茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定(3学时)解析

实验一茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定（3学时）

一、目的要求

1、通过实验，掌握茶叶多酚氧化酶活性的测定方法。

2、理解酶活性测定常规方法及一般原理。

二、基本原理

茶叶多酚氧化酶是茶树体内最重要的酶类之一，它不仅在茶树生理代谢过程中起着重要作用，而且在茶叶加工，尤其在红茶制造过程中，催化多酚类物质的氧化也起着主导作用。

多酚氧化酶的活性检测方法，包括检压法、分光光度法、氧电极法和滴定法等。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在460nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下：

多酚氧化酶

邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O

三、仪器及试剂

1、材料：茶树鲜叶。

2、仪器：721型分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。

3、试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.1M磷酸缓冲液（pH6.5）；硫酸铵；1%邻苯二酚溶液；0.1%脯氨酸溶液；6M尿素溶液或20%三氯醋酸。

四、操作步骤

1、粗酶液的制备：称取洗尽茶树鲜叶5.0g于研钵（或匀浆机）中，加入2g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2~3ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2、活性酶的测定：取酶液1ml于离心管中，加入3ml反应混合液（2.0ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液，0.6ml 1%邻苯二酚溶液；0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37℃恒温水浴中保温10min，立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml终止反应。4000rpm离心10min。取上清液，用1cm比色皿，在460nm波长处，在1~2min内测定吸光度值（A）。空白对照用缓冲液代替反应液中的邻苯二酚，其它条件相同。

五、结果计算

以每克样每分钟内A460增加0.1为1个酶活力单位。

A460×酶提取液总量（ml）

酶活力（0.1A•g-1•min-1）＝——————————————————————————

0.1×反应时间（min）×样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）

六、注意事项

1、反应混合液必须现配现用，否则会因邻苯二酚自动氧化而失效；邻苯二酚还可用儿茶素代替。

2、脯氨酸是用作有色氧化产物形成的稳定剂和加速剂。

3、聚乙烯吡咯烷酮是用作多酚类吸附剂，亦可用聚酰胺及TWEEN80等代替。