发酵过程的染菌及控制

❖染菌的防治
（二）染菌原因
造成染菌的因素很多，但总结几十年的经验，对 绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚的，但在实际 生产中发酵染菌率仍比较高，可以说产生这种现象 大多数是由于工作中“明知故犯”“不负责任”和 “侥幸心理”所造成的。例如，灭菌的蒸汽压不足 不能灭菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知 的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐，结果 以污染杂菌而告终。现将我们收集到的国内外几家 抗生素工厂发酵染菌原因列于下：
由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势， 而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有 很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低， 容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液 全部废弃。
❖染菌的防治
（2）发酵前期染菌
发酵前期最易染菌，且危害最大。
原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞 争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生 很少，抵御杂菌能力弱。
❖染菌的防治
日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析
项目
百分率%
种子带菌或怀疑种子带菌
9.64
接种时罐压跌零
0.19
培养基灭菌不透
0.79
总空气系统有菌
19.96
泡沫冒顶
0.48
夹套穿孔
12.36
盘管穿孔
5.89
接种管穿孔
0.39
阀门渗漏
1.45
搅拌轴密封渗漏
2.09
罐盖漏
1.54
其它设备渗漏
❖染菌的防治 3、防止培养基灭菌不彻底
培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌 分批灭菌 1210C，30分钟 连续灭菌 罐温125－1300C，30－45 分钟
❖染菌的防治
蒸 汽 下 进 上 出
❖染菌的防治
连续灭菌设备流程
❖染菌的防治
连消塔
❖染菌的防治
培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压 力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量 泡沫或发酵罐中有污垢堆积，就会窝藏大量杂菌， 造成灭菌不彻底。 为什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢？ 培养基和水的传热系数比空气的传热系数大，如 果灭菌时升温太快，培养基急剧膨胀，发酵罐内 的空气排出较慢，就会产生大量泡沫，泡沫上升 到发酵罐顶，泡沫中的耐热菌就不能与蒸汽直接 接触，未被杀死。
❖染菌的防治
2、多罐染菌 系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是 总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移 种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底
3、前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底
❖染菌的防治
4、中后期染菌 补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗 漏，一般不会是种子问题
❖染菌的防治 五、染菌的防止
项目 进罐前未做设备严密度检查 接种违反操作规程 检修质量缺乏验收制度 操作不熟练 配料违反工艺规程 调度不当
百分率% 25.8 25.8 19.35 19.35 6.45 3.25
❖染菌的防治
第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析
项目
百分率%
外界带入杂菌（取样、补料）
8.20
设备穿孔
7.60
空气系统有菌
发酵过程的染菌及控制
❖染菌的防治
（一）染菌对发酵的影响
生产不同的品种，可污染不同种类和性质 的微生物。
不同污染时间，不同污染途径，污染不同 菌量，不同培养基和培养条件又可产生不 同后果
❖染菌的防治
1、发酵染菌对不同品种的影响 不
同 放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此 菌 染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因
1、防止种子带菌
制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。 沙土制备时要多次间歇灭菌 注意接种时的无菌操作 子瓶、母瓶的移种和培养
无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒 温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化 学药品灭菌。
❖染菌的防治
无菌室要求
在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时， 关灯后15分钟再接种。 用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、 拖地，开启超净台的通风， 接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓 风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤 器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不 可能进入接种区域，保证无菌条件。 接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精 棉球擦干净。
❖染菌的防治
2、发酵染菌对提炼的影响
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和 其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，很 难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆 大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面， 或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交 换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与 产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
品
弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后 的损失也越大。
❖染菌的防治
2、污染不同种类和性质的微生Biblioteka Baidu的影响
（1）污染噬菌体 噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也 较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可 使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种， 被迫停产。
❖染菌的防治
（2）污染其它杂菌
有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫， 即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过 程的通气搅拌。 有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下 降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌， 由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会 反复染菌。
❖染菌的防治
试漏方法可采用水压试漏法。即被测设备的出口处装 上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要求 压力，关闭进出水，看压力有否下降。压力下降则有 渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以用稀 碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，只要酚 酞能变红处即为渗漏处。
阀门渗漏可以用集气桶来试漏。方法是先在集气桶 中装满水，然后关闭所有阀门，向发酵罐中通入空气， 使罐压上升到要求压力，一般一公斤以上。由于集气 桶连通各管道，观察哪根管子冒泡，即这根管子的阀 门漏气。
❖染菌的防治
4、灭菌不彻底
灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系
蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间——产生 过多泡沫
蒸汽总压是否达到要求标准
环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海 第四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将 连续灭菌预热至800C的培养基采样培养，可发现 无法计数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培 养中，则仅发现2～3个芽孢杆菌。故染菌率因季 节不同而发生明显变化。
同 成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干
产 扰生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。
品
灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
❖染菌的防治
疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层
不
培养，这是一类不加提纯而直接使用的产
同
品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，
产
不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废
26.00
停电罐压跌零
1.60
接种
11.00
蒸汽压力不足或蒸汽量不足
0.60
管理问题
7.80
操作违反规程
1.60
种子带菌
0.60
原因不明
35.00
❖染菌的防治
造成染菌的主要原因总结
1、设备渗漏
设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、 阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。 从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发 现，这类染菌占33.85％，上海三厂的分析这类染 菌为37.5％。所以说加强设备本身及附属零部件的 严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重 要的。
❖染菌的防治
防止方法： 缓慢开启蒸汽阀门，或加入少 量消泡剂。 灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些 “死角”。这些死角蒸汽不能有效达到，常 会窝藏耐热芽孢杆菌，所以设备安装要注意 不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除 污垢。
❖染菌的防治
二、染菌的原因
（一）发酵染菌率计算基准
总染菌率指单位时间内（一年）发酵染菌的批（次） 数与总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数应 包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数 在内。这是习惯的计算方法，也是我国的统一计算方 法。
总染菌率%=
发酵染菌批（次）数 总投料批（次）*数100%
❖染菌的防治
原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、 母液糖等有机原料——杂菌的数量 发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质 量——有无灭菌的死角 对减少或避免染菌仍然是十分必要的。
❖染菌的防治
5、技术管理不善
技术管理就是要对发酵每个环节严格控 制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以 不能有侥幸心理而放松管理
❖染菌的防治
3、不同时间染菌对发酵的影响
污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间， 不是杂菌窜入培养液的时间。
杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时 间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。 污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染 菌量少，显现染菌的时间就长。
❖染菌的防治
（1）种子培养期染菌
在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。
染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料 量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施 予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消 耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重 新接种再用。
❖染菌的防治
（3）发酵中期染菌
发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸， 培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶， 产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。 有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。
❖染菌的防治
❖染菌的防治 2、防止设备渗漏
发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与 设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导 致设备及附件渗漏。 设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、夹 套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵 罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入 发酵罐而造成染菌。 设备上的漏隙如果肉眼能看见，容易发现，也容易治 理；但有的微小泄漏，肉眼看不见，必须通过一定的 试漏方法才能发现 。
❖染菌的防治
2、空气带菌
从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气 带菌而造成的染菌分别为19.96％和 26%。国 内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没 有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌 系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空 气除菌失败。
❖染菌的防治
3、种子带菌
种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养 过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操 作，种子本身带菌是可以克服的。种子培 养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。
此染酵母菌为多。
不 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接
同 产 品
产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉 素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、 中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌， 都能使青霉素迅速破坏。
❖染菌的防治
链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不
不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造
措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。 如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素 生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑 制杂菌。
❖染菌的防治
（4）发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产物， 特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或 杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产 影响不大。如果染菌严重，又破坏性较 大，可以提前放罐。
❖染菌的防治
（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响
1、发酵染菌对过滤的影响
染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，所 以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致 过滤困难。即使采取加热、冷却、添加助滤剂 等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理想。
❖染菌的防治
污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异， 如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很 难过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影 响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏 了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而 大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总收率。
❖染菌的防治 三、无菌状况的检测
1、环境无菌的检查 尘埃粒子检测 无菌平板检测
❖染菌的防治 2、种子及发酵液无菌状况检测
酚红肉汤培养基检测 平板划线 显微镜观察
❖染菌的防治
四、染菌情况分析
染菌的原因有多种，对于实际情况如何分 析呢？
1、单罐染菌 不是系统问题，而是该罐本身的问题。如 种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、 分过滤器失效
10.13
操作原因
10.15
原因不明
24.94
❖染菌的防治
上海第三制药厂染菌原因分析
项目
百分率%
种子带菌
14.15
盘管穿孔
14.20
阀门渗漏
23.30
空气系统有菌
10.0
管理不善
25.80
其它
7.49
原因不明
5.78
❖染菌的防治
管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08％经分析有 下表所列原因：