发酵染菌的检查及分析

1、镜检法

用革兰氏染色法（Grams stain）对样品进行涂片、染色， 然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂 菌的特征进行区别、判断是否染菌。

如发现有与生产菌形态特征不一样的其它微生物的存在， 就可判断为发生了染菌。
此法检查杂菌最简单、最直接、最常用。必要时还可进行 芽胞染色或鞭毛染色。
染菌的检查及原因分析
一、染菌的检查和判断
发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。
在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施 加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。因 此，生产上要求能准确、迅速的检查出杂菌的污染。 目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检 查法、肉汤培养法、平板（双碟）培养法、发酵过程的异 常观察法（如溶氧量）等。
二、发酵染菌原因分析

发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验 教训，积极采取必要措施，把杂菌消灭在发生之前。如果对已发生 的染菌不作具体分析，不了解染菌原因，未采取相应的措施来防治 染菌，将会对生产造成严重的后果。 造成发酵染菌的原因很多，且因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、 空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不 善等造成各厂污染杂菌的普遍原因。 上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析 染菌原因 染菌百分率/％ 32.05 15.46 11.34 染菌原因 补料、取样带菌 种子带菌 环境污染及原因不明 染菌百分率/％ 4.30 1.72 35.13
如杂菌类型相同，一般是空气净化系统存在空气 系统结构不合理、空气过滤介质失效等问题 ② 部分发酵罐染菌 原因 种子带菌、连消系统灭菌不彻底
发酵后期 中间补料染菌，如补料液带菌、补料管渗漏 大都由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体或罐器是否清洁等。 ③ 个别发酵罐连续染菌（如果采用间歇灭菌工艺，一般 一般设备渗漏引起的染菌，会出现每批染菌时间向前推移地现象。
5.）菌体浓度过高或过低
注意点
① 无菌试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（红色→ 黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌 落的出现，即可判断为染菌。 ② 有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项 参数确有可疑染菌，并经镜检等其它方法确认连续三次 样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。 ③ 一般来讲，无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至 本批（罐）放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。 ④ 无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品，以便能及 早发现染菌。
不会发生）连续染菌
3、不同污染时间分析



染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养期染菌。通常是 由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不 当或设备因素等原因而引起染菌。 在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌。大 部分也是由于种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及 接种操作不当或设备因素、无菌空气等原因而引起。 发酵后期染菌大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、 设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起。

2、肉汤培养法


通常用葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待测样品直接接入 经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37℃、27℃进行培 养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断 是否有杂菌。 肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时 此法也可用于噬菌体的检查。
葡萄糖酚红肉汤 0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％NaCl、 0.8％蛋白胨、0.4％酚红溶液，pH 7.2

空气系统染菌 设备问题 管理和操作不当
1、染菌的杂菌种类分析

对于每一个发酵过程而言，污染的杂菌种类的影响是不同的。
发酵产品 青霉素 链霉素 四环素 柠檬酸 谷氨酸
杂菌
危害大的杂菌 细短产气杆菌 细短杆菌、假单胞菌、产气杆菌 双球菌、芽胞杆菌、荚膜杆菌 青霉 噬菌体
原因
危害小的杂菌 粗大杆菌 粗大杆菌
3、平板划线培养或斜面培养检查法

将待测样品在无菌平板上划线，分别于37℃、27℃进行培 养，一般24h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。有 时为了提高平板培养法的灵敏度，也可将需要检查的样品 先置于37℃培养6h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。
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4.发酵异常现象观察法
1.）菌体生长差 2.）pH值过高或过低 3.）溶解氧水平异常 4.）泡沫过多
耐热的芽胞杆菌 球菌、无芽胞杆菌等
真菌
培养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等 种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、设备渗 漏、操作问题等
设备或冷却盘管渗漏、无菌室灭菌不彻底、无菌操 作不当、糖液灭菌不彻底（糖液放置时间较长）等
2、发酵染菌的规模分析
① 大批量发酵罐染菌
染菌时期 发酵前期 发酵中、后期 染菌时期 发酵前期 原因 种子带菌、连消设备染菌