发酵——染菌

1，国外一抗生素发酵染菌原因的分析
染菌原因 种子带菌 接种时罐压跌零 培养基灭菌不透 空气系统带菌 百分率，% 9.64 0.19 0.79 19.96 染菌原因 蛇管穿孔 接种管穿孔 阀门泄漏 罐盖漏 百分率， % 5.89 0.39 1.45 1.54
搅拌轴密封泄漏
泡沫冒顶
2.09
0.48
其他设备漏
四、染菌情况分析 染菌的原因有多种，对于实际情况 如何分析呢？ 1、单罐染菌 不是系统问题，而是该罐本身的问 题。如种子带菌、培养基灭菌不彻 底、罐有渗漏、分过滤器失效
2、多罐染菌 系统问题，如空气过滤系统有问题， 特别是总过滤器长期没有检查，可能 受潮失效；移种或补料的分配站有渗 漏或灭菌不彻底 3、前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底
五、染菌的防止
1、防止种子带菌 制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。 沙土制备时要多次间歇灭菌
注意接种时的无菌操作
子瓶、母瓶的移种和培养
无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要 供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以 灭菌，或用化学药品灭菌。
无菌室要求
无菌室装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时， 关灯后15分钟再接种。 用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦 桌子、拖地，开启超净台的通风， 接种时必须在超净台上操作，超净台装有一 台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有 高效过滤器，无菌操作 接种人员必须穿无菌服，戴口罩，手用酒精 棉球擦干净。
（2）发酵前期染菌
发酵前期最易染菌，且危害最大。
原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞 争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生 很少，抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。
染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料 量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施 予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消 耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重 新接种再用。
（4）发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产 物，特别是抗生素，对杂菌有一定 的抑制或杀灭能力。因此如果染菌 不多，对生产影响不大。如果染菌 严重，又破坏性较大，可以提前放 罐。
（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响
1、发酵染菌对过滤的影响 1).对过滤的影响： 发酵液的粘度加大 菌体大多自溶 由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加 2)造成的后果： 过滤时间拉长，影响设备的周转使用， 破坏生产平衡 大幅度降低过滤收率
3、不同时间染菌对发酵的影响
污染时间是指用无菌检测方法确准的污染 时间，不是杂菌窜入培养液的时间。 杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁 殖的时间才能显现出来，显现的时间又与 污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌 所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌 的时间就长。
（1）种子培养期染菌 由于接种量较小，生产菌生长一开始不 占优势，而且培养液中几乎没有抗生素 （产物）或只有很少抗生素（产物）。 因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
例如
青霉素发酵：污染细 短产气杆菌比粗大杆 菌的危害大 链霉素发酵：污染细 短杆菌、假单孢杆菌 和产气杆菌比粗大杆 菌的危害大 四环素发酵：污染双 球菌、芽孢杆菌和夹 膜杆菌的危害较大
柠檬酸发酵：污染青霉 菌 肌苷、肌苷酸发酵：污 染芽孢杆菌谷氨酸发 酵：污染噬菌体 高温淀粉酶发酵：污染 芽孢杆菌和噬菌体
4、中后期染菌
补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀 门渗漏，一般不会是种子问题
有时发酵罐偶而染菌，原因一时又找不出，一般 可以采取以下措施： (1)连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4一10月份 (杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热 至80°C，存放处理4小时，以减少带入培养 液中的杂菌数。 (2)对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空 消处理。甲醛用量每立方米罐的体积 0.12~0.17升。 (3)对染菌的种子罐可在罐内放水后进行灭菌，灭 菌后水量占罐体的三分之二以上。这是因为细 菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。
造成染菌的主要原因总结 1、设备渗漏 设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种 管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏 和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵 研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占 33.85％，上海三厂的分析这类染菌为37.5 ％。所以说加强设备本身及附属零部件的 严密度检查，对制服染菌是极其主要的， 也是重要的。
4、灭菌不彻底 灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间— —产生过多泡沫 蒸汽总压是否达到要求标准 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。 如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于 炎热的夏季将连续灭菌预热至800C的培养 基采样培养，可发现无法计数的大量的芽 孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发 现2～3个芽孢杆菌。故染菌率因季节不同 而发生明显变化。
3.发酵染菌对产品质量的影响
1)染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。 对产品的纯度有较大影响。 2)一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发 酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。
二、染菌的原因
（一）发酵染菌率计算基准 总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投 料批（次）数之比的百分率。 总染菌率%=
2、空气带菌 从日本工业技术院和上海第四制药厂分 析空气带菌而造成的染菌分别为19.96 ％和 26%。国内外空气除菌技术虽已 有较大改善，但仍然没有使染菌率降低 到理想的程度。因为空气除菌系统较为 复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气 除菌失败。
3、种子带菌
种子带菌又分为种子本身带菌和种 子培养过程中染菌。加强种子管理， 严格无菌操作，种子本身带菌是可 以克服的。种子培养过程染菌与发 酵一样有许多因素造成。
原材料储存和保管，如液胨、玉米 浆、母液糖等有机原料——杂菌的数 量 发酵罐、培养基配制罐等设备的清 洗质量——有无灭菌的死角 对减少或避免染菌仍然是十分必要的。
5、技术管理不善
技术管理就是要对发酵每个环节严 格控制，发酵中稍有不慎就可能染 菌，所以不能有侥幸心理而放松管 理
三、无菌状况的检测 1、环境无菌的检查
（一）染菌对发酵的影响 生产不同的品种，可污染不同种 类和性质的微生物。 不同污染时间，不同污染途径， 污染不同菌量，不同培养基和培养条 件又可产生不同后果
1、发酵染菌对不同品种的影响
不 同 菌
不 同 产 品
放线菌由于生长的最适pH为7左右， 因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5 左右，因此染酵母菌为多。 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能 直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则 可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不 论在发酵前期、中期或后期，染有能 产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素 迅速破坏。
2、污染不同种类和性质的微生物的影响 （1）污染噬菌体
噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅 速，也较防治，故危害极大。污染 噬菌体后，可使发酵产量大幅度下 降，严重的造成断种，被迫停产。
（2）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量 泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液， 影响发酵过程的通气搅拌。 有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使 pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是 染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死， 往往一次染菌后会反复染菌。
不 同 产 品
链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素 等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所 得，但也会造成不同程度的危害。如 杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常 代谢；改变pH，降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗 生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制 和杀灭作用。
不 同 产 品
疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用 深层培养，这是一类不加提纯而直接 使用的产品，在其深层培养过程中， 一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内 外毒素，都应全部废弃。因此，发酵 罐容积越大，污染杂菌后的损失也越 大。
（3）发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大 量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵 液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时 甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液 发臭，产生大量泡沫。 措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变 化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放 罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输 送一部分到染菌罐，抑制杂菌。
污染杂菌的种类对过滤的影响程度有 差异，如污染霉菌时，影响较小，而 污染细菌时很难过滤。由于过滤困难， 过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过 滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。 染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度 降低过滤收率，直接影响提炼总收率。
2、发酵染菌对提炼的影响
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水 溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发 生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进 一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如 链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在 离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附， 大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有 的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一 起进入洗脱液，影响进一步提纯。
设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率 不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的 染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因
（二）染菌原因 造成染菌的因素很多，但总结几十年的经 验，对绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚 的，但在实际生产中发酵染菌率仍比较高， 可以说产生这种现象大多数是由于工作中 “明知故犯”“不负责任”和“侥幸心理” 所造成的。例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭 菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知 的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐， 结果以污染杂菌而告终。现将我们收集到的 国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下：
操作问题
10.13
10.15
夹套穿孔
12.36
原因不明
24.91
2，国内一制药厂发酵染菌原因的分析
染菌原因 外界带入杂菌（取样、补料带入） 设备穿孔 空气系统带菌 停电罐压跌零 接种 蒸汽压力不够或蒸汽量不足 管理问题 操作违反规程 种子带菌 原因不明 百分率，% 8.20 7.60 26.00 1.60 11.00 0.60 7.09 1.60 0.60 35.00
3.上海第三制药厂染菌原因分析 项目 百分率% 种子带菌 14.15 盘管穿孔 14.20 阀门渗漏 23.30 空气系统有菌 10.0 管理不善 25.80 其它 7.49 原因不明 5.78
管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08％经 分析有下表所列原因： 项目 进罐前未做设备严密度检查 接种违反操作规程 检修质量缺乏验收制度 操作不熟练 配料违反工艺规程 调度不当 百分率% 25.8 25.8 19.35 19.35 6.45 3.25
尘埃粒子检测
无菌平板检测
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2、种子及发酵液无菌状况检测
①显微镜检查：染色 镜检 ②平板划线检查： 到平板 空培养 待测样品划线 培养观察 ③酚红肉汤培养检查： 无菌肉汤培养基空培养 接入样品 培养观察 其他: 溶解氧 pH值 尾气中CO2含量
谷氨酸正常发酵与异常发酵溶解氧变化
判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据 无菌试验的目的： 1，监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否 彻底 2，监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入 3，了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患 和死角
什么是染菌？
发酵过程中除了生产菌以外，还 有其它菌生长繁殖
几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂 菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产 品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。
生物反应过程染菌的分析 种子培养异常 主要表现有菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老 化以及培养液的理化参数变化。
发酵异常 主要表现在菌体生长速度缓慢，形态不粗壮 或过早老化，以及糖、氮、pH、泡沫、发酵产 物、发酵浓度等理化参数不正常。
发酵过程的杂菌检查
4，从染菌的时间来分析
发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻 底、设备或管道有死角 中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理
5，从染菌的类型来分析
耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底
球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的
浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌) ：发酵罐的冷却管或夹 套渗漏 霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格