 µl T4 DNA ligase，0.5µl T Easy Vector，2.5 µl ligation buffer，短暂离心收集，轻轻混匀，置于室温连接1-2 h后，放于4︒C冰箱过夜。

3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

取保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5α菌液，首先在LB固体培养基上分离单克隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。从中取1.0 ml菌液转接于装有100 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，于摇床培养1.5~2 h（37℃，240 r/min），后转移至预冷的50 ml离心管中，冰浴10 min，低温离心10 min（4℃，4000 r/min）收集菌体，加入25 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬培养物，冰浴20-30 min，4℃4000r/min离心10 min，去上清液，倒立晾干，再加2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%的甘油）重悬细胞，分装于冰浴的0.5 ml无菌离心管中，放入-70℃冰箱保存。

取2 µl连接反应物转到1.5 ml离心管中，冰上保存待用。从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上，待其刚好融化时（约5 min）小心吸取30-50 µl转入到离心管中，冰上静置20 min。42℃水浴中热激90 s（不要摇动）。迅速放回冰上2 min，然后加入LB培养基（室温）400 µl，37℃摇床培养1.5 h（150 r/min）。

从中取转化培养液100 µl平铺于LB平板（含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal)上，正置平板至液体全部被吸收，然后倒置平板于37℃培养16~20 h使蓝、白斑充分呈现。

4重组子筛选、鉴定

对于目标克隆片段，挑选白色单克隆菌落进行液体培养6 h。取2 µl作模板，用通用测序引物（M13）进行PCR检测，反应体系为（20 µl）：1×PCR缓冲液，0.2 mmol/L dNTPs，1.5 mmol/L MgCl2，1.0 U Taq酶（MBI Fermentas），引物M13，再加20 µl矿物油覆盖。PCR循环参数为：94℃变性2 min；94℃变性10 s，58℃退火45 s，72℃延伸60 s，33个循环；10℃保存。产物于1.2%琼脂糖胶电泳检测，若扩增片段大于原来目的片段200 bp左右，则说明为阳性单克隆。

5 克隆片段的测序及结果分析