实验六 基因克隆及序列分析
基因克隆鉴定实验报告
一、实验目的本研究旨在克隆、鉴定某一生物X基因，并对其功能进行初步分析。
通过实验，了解基因克隆鉴定的基本原理和方法，为后续研究奠定基础。
二、实验材料1. 生物X样本：新鲜组织或细胞2. 总RNA提取试剂3. 反转录试剂盒4. PCR引物5. DNA分子量标准6. DNA回收试剂盒7. 载体DNA8. 连接酶9. 转化试剂10. 抗生素筛选培养基11. PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等三、实验方法1. 提取生物X样本的总RNA（1）将生物X样本进行研磨，加入适量裂解液，充分裂解细胞。
（2）加入适量RNA酶抑制剂，防止RNA降解。
（3）按照试剂盒说明书进行总RNA提取。
2. 反转录（1）按照反转录试剂盒说明书进行操作，将总RNA反转录为cDNA。
（2）设置反应体系：cDNA模板2μl，Oligo(dT)18引物1μl，5×反转录缓冲液4μl，dNTPs 2μl，M-MLV逆转录酶1μl，加ddH2O至20μl。
（3）反应条件：37℃ 60min，85℃ 5min。
3. PCR扩增（1）根据生物X基因的保守序列设计引物，并进行PCR扩增。
（2）设置反应体系：cDNA模板2μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 2μl，Taq酶1μl，加ddH2O至25μl。
（3）反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环。
4. DNA回收与连接（1）将PCR产物进行电泳检测，切取目的片段。
（2）按照DNA回收试剂盒说明书进行回收。
（3）将回收的DNA片段与载体DNA进行连接。
（4）连接体系：连接酶1μl，连接缓冲液2μl，载体DNA 1μl，DNA片段2μl，加ddH2O至20μl。
（5）16℃连接过夜。
5. 转化与筛选（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
（2）涂布于含抗生素的琼脂平板，37℃培养过夜。
（3）挑取单克隆菌落进行PCR鉴定。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告基因克隆实验报告引言基因克隆是一项重要的生物技术，它可以通过复制和转移特定基因来研究基因功能、生物发育和疾病治疗等方面。
本实验旨在通过基因克隆技术，将一个目标基因从一个宿主生物转移到另一个宿主生物中，并观察其表达情况和功能。
材料与方法1. 实验材料：目标基因序列、质粒、限制酶、DNA连接酶、细菌宿主等。
2. 实验步骤：a. 提取目标基因序列：通过PCR技术，从源DNA中扩增目标基因序列。
b. 制备质粒：选择合适的质粒，将其线性化。
c. 酶切与连接：使用限制酶切割目标基因序列和质粒，然后使用DNA连接酶将两者连接。
d. 转化：将连接好的质粒转移到细菌宿主中。
e. 筛选与鉴定：通过筛选培养基和PCR等方法，鉴定宿主细菌中是否成功克隆了目标基因。
结果与讨论在本实验中，我们成功地将目标基因从一个宿主生物转移到了另一个宿主生物中。
通过PCR技术，我们扩增得到了目标基因的特异片段，并在质粒上进行了酶切与连接。
随后，我们将连接好的质粒转移到了细菌宿主中，并进行了筛选与鉴定。
在筛选培养基中，我们观察到了对抗特定抗生素的细菌生长，这表明成功转化了质粒。
此外，通过PCR检测，我们也验证了目标基因的存在。
这些结果表明，我们成功地进行了基因克隆实验，并成功地将目标基因转移到了新的宿主生物中。
基因克隆的成功不仅仅是一项实验技术，它还具有广泛的应用前景。
基因克隆技术可以用于生物学研究，例如研究基因功能、生物发育和疾病机制等。
此外，基因克隆还可以用于生产重组蛋白、制备基因工程药物等方面。
然而，基因克隆技术也存在一些挑战和争议。
首先，基因克隆需要复杂的实验操作和昂贵的设备，对实验者的技术要求较高。
其次，基因克隆可能引发伦理和道德问题，例如克隆人类等。
因此，在进行基因克隆实验时，必须遵守伦理规范和法律法规，确保实验的合法性和安全性。
结论通过本实验，我们成功地进行了基因克隆，并将目标基因转移到了新的宿主生物中。
基因克隆技术在生物学研究和应用中具有重要意义，但也面临一些挑战和争议。
目的基因的克隆实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子克隆技术，将目的基因从基因库中提取并克隆到合适的载体上，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是基因工程的核心技术之一，其基本原理是将目的基因片段与载体DNA片段通过酶切、连接等步骤形成重组DNA分子，然后将重组DNA分子导入宿主细胞进行扩增和表达。
三、实验材料1. 实验试剂：限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、质粒载体、目的基因DNA、LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG、X-Gal、0.1 M MgCl2、0.1 M CaCl2等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、显微镜、超净工作台等。
四、实验步骤1. 目的基因的获取（1）设计引物：根据目的基因的序列，设计特异性引物，引物5'末端带有酶切位点。
（2）PCR扩增：以目的基因DNA为模板，PCR扩增目的基因片段。
（3）PCR产物回收：采用PCR产物回收试剂盒回收目的基因片段。
2. 载体与目的基因的连接（1）载体线性化：用限制性核酸内切酶酶切质粒载体，获得线性化载体。
（2）连接反应：将回收的目的基因片段与线性化载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。
（3）连接产物转化：将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中。
3. 重组子筛选与鉴定（1）菌落培养：在含有IPTG和X-Gal的LB固体培养基上培养转化菌，挑选白色菌落。
（2）菌落PCR鉴定：以白色菌落为模板，进行PCR扩增，检测目的基因片段是否插入载体。
（3）重组子测序：对PCR鉴定阳性的重组子进行测序，验证目的基因片段是否正确插入载体。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得了目的基因片段。
2. 菌落PCR鉴定结果：白色菌落PCR鉴定阳性，表明目的基因片段已插入载体。
3. 重组子测序结果：测序结果显示，目的基因片段正确插入载体。
六、实验结论本实验成功克隆了目的基因，为后续的基因表达、功能研究及基因工程应用奠定了基础。
基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。
（常温操作）2 恒温箱裂解，55℃。
30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
（注意酚在油层下面）4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。
在-30度冰箱沉淀30min。
离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。
作用抑制酶的活性。
）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ul PK（消化）735ul 灭菌超纯水EDTA（0.5 M，pH8.0）将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
基因克隆实验报告
实验单元6：基因克隆学号No.：姓名Name：日期Date：2014，04，26摘要：基因克隆是在体外将目的基因（或其它有意义的DNA片段）同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究。
通过PCR法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。
本实验应用RT-PCR技术从团头鲂肝脏RNA中扩增β-actin基因cDNA片段，并克隆到质粒载体pMD18-T，鉴定测序。
结果显示：只有少数组别成功克隆出目的基因片段。
关键词：基因克隆；T-A克隆；团头鲂；β-actin基因一、前言对PCR产物进行克隆是分子生物领域以及基因工程领域中常用的方法，随着PCR方法应用的多元化，PCR产物的克隆显得尤为重要。
以前对PCR产物进行克隆实验，采用的方案大概有以下几种：一是用Klenow酶或单链核酸酶（如S1核酸酶或绿豆核酸酶）将PCR产物的两端切成平末端，然后克隆到也切成平端的质粒载体上，或在PCR产物的两端加上人工接头（Linker），经过限制性内切酶处理以后，再克隆到用相应限制性内切酶酶切产生的载体上；二是在设计PCR产物时，在引物的)!端引入特异性的内切酶识别序列，在PCR反应结束后，将PCR产物用相应的限制性内切酶进行处理，使之两端产生粘性末端，以便于克隆到载体的相应酶切位点上[1]。
这两种方法都很烦琐，而且，第一种方法的克隆效率很低，第二种方法在进行酶切处理时，如果PCR产物本身含有相应的酶切位点时，则有可能切断PCR产物。
近年来发展了几种PCR产物的直接克隆方法，一种是T4 DNA 聚合酶补平，另一种是T-A克隆法。
其中，T-A克隆法不仅操作简便，而且大大提高了克隆效率，已经成为克隆PCR产物的主要方法之一。
但是，在采用T-A克隆法时，随着插入片段长度的增加，克隆效率明显下降，尤其是当PCR产物长度大于3000bp时，其克隆效率甚至会低于平末端的克隆效率。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告摘要：本实验旨在通过基因克隆技术，将特定基因从一个细胞中复制并插入到另一个细胞中，以实现基因的传递和表达。
实验采用了大肠杆菌作为模型生物，利用质粒载体和限制酶切技术完成了基因的克隆和转移。
通过本实验的操作，成功地将目标基因从一个细胞复制并转移到另一个细胞中，验证了基因克隆技术的有效性。
一、实验材料和方法1. 实验材料：- 大肠杆菌菌种- 目标基因DNA样本- 质粒载体- 限制酶- DNA连接酶- 抗生素培养基2. 实验步骤：步骤一：菌液制备1. 取一支滤漏筒，加入适量的LB培养基，用移液管取一小部分大肠杆菌菌种，接种于LB培养基中，静置在37℃恒温摇床中培养过夜。
步骤二：DNA提取1. 取LB培养基中的大肠杆菌菌液，用离心机进行离心分离，将上清液去除，留取沉淀。
步骤三：DNA酶切1. 取目标基因DNA样本和质粒载体，分别加入限制酶，按照限制酶切反应的条件进行反应。
步骤四：DNA连接1. 取等体积的酶切后的目标基因DNA和质粒载体，加入DNA连接酶，按照连接酶反应条件进行反应。
步骤五：转化1. 将连接后的DNA溶液加入已经制备好的培养基中，用恒温摇床静置培养。
步骤六：筛选1. 取一块含有抗生素的琼脂平板，将转化后的菌液均匀涂布在平板上，放入恒温箱培养。
步骤七：分离1. 从琼脂平板上挑选抗生素抵抗的单个菌落，进行培养。
二、实验结果与分析通过本实验的操作，成功地将目标基因从一个细胞复制并转移到另一个细胞中。
在转化后的琼脂平板上，观察到一些菌落的形成，这些菌落对抗生素具有抗性。
说明转化后的细胞成功地表达了目标基因，并能产生相应的蛋白质。
三、讨论与总结基因克隆技术是现代生物学研究中常用的实验手段之一。
通过限制酶切和DNA连接，可以实现基因的克隆和转移。
本实验结果表明，大肠杆菌是一个有效的模型生物，可用于基因克隆实验。
通过对转化菌落的筛选和培养，可以得到具有抗生素抵抗能力的菌落，进一步验证了实验结果的有效性。
克隆基因提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习并掌握克隆基因提取的基本原理和操作步骤，通过实验操作，提取目的基因，为后续的基因克隆、表达和功能研究奠定基础。
二、实验原理克隆基因提取主要利用DNA提取技术，通过破碎细胞、释放DNA、去除杂质等步骤，得到高纯度的DNA。
本实验采用碱裂解法提取目的基因，该方法具有操作简单、提取效率高、DNA纯度好等优点。
三、实验材料1. 实验试剂：NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液、无水乙醇、异丙醇、二苯胺染液、DNA提取试剂盒等。
2. 实验仪器：高速离心机、电子天平、移液器、PCR仪、凝胶成像系统等。
3. 实验样品：目的基因载体（含目的基因）、细菌菌液等。
四、实验步骤1. 细菌培养：将目的基因载体转化至大肠杆菌，挑取单克隆菌落，接种于含有适量抗生素的LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养过夜。
2. 酵母提取物制备：将过夜培养的菌液按1:100比例稀释，加入酵母提取物、葡萄糖等，37℃、200 r/min培养至对数生长期。
3. 细菌裂解：将培养好的菌液按照1:10比例加入裂解液，55℃水浴30 min，期间每隔5 min振荡1次，使菌体充分裂解。
4. DNA沉淀：将裂解液按照1:2比例加入等体积的异丙醇，混匀，4℃、12 000r/min离心10 min，弃上清液。
5. DNA洗涤：将沉淀用70%乙醇洗涤1次，4℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清液。
6. DNA溶解：将沉淀用适量TE缓冲液溶解，-20℃保存。
7. DNA纯化：按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，得到高纯度的目的基因。
8. 验证：将提取的目的基因进行PCR扩增，观察扩增结果，确认目的基因提取成功。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得目的基因，扩增产物大小与预期相符。
2. DNA纯度：利用NanoDrop2000检测提取的目的基因，A260/A280比值在1.8-2.0之间，表明DNA纯度较高。
六核酸序列的一般分析
（二）序列变换 DNA－DNA序列之间变换
DNA－RNA序列之间变换
原始DNA序列
AAAAATGGCCATGGGTCCACACGCAGTGAGATGAATGCTAGATCTCACGAGA TTTTTACCGGTACCCAGGTGTGCGTCACTCTACTTACGATCTAGAGTGCTCT
例子：
>10KD_VIGUN P18646 vigna unguiculata 10 kda protein precursor MEKKSIAGLCFLFLVLFVAQEVVVQSEAKTCENL VDTYRGPCFTTGSCDDHCKNKEHLLS
（2）plain text格式 是一个形式最简单的格式， 没有任何的注释，每行 60 个字母，使用标准核 甘酸符号或标准的氨基酸的单字母符号。例如：
MEKKSIAGLCFLFLVLFVAQEVVVQSEAK TCENLVDTYRGPCFTTGSCDDHCKNKEH LLS
（3）GCG格式 式，例如：
是商业性的GCG软件包的专用格
1 ggagactttc ctgtcactgg ctactactac tcccaaccct cctcaaagcc gccggagcaa
61 cccccaggtc tttactttac aatcggcaat ttgacttgct ctgctgcatg tctggaggga
121 ccaaggaaag tgtggagacg ctccaaggat taggtgatcg gagcttgaaa agaaaaaaag
（4）Genbank格式 例如：
(5) PIR格式
>DL;OsNIP1-1 ATGGCAGGAGGTGACAACAACTCCCAGACCACCAATGGCGGCTCAGGTCACGAGCAGAGA
基因克隆
基因克隆的方法基因克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义DNA段同能够自我复制的载DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此基因克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA 技术。
根据这个定义，于是选择和使用不同的方法，最后得到含有目的基因片段的菌株。
针对目的基因的来源不同，可以选择多种克隆方法，但并没有放之四海而皆准的方法，要针对自己的目的基因的特点采取相应的且合适准确的方法来获得目的基因的克隆。
1当目的基因的序列完全已知时。
则可以根据文献上所查到的基因的注册序列号到相应的网上数据库去查找该基因的全序列结构信息，例如最常用的美国NCBI网站上的Genbank数据库。
然后查找到相应的目的基因的核苷酸序列信息和其来源。
然后使用生物信息学软件对基因的序列进行分析，设计通过PCR反应来扩增目的基因的核苷酸引物，并将设计的引物序列发给生物技术公司合成，最后得到引物核苷酸并用纯水进行合理的稀释。
接下来将采集含有目的基因的生物标本材料，使用合理的方法提取生物标本的基因组并进核酸浓度与纯度的测定，由于生物体的核酸从化学性质上来讲主要分为DNA和RNA两种，所以提取基因组后针对基因组的选择要尽可能去除另一种核酸的干扰与污染。
然后根据基因组的质量，浓度，PCR扩增设计引物的结构，目的基因的长度等因素设计PCR反应的条件，反复试验以找到能够通过PCR方法来准确扩增目的基因的最佳反应条件。
在目前的PCR反应中所采用工具酶为Taq DNA聚合酶，通常所用的Taq DNA聚合酶具有一个生物反应特性，在其扩增的PCR产物上，其3’末端总是会带有一个非模板依赖性的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A( dATP), 因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性，故可以针对这一点采取两种克隆策略。
其一，可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接；其二，可直接与一些T载体（切口处含有一个突出T碱基的克隆载体）连接并克隆。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告一、实验目的本次基因克隆实验的主要目的是从特定的生物体中获取感兴趣的基因，并将其插入到合适的载体中，以便进一步研究该基因的功能、表达和应用。
二、实验原理基因克隆是指通过一系列分子生物学技术，将一个目的基因从其所在的基因组中分离出来，并在体外进行扩增和修饰，然后将其连接到一个能够自我复制的载体分子上，形成重组 DNA 分子，最后将重组DNA 分子导入到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中稳定遗传和表达。
基因克隆的基本步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、目的基因与载体的连接、重组 DNA 分子的转化、重组子的筛选和鉴定等。
三、实验材料和试剂（一）实验材料1、含有目的基因的生物体样本，如细菌、植物或动物组织。
2、宿主细胞，如大肠杆菌。
（二）实验试剂1、限制性内切酶、DNA 连接酶。
2、聚合酶链式反应（PCR）所需的试剂，包括引物、dNTPs、Taq 聚合酶等。
3、琼脂糖、电泳缓冲液。
4、质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒。
5、抗生素，如氨苄青霉素。
四、实验步骤（一）目的基因的获取1、设计引物根据目的基因的序列，设计一对特异性引物。
引物的设计要考虑到引物的长度、GC 含量、Tm 值等因素，以确保引物能够有效地与目的基因结合，并在 PCR 反应中扩增出目的基因。
2、 PCR 扩增目的基因以生物体样本的基因组 DNA 为模板，进行 PCR 反应。
PCR 反应体系包括模板 DNA、引物、dNTPs、Taq 聚合酶和反应缓冲液。
PCR 反应条件包括预变性、变性、退火和延伸等步骤，通过多个循环的扩增，得到大量的目的基因片段。
（二）载体的选择和制备1、选择合适的载体根据实验目的和宿主细胞的特点，选择合适的载体。
常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等。
本实验中选择质粒作为载体。
2、制备线性化载体使用限制性内切酶对载体进行酶切，使其成为线性化的载体，以便于与目的基因进行连接。
（三）目的基因与载体的连接1、回收目的基因和线性化载体使用 DNA 凝胶回收试剂盒，分别回收 PCR 扩增得到的目的基因片段和线性化的载体片段。
实验六目的基因的PCR扩增
PCR引物设计
AKP CDS
554......2038
引物1 5’GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC 3’
BamH1
CDS 5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…
…………………………………………………………………………. ……
……………………………………………………………………………….
二、实验原理
三、实验仪器与试剂
1 、仪器： PCR 热循环仪、台式离心机、微量移 液器、吸头、电泳设备等。
2 、试剂：10x PCR buffer、dNTPs（25mM）、Taq
酶（5u/μl）、引物1和2( 10 pmol/ul) 、模板DNA、 ddH2O、琼脂 糖、TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲 液、溴化乙啶染液、等。
七、引物设计原则
⑹ 引物的 3′ 末端碱基：原则上要求引物的3′末端与 模板DNA一定要配对，另外 3′末端的末位碱基在 很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。 引物3′末端 碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差 异，最好选T、G、C，而不选A。
八、注意事项
由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以 防反应混合物受痕量DNA的污染。 1. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不
……………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………….
CDS ….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’
引物2
HindⅢ 3’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG 5’
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、 中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环， 样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成 为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可 扩增106～109倍。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告一、实验目的基因克隆是分子生物学研究中的重要技术手段，本次实验旨在通过克隆特定基因，深入理解基因克隆的原理和方法，掌握相关实验操作技能，并获得目的基因的克隆产物。
二、实验原理基因克隆的基本原理是利用限制性内切酶将目的基因从基因组DNA 中切割出来，然后将其连接到合适的载体上，形成重组 DNA 分子。
再将重组 DNA 分子转化到宿主细胞中，通过筛选和鉴定，获得含有目的基因的克隆细胞。
三、实验材料与设备（一）材料1、含目的基因的基因组 DNA 样本。
2、限制性内切酶、DNA 连接酶、T4 DNA 连接酶缓冲液。
3、载体（如质粒）。
4、感受态细胞（如大肠杆菌）。
5、琼脂糖、琼脂糖凝胶电泳缓冲液。
6、 DNA 分子量标准。
（二）设备1、恒温培养箱。
2、离心机。
3、移液器。
4、电泳仪。
5、紫外透射仪。
四、实验步骤（一）目的基因的获取使用限制性内切酶对含目的基因的基因组 DNA 进行酶切，使其产生与目的基因大小相符的片段。
（二）载体的制备选择合适的载体（如质粒），同样用限制性内切酶进行切割，使其具有与目的基因相匹配的粘性末端。
（三）连接反应将酶切后的目的基因片段与切割后的载体在 T4 DNA 连接酶及缓冲液的作用下进行连接，形成重组 DNA 分子。
（四）转化将重组 DNA 分子加入到感受态细胞中，通过热激等方法促进其进入细胞。
（五）筛选与鉴定1、抗性筛选：将转化后的细胞涂布在含有抗生素的培养基上，只有含有重组质粒的细胞才能生长。
2、菌落 PCR 鉴定：挑取单菌落进行 PCR 扩增，检测是否含有目的基因。
（六）DNA 提取与电泳检测从鉴定为阳性的菌落中提取质粒 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，检测目的基因的大小和纯度。
五、实验结果（一）抗性筛选结果在含有抗生素的培养基上观察到了部分菌落生长，初步判断这些菌落可能含有重组质粒。
（二）菌落 PCR 鉴定结果对挑取的菌落进行 PCR 扩增后，经琼脂糖凝胶电泳分析，部分菌落出现了与目的基因预期大小相符的条带，表明这些菌落中含有目的基因。
基因的克隆纯化实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握基因克隆的基本原理和操作方法。
2. 掌握基因纯化的实验技术。
3. 熟悉实验器材和试剂的使用。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，形成重组DNA分子，并使其在宿主细胞中复制和表达。
基因纯化是指从复杂的混合物中提取目的基因片段，并去除其他非目的物质。
本实验以人颗粒酶B基因为例，进行克隆和纯化实验。
三、实验材料1. 实验器材：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱等。
2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶、载体、质粒提取试剂盒、琼脂糖、DNA marker、Tris-HCl缓冲液、NaCl等。
四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）提取肿瘤组织中的淋巴细胞，抽提RNA。
（2）以RNA为模板，进行RT-PCR，扩增人颗粒酶B基因全长。
（3）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
2. 重组质粒的构建（1）将扩增产物与pGEX24T21载体进行连接。
（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，进行菌落培养。
（3）挑选阳性克隆，进行PCR验证。
3. 重组质粒的鉴定（1）提取重组质粒，进行限制性内切酶酶切。
（2）进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
（3）对阳性克隆进行DNA测序，验证基因序列的正确性。
4. 重组质粒的表达与纯化（1）将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，进行菌落培养。
（2）以IPTG诱导重组质粒表达。
（3）进行SDS-PAGE电泳，观察表达产物。
（4）采用Ni亲和树脂对表达产物进行纯化。
5. 纯化产物的鉴定（1）对纯化产物进行SDS-PAGE电泳，观察结果。
（2）对纯化产物进行Western blot分析，验证其特异性。
五、实验结果与分析1. RT-PCR扩增结果：成功扩增出人颗粒酶B基因全长。
2. 重组质粒构建结果：成功构建了pGEX2GrB重组质粒。
3. 重组质粒鉴定结果：限制性内切酶酶切结果与预期相符，DNA测序结果与GenBank数据库中的人颗粒酶B基因序列一致。
基因克隆本科实验报告
一、实验目的1. 理解基因克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握限制性核酸内切酶、DNA连接酶、质粒载体等工具的使用方法。
3. 培养实验操作技能，提高实验数据分析能力。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体DNA中，构建重组DNA分子，并在宿主细胞中扩增。
实验过程中，主要利用限制性核酸内切酶、DNA连接酶等工具进行DNA片段的切割、连接和转化。
三、实验材料与仪器1. 材料：质粒载体、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、DNA琼脂糖凝胶电泳试剂盒、DNA纯化试剂盒、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器、离心机、培养箱、超净工作台等。
四、实验步骤1. 制备DNA模板：以质粒载体为模板，利用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 酶切：将目的基因片段和质粒载体分别用限制性核酸内切酶进行酶切，得到具有相同粘性末端的DNA片段。
3. 连接：将酶切后的目的基因片段和质粒载体在DNA连接酶的作用下连接成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子转化到感受态细胞中，使其成为重组质粒。
5. 鉴定：通过PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳等方法对转化后的细胞进行鉴定，筛选出含有目的基因的克隆。
6. 提取目的基因：从阳性克隆中提取重组质粒，并进行DNA纯化。
7. 验证：利用DNA测序技术对提取的目的基因进行验证，确保其序列与预期一致。
五、实验结果与分析1. 酶切：酶切后的目的基因片段和质粒载体在DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出两条带，分别对应目的基因片段和质粒载体。
2. 连接：连接产物在DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明目的基因片段和质粒载体已成功连接。
3. 转化：转化后的细胞在PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明转化成功。
4. 提取目的基因：提取的重组质粒在PCR、DNA琼脂糖凝胶电泳上呈现出一条带，表明目的基因已成功提取。
5. 验证：DNA测序结果显示，提取的目的基因序列与预期一致，实验成功。
基因克隆具体实验报告
基因克隆具体实验报告基因克隆是指将一个物种的基因从其源生物体中提取出来，并插入到另一个宿主生物体中的过程。
基因克隆可以用于基础研究、医学诊断和治疗、农业改良等领域。
以下是一个基因克隆具体实验的报告。
实验目的：本实验旨在将一段目标DNA序列从一个细菌中克隆到另一个细菌中，以验证克隆技术的可行性。
实验材料：- 源生菌株：提供目标DNA序列的细菌- 宿主菌株：用于接受目标DNA序列并进行复制的细菌- 高浓度DNA提取试剂盒：用于提取源生菌株中的基因组DNA- 质粒：使用质粒介导转化的方式将目标DNA序列插入到质粒中- 缓冲液：用于稀释DNA、提供合适的反应环境- 培养基：提供细菌生长所需的养分- 抗生素：用于选择具有目标DNA序列的细菌实验步骤：1. 提取源生菌株中的基因组DNA：a. 从培养基中取一些源生菌落，转移到离心管中。
b. 加入适量的高浓度DNA提取试剂盒，根据试剂盒说明书进行细胞破裂和DNA纯化的步骤。
c. 将提取的DNA用缓冲液稀释，并进行质量检查。
2. 克隆目标DNA序列到质粒中：a. 将提取的DNA和质粒按照一定比例混合。
b. 加入适量的酶切酶，根据目标DNA序列的酶切位点选择适当的酶切方法。
c. 在恒温水浴中进行酶切反应，使目标DNA序列与质粒酶切后的末端互补连接。
d. 加入适量的合成DNA ligase，进行连接反应，形成目标DNA序列与质粒的连接产物。
3. 将质粒插入宿主细菌：a. 将宿主细菌制备成化学计量的细菌悬液。
b. 加入目标DNA序列与质粒连接产物到宿主细菌悬液中。
c. 进行质粒介导转化，使目标DNA序列与质粒插入到宿主细菌中。
4. 筛选具有目标DNA序列的细菌：a. 将转化后的宿主细菌悬液分别均匀涂布在含有适量抗生素的培养基平板上。
b. 在适当的培养条件下，培养细菌培养基平板，并观察是否有菌落生长。
c. 通过PCR、酶切等方法对菌落进行初步筛选。
d. 对初步筛选出的菌落进行进一步的测序和验证。
基因克隆实验实验报告
一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术，并对实验结果进行分析。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
本实验采用以下原理：1. DNA提取：利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，并在这些序列上切割DNA分子，产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。
3. 连接：利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接，形成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞，使其在细胞内复制、表达。
5. 筛选：通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。
四、实验步骤1. DNA提取：取一定量的大肠杆菌DH5α菌液，加入细胞裂解液，充分振荡，加入蛋白酶K，37℃水浴30min，加入酚/氯仿抽提，离心，取上清液，加入无水乙醇沉淀，离心，洗涤，溶解，得到目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切，酶切产物经电泳鉴定后，切胶回收酶切产物。
3. 连接：将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接，连接产物经电泳鉴定后，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4. 转化：将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中，在冰浴中振荡，加入CaCl2，热冲击，涂布于含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。
5. 筛选：挑选单菌落，进行PCR扩增，鉴定阳性克隆。
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实验六、基因克隆及序列分析
1.目的片段回收
取5 μl PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测，如果扩增产物大小与原来一致，在紫外灯管下用刀片切下目标带，然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit 试剂盒（上海生工）进行回收。
具体回收过程如下：从琼脂糖凝胶中精确切下包含有目标片段的胶块，放入到1.5 ml离心管中，加入500 µl Binding Buffer II，50℃~60℃水浴锅中放置10 min，使胶彻底熔化，然后将熔化的胶溶液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，8000 r/min离心1 min，倒去收集管中的废液，在UNIQ-10柱中加入500 µl Washing Solution，室温8000 r/min离心1 min，加入新鲜的Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液，室温12000 r/min离心15 s。
在UNIQ-10柱中加入Elution Buffer 30 µl（直接滴到过滤膜上），37℃放置2 min，放到一个新的1.5 ml离心管后离心收集（12000 r/min，1 min），所得溶液用于连接反应。
2 片段连接反应
采用pGEM® -T Easy Vector试剂盒（Promega，A1360）进行目标片段的克隆。
取1.5 µl PCR产物，加入0.5 µl T4 DNA ligase，0.5µl T Easy Vector，2.5 µl ligation buffer，短暂离心收集，轻轻混匀，置于室温连接1-2 h后，放于4︒C冰箱过夜。
3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
取保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5α菌液，首先在LB固体培养基上分离单克隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。
从中取1.0 ml菌液转接于装有100 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，于摇床培养1.5~2 h（37℃，240 r/min），后转移至预冷的50 ml离心管中，冰浴10 min，低温离心10 min（4℃，4000 r/min）收集菌体，加入25 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬培养物，冰浴20-30 min，4℃4000r/min离心10 min，去上清液，倒立晾干，再加2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%的甘油）重悬细胞，分装于冰浴的0.5 ml无菌离心管中，放入-70℃冰箱保存。
取2 µl连接反应物转到1.5 ml离心管中，冰上保存待用。
从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上，待其刚好融化时（约5 min）小心吸取30-50 µl转入到离心管中，冰上静置20 min。
42℃水浴中热激90 s（不要摇动）。
迅速放回冰上2 min，然后加入LB培养基（室温）400 µl，37℃摇床培养1.5 h（150 r/min）。
从中取转化培养液100 µl平铺于LB平板（含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal)上，正置平板至液体全部被吸收，然后倒置平板于37℃培养16~20 h使蓝、白斑充分呈现。
4重组子筛选、鉴定
对于目标克隆片段，挑选白色单克隆菌落进行液体培养6 h。
取2 µl作模板，用通用测序引物（M13）进行PCR检测，反应体系为（20 µl）：1×PCR缓冲液，0.2 mmol/L dNTPs，1.5 mmol/L MgCl2，1.0 U Taq酶（MBI Fermentas），引物M13，再加20 µl矿物油覆盖。
PCR循环参数为：94℃变性2 min；94℃变性10 s，58℃退火45 s，72℃延伸60 s，33个循环；10℃保存。
产物于1.2%琼脂糖胶电泳检测，若扩增片段大于原来目的片段200 bp左右，则说明为阳性单克隆。
5 克隆片段的测序及结果分析。