发酵染菌的检查

染菌的检查、原因分析和防止措施

染菌的检查、原因分析和防止措施

1.染菌的检查与判断

在发酵过程中对杂菌污染的及早发现，及时处理，是免除染菌造成严重损失的重要问题。因此，要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染，目前常用方法主要有以下几种：

（1）显微镜检查

通常用革兰氏染色法，染色后在高倍显微镜下观察。对霉菌、酵母发酵，先用低倍显微镜观察生产菌的特征，然后再用高倍显微镜观察有否染菌存在，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢和鞭毛染色。

（2）平板划线培养或斜面培养检查法

先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏37度，保温24h检查无菌即可使用。将需要检查的样品，在无菌平板上划线，分别置摄氏37度、摄氏27度培养，以适应嗜中菌和低温菌的生长，一般在8h后即可观察。

噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并保持摄氏40度，加生产菌作为指示菌和待检样品混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经12~20h培养，观察有无噬菌斑。

培养基（PH7.0）

葡萄糖（%）牛肉膏（%）蛋白胨（%）氯化钠（%）琼脂（%）

上层0.5 1.0 1.0 0.5 1.0

下层0.5 1.0 1.0 0.5 2.0

（3）肉汤培养检查法

将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置摄氏37度和摄氏27

度分别培养24h，进行观察，并取样镜检。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。

葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨0.8%，1%酚红溶液0.4%，PH7.2。

用以上的检查方法检查未发现污染，还不能肯定未被污染。

除以上方法外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、PH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。

2.发酵染菌率和染菌原因分析

（1）发酵染菌率

发酵的总染菌率是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。

发酵染菌是在发酵罐中发生的染菌率，包括染菌后被挽救不了导致倒罐的批数，但种子罐培养的染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。

（2）染菌原因分析

在发酵染菌之后，必须分析染菌原因，总结发酵染菌的经验教训，把发酵染菌消灭在发生之前，防患于未然，是积极制服发酵染菌的最重要措施。

造成发酵染菌的原因很多，但总结归纳起来，其主要原因有：无菌空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善。在发生染菌后，根据无菌试验结果，参考以下方法进行分析，找出原因，杜绝污染。

（A）

从染菌时间来看，发酵早期染菌，可能原因有：种子带菌，培养基和设备灭菌不彻底，接种操作不当，无菌空气带菌；发酵后期染菌，可能原因有：中间补料污染，设备渗漏，操作问题。

（B）

从污染的杂菌种类来看，污染耐热的芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底；污染球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌可能是种子带菌，设备渗漏；污染霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或操作问题。

（C）

从染菌的幅度来看，如果各个发酵罐或多个发酵罐染菌，而且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题；如果各别罐连续染菌，一般是设备问题。

以上仅仅是在分析问题时作为考虑问题的入门，应根据具体情况综合分析，且通过进一步的无菌检查来验证。

3.杂菌污染途径及预防

（1）种子带菌及防止

种子带菌的原因主要有以下几方面

（A）培养基及用具灭菌不彻底

菌种培养基及用具灭菌均在灭菌锅中进行，造成灭菌不彻底主要是灭菌时锅内空气排放不完全，造成假压，使灭菌时温度还达不到要求。

（B）菌种在移种过程中受污染

菌种的移接工作是在无菌室中，按无菌操作进行。当菌种移接操作不当，或无菌室管理不严，就可能引起污染。因此，要严格无菌室管理制度和严格按无菌操作接种，合理设计无菌室。

（C）菌种在培养过程或保藏过程中受污染

菌种在培养过程和保藏过程中，由于外界空气进入，也使杂菌进入而受污染。为了防止污染，试管的棉花塞应有一定的紧密度，不宜太松，且有一定长度，培养和保藏温度不宜变化太大。每一级种子培养物均应经过严格检查，确认未受污染才能使用。

（2）无菌空气带菌及防止

无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计，过滤介质的选用和装填，过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。

（3）培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防止

培养基和设备灭菌不彻底的原因，主要与以下几个方面有关

（A）原料形状

一般稀薄的培养基容易灭菌彻底，而淀粉质原料，特别是有颗粒时，容易由于灭菌不彻底，造成染菌。淀粉质培养基灭菌以采用实罐灭菌为好，在升温时先搅拌混合均匀，并加一定量的淀粉酶边加边液化。

（B）实罐灭菌时未充分排除罐内空气

实罐灭菌时，罐内空气未完全排除，造成“假压”，使罐顶空间局部温度达不到灭菌要求，导致灭菌不彻底而污染。为此，在实罐灭菌升温时，应打开排气阀门及有关联接管的边阀、压力表接管边阀，使蒸汽通过达到彻底灭菌。

（C）培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染。培养基连续灭菌应严格控制灭菌温度，最好采用自动控制装置。

（D）设备、管道存在“死角”

由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不能到达彻底灭菌的要求。这些不能彻底灭菌的部位称为“死角”，“死角”可以是设备、管道的某一部位，也可以是培养基或其他物料的某一部分。管道多指法兰连接处等。

（4）设备渗漏引起染菌及防止

发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，往往造成渗漏。例如：设备的表面或焊缝处有砂眼，由于腐蚀逐渐加深，最终导致穿孔；冷却管受搅拌器作用，长期磨损，焊缝处受冷热和振动产生裂缝而渗漏。为了避免设备、管道、阀门渗漏，应选用优质的材料，并经常进行检查。冷却蛇管的微小渗漏不易被发现，可以压入碱性水，在罐内可疑地方，用浸湿酚酞指示剂的白布擦，如有渗漏时白布显红色。

（5）操作问题

上面已指出，在菌种培养过程中，如操作不当会引起染菌。在发酵过程如操作不当也引起染菌，如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染；等等。防止操作失误引起染菌，要加强对技术工人的技术培训和责任教育，提高工人素质，加强管理措施。