木质素合成与梨石细胞
梨果实石细胞研究进展
梨果实石细胞研究进展
刘小阳, 高贵珍 ( 宿州学院化学与生命科学系, 安徽宿州234000)
摘要 石细胞的含量是梨果实品质的决定性因素, 国内外科技工作者 对梨果实石细胞的形态特征、发育形成 机理与调控以及遗 传特性 进行了大量的研究。在对这些研究进行综述的基础上, 提出了今后石细胞研究的主要方向。 关键词 梨; 石细胞; 果实品质; 生理因素; 环境因素 中图分类号 S661 .2 文献标识码 A 文章编号 0517 - 6611( 2007) 33 - 10572 - 03
石细胞是一种厚壁组织细胞, 由薄壁组织细胞在其初生 壁上沉积了次生壁而形成, 由于其具有硬化的壁, 所以称为 石细胞[ 5] 。梨 的石细胞在 分类上 属于 短石 细胞[ 6] , 由 多量 木 质素和纤维素组成。石细胞在果肉中单个或成群存在, 成群 的石细胞 称为石细胞 团( 一般 所称梨“石 细胞”是 指由 多数 石 细胞组成的 石 细 胞团) 。 梨的 石 细 胞形 态 多 种多 样, 经 低 温 冷 冻分 离的 石 细胞 在光 学 显微 镜 下观 察, 其大 小、形 状均 不 规则, 大的石细胞有大小不同的木质化突起。梨石细胞具有 较大的吸胀性, 刚分离出的石细胞在水中呈淡黄色, 比果肉 细胞组织颜色深, 经风干失水后, 细胞呈淡白色, 体积干缩变 小。干燥后的石细胞, 再放入水中, 又会吸水, 增大体积, 呈 淡黄色 , 但不能 恢复到干燥前 的体积[ 7] 。
梨果实中 石细胞的数 量和大小受 遗传 基因、内部 生理 因 素和外 界环境因素 的调控。 5 .1 基因调 控 李 俊 才等[ 24] 研 究 了梨 石 细 胞的 遗 传 特性 , 认为梨果实石细胞数量为多基因控制的数量遗传, 其杂交后 代石细胞含量与亲本相比呈明显增多趋势, 组合间遗传传递 力高达120 % ～200 % , 平均 达 156 % 。 但 多基 因 之 间 如 何 协 同表达来调控石细胞的发育, 至今还未见报道。 5 .2 生理因 素的调控 梨石细 胞是 由薄 壁组 织细 胞 在其 初 生壁上沉积了次生壁而形成的厚壁细胞, 木质素是细胞次生 壁和石细胞的主要成分, 简单地说梨石细胞是由果实发育过 程中木质素沉淀形成的, 因此木质素的合成直接影响到梨果 实中石细胞 的分化 和发 育[ 25] 。凡 是影 响 次生 壁形 成 以及 参 与调控 木质素合成 过程的酶、内外源 激素等 生理 因素 都是 影 响石细 胞形成的重 要因素。 5 .2.1 苯 丙氨酸解氨 酶( PAL) 、过氧化物酶( POD) 、多 酚氧 化 酶( PPO) 的 调控。木 质素 是酚 类 化 合物 的 聚 合物 , 通过 苯 丙 烷类代谢途径产生, 由苯丙氨酸脱氨形成肉桂酸起始, 经一 系列羟基化 、甲 基化 与 还 原反 应, 形 成 合 成木 质 素 的3 种 主 要单体, 分 别为 香 豆 醇、松 柏 醇 和 芥 子 醇[ 26 - 27] , 最 后3 种 单 体聚合 形成木质素 。木质素合 成代 谢过 程 中,PAL 是 催化 其 代谢反应第一步的酶, 它催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸, 经 C4H( ci nnamate 4- hydroxylase) 催 化 生 成 香 豆 酸,PPO 催 化 香 豆 酸向咖啡酸转化, 为形成木质素的3 种单体提供前体物质, 后再通 过多条途径 转 化为3 种主 要 单体。 而 POD 则是 在 木 质素合成 的最后一 步起 关 键作 用。3 种 主要 单体 形 成 后, 这 3 种单 体 在 POD 作 用 下 脱 氢 聚 合 形 成 木 质 素[ 27] , 证 实 了 PAL 、POD 和 PPO 是 木 质 素 合 成 过 程 中 3 个 最 重 要 的 酶 , 且 PAL 、PPO 、POD 的 活性与木质 素的合成呈 正相关。
过氧化物酶调控木质素合成研究进展
摘要在植物生长发育过程中,木质素合成是极其重要的。
其代谢过程涉及多种酶类,而过氧化物酶(POD )就是这一过程的一个关键酶。
本文从木质素合成途径、POD 酶学性质以及POD 基因调控等方面综述过氧化物酶对木质素合成的调控,阐述了过氧化物酶与木质素合成的关系,介绍了过氧化物酶的类型、功能及基因层面的研究。
关键词木质素;生物合成;过氧化物酶;研究进展中图分类号Q943文献标识码A 文章编号1007-5739(2021)23-0047-03DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2021.23.019开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Research Progress on Regulation of Peroxidase on Lignin SynthesisLONG Guohui 1,2,3WU Pengyu 1,2,3FU Jiazhi 1,2,3LU Hongli 1,2,3ZHANG Rui 1,2,3*(1Key Laboratory of Biological Resources Conservation and Utilization in TarimBasin,Xinjiang Productionand Construction Corps,Alar Xinjiang 843300;2College of Plant Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300;3National and Local Joint Engineering Experiments of High-efficiency and High-quality Cultivation and Deep ProcessingTechnology of Characteristic Fruit Trees in Southern Xinjiang,Alar Xinjiang 843300)Abstract Lignin synthesis is extremely important in the process of plant growth and development,a variety of enzymes areinvolved in its metabolism,and peroxidase (POD)is a key enzyme in this process.This paper reviewed the regulation of peroxidase on lignin synthesis from the aspects of lignin synthesis pathway,POD enzymatic properties and POD gene regulation,expounded the relationship between peroxidase and lignin synthesis,introduced the type and function of peroxidase and the research on gene level.Keywords lignin;biosynthesis;peroxidase;research progress过氧化物酶调控木质素合成研究进展龙国辉1,2,3武鹏雨1,2,3付嘉智1,2,3鹿宏丽1,2,3张锐1,2,3*(1新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室,新疆阿拉尔843300;2塔里木大学植物科学学院,新疆阿拉尔843300;3南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室,新疆阿拉尔843300)作为酚类聚合物之一的木质素,在所有陆生植物体内都有分布,其含量占生物总量的18%~35%[1-2]。
石细胞对梨果实品质的影响及应对措施
石细胞对梨果实品质的影响及应对措施作者：孙秋红，何子顺来源：《中国果菜》 2015年第6期孙秋红1 何子顺2*（1. 淄博张店区牧龙山绿化管理处，山东淄博 255000；2. 库尔勒市香梨研究中心, 新疆库尔勒 841000）摘要：为了探明梨果实石细胞对梨果实品质的影响以及降低影响的措施，本文对石细胞的特性、石细胞对品质的影响以及石细胞的形成因素进行了分析，从果实套袋、改善光照条件、喷施药剂三个方面提出了降低石细胞影响的措施。
关键词：梨；石细胞；品质中图分类号：S661.2 文献标志码：A 文章编号：1008-1038(201５)06-0045-04随着生活水平的提高，人们在梨果品消费方面逐渐增加了对品质的关注。
梨果实的品质由多个因素构成，石细胞是影响梨果实品质的重要因素之一。
石细胞是梨果实中的一类厚壁细胞，它影响梨果实的食用品质和加工品质。
探明石细胞对梨果实品质的影响，采取有效措施降低其影响，对提高梨果实品质有重要意义。
研究表明，石细胞的梨果实影响品质，是由石细胞团直径的大小和密度共同决定[1]。
石细胞团直径的大小和密度与品种、内部生理因素和外界环境因素密切相关。
然而，目前在有关降低石细胞对梨果实品质措施方面的报道不多。
鉴于此，本文就石细胞对梨果实品质的影响，以及切实可行的降低其对梨果品质量影响的措施进行综述，以期在生产上为提高梨果实品质提供参考。
1 石细胞和梨果实的品质1.1 石细胞石细胞是由薄壁细胞在其初生壁上沉积次生壁（主要成分为木质素）而形成的厚壁细胞。
由于具有硬化的壁，所以称为石细胞。
在分类上属于短石细胞，由大量木质素和纤维素组成。
石细胞在果肉中单个或成群存在，成群的石细胞称为石细胞团，一般所说“石细胞”实际就是由多数石细胞组成的石细胞团[2]。
在吃梨时，人们不能感觉到单个石细胞，但可以感觉到直径较大的石细胞团，尤其是在吃到梨核时，嘴里可感到像沙粒一样的东西，这就是石细胞团。
这样的石细胞团直径一般都在0.5mm以上，肉眼可分辨，现已测得最大的石细胞团直径达到1.5mm[3]。
梨果实石细胞木质素合成调控机制研究进展
梨果实石细胞木质素合成调控机制研究进展
王红宝;王永博;王晋;李勇;李晓;王迎涛;王亚茹
【期刊名称】《果树学报》
【年(卷),期】2024(41)4
【摘要】石细胞是由木质素沉积形成的厚壁组织细胞,是制约梨果实品质提升的重要因素。
梨果肉石细胞的形成与木质素的生物合成、转移和沉积密切相关。
因此,探究梨果实发育过程中木质素合成调控机制对调节石细胞形成及果实品质改良具有重要意义。
总结近年来与梨果实木质素合成调控机制有关的研究,对转录因子、激素、糖、钙、活性氧、光质及花粉直感等调控因子在梨果实木质素合成中的作用机制进行综述,旨在为梨果实木质素的调控网络深入研究及品质改良提供参考。
【总页数】14页(P750-763)
【作者】王红宝;王永博;王晋;李勇;李晓;王迎涛;王亚茹
【作者单位】河北省农林科学院石家庄果树研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S661.2
【相关文献】
1.柑橘果实粒化过程中木质素生物合成与调控研究进展
2.过氧化物酶调控木质素合成研究进展
3.木质素合成途径及其调控梨褐皮性状研究进展
4.激素信号调控果树果实花色苷合成机制研究进展
5.梨石细胞形成的控制因素及对果实质构影响研究进展
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梨果肉石细胞含量分析
ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔｑｕａｌｉｔｙｏｆｋｉｎｇｏｙｓｔｅｒｍｕｓｈｒｏｏｍ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｅｒｙｎｇｉｉ）ｓｔｏｒｅｄ ［１１］曲智强．含吲哚结构的吡唑酰胺的合成及抑菌活性研究［Ｄ］．
ａｔｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ［Ｊ］．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，１９６：１０９２－１１００．
泰安：山东农业大学，２０１５．
梨生物学特性
的花坐果好。 • 梨自花结果率多数很低，多数梨品种均要配置授
粉品种。鸭梨自花结实率为0～5％，茌梨为0～2 ％，白酥为0。自然授粉情况下，一般每花序可坐 2-3果，个别品种会更多。
• 梨正常落花落果一般为两次。据中国农业科学院 果树研究所对定县鸭梨的研究，在定县落花终期 最早为4月21日，最迟为4月30日，莱阳农学院5年 间对茌梨的研究，落花期最早为5月2日，最迟到5 月11日，生理落果期，最早5月17日，最迟在6月 21日。
叶芽萌发和展叶
（二）枝的类型
结果枝
梨枝条
发育枝：生长健壮、叶片肥大，芽体 饱满；
营养枝 细弱枝：枝细而短，叶小而薄，芽体瘦小
叶丛枝：是在节间密生的短小枝
新梢的年生长动态 新梢的加长生长：主要是节间细胞活动的结果，使节间伸
长，新梢随之加长。 新梢的加粗生长：是枝条的形成层分生活动的结果。加粗
生长多与加长生长相伴进行。
高峰 第一次：在5月 下旬至6月上旬, 新梢停长后， 全年根系生长 最旺盛的时期
第二次：在9月 下旬至10月中， 采果前，根系 生长时间较长， 速度较慢，
（3）根系抗盐碱，pH5.4~8.5均可正常 生长
2 、枝叶生长特点
a. 寿命长， b. 干性强，
c. 枝直立，木质脆，长势旺，易劈裂，故 在拉枝、拿枝上要选择枝软的季节
cm
cm
1000
10
900
根系生长量
9
根平均生长量
800
新根数
8
700
新梢平均生长量
7
600
6
500
5
不同品种梨果石细胞含量差异研究
不同品种梨果石细胞含量差异研究黄凯;王娟娟;刘汉云【摘要】为了探索不同梨品种果实的石细胞差异,以硕丰梨、玉露香梨、巴梨为试材,测定了3个品种梨果实石细胞含量、石细胞团的分布、石细胞团的大小与密度等指标.结果表明,石细胞含量由高到低依次为硕丰梨＞玉露香梨＞巴梨,果实不同部位石细胞含量由高到低依次为近果心＞近果皮＞果肉中部;同一品种的梨果,果实较小的梨果石细胞含量更高.间苯三酚-盐酸染色结果显示,石细胞团主要分布在果心处,且呈现出辐射状由果心向果肉中延伸,分布特点是近果心＞近果皮＞果肉中部.近果心处石细胞分布密度由高到低依次为硕丰梨＞玉露香梨＞巴梨.研究结果可为改善梨果实品质奠定基础.%To explore the difference of stonecell,‘Yuluxiang'pear,Bartlett pear and ‘Shuofeng'pear were chose as the research object,the paper mainly measured the indexes of the stone cell content,the distribution of stone cell and the density and size of stone cell.The results showed that the order (from higher to lower) of the stone cell content in different pear varieties was ‘Shuofeng'pear ＞‘Yuluxiang'pear ＞ Bartlett pear.The order (from higher to lower) of the stone cell content in different parts was core region ＞ peel region ＞middle part.The smaller pear had a higher content of stone cell in one variety.The result of Wiesner reaction showed that the group of stone cells mainly distributed in the core,and showed a radiation shape from the core to the pulp extends.The distribution characteristics was the stone ceils in the core ＞ the stone cells near the pear peel ＞ the stone cells in the middle flesh.The density distribution of the stone cell in the core paris was‘Shuofeng'pear ＞‘Yuluxiang'pear ＞ Bartlett pear.This research laid the foundation for improving the quality of pear fruit.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2017(045)002【总页数】3页(P191-193)【关键词】梨;石细胞;硕丰梨;玉露香梨;巴梨【作者】黄凯;王娟娟;刘汉云【作者单位】山西农业大学林学院,山西太谷030801;山西农业大学林学院,山西太谷030801;山西农业大学林学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】S661.2梨属蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae）梨属（Pyrus），为乔木落叶果树[1]。
砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)果实石细胞、褐色果皮和柠檬酸形成机制研究
砂梨（Pyrus pyrifolia Nakai）果实石细胞、褐色果皮和柠檬酸形成机制研究本研究以长江流域及以南地区广泛种植的砂梨(Pyrus Pyrifolia Nakai)为研究对象,研究了与梨果实品质密切相关的石细胞、果皮颜色和果实有机酸品质性状,从生理生化、基因克隆、基因表达模式、转基因验证等方面进行了关于砂梨果实发育过程中石细胞、果皮褐色形成机制及砂梨果实柠檬酸积累机制的研究。
本研究对砂梨果实石细胞、褐色果皮形成、柠檬酸优势积累的探讨,为砂梨新品种的选择、培育提供了理论基础。
本研究获得的主要结果如下：1、梨果实中石细胞研究(1)本研究选取‘桂花’和‘脆绿’两个砂梨品种为研究对象,经分析两者果实的石细胞含量和木质素含量在果实发育期及成熟期均存在显著差异。
在果实发育过程中,‘桂花’和‘脆绿’果实中的石细胞和木质素含量均在果实发育初期升高,盛花后56天达到峰值然后下降,盛花后98天后维持在一定的水平,直至果实成熟。
在石细胞形成的主要时期(盛花后42-70天),‘桂花’果实中的石细胞和木质素含量均显著高于‘脆绿’,最大差异均在两倍以上。
因此,‘桂花’果实中与石细胞形成相关的木质素合成代谢要比‘脆绿’旺盛,相关基因表达可能要强于‘脆绿’。
(2)为进一步研究木质素代谢在石细胞形成中的作用,本研究从梨果实中克隆分析了一个木质素代谢途径中的关键酶-肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl CoA reductase; CCR)的编码基因,命名为PpCCRo经分析该基因包含一个1020bp的开放阅读框(ORF),编码339个氨基酸,预测的蛋白质分子量为37.2kDa。
生物信息学分析表明,PpCCR与其它植物CCR相比有较高同源性,并且具有保守的NADP结合位点及酶催化位点。
系统进化树的分析结果表明,植物CCR家族可分为双子叶植物和单子叶植物两大类,PpCCR属于其中的双子叶植物类,与桉树、杨树、光皮桦等木本植物CCR 亲缘关系较近。
鸭梨ＰＡＬ 基因的反义遗传转化及表达分析
㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ａｐｒ．２０１８，３８（４）：４９２－５００ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ．ｃｏｍＤＯＩ：１０．１１９３１／ｇｕｉｈａｉａ．ｇｘｚｗ２０１７０５００５引文格式：李会宣，许冬倩，闫洪波．鸭梨ＰＡＬ基因的反义遗传转化及表达分析［Ｊ］．广西植物，２０１８，３８（４）：４９２－５００ＬＩＨＸ，ＸＵＤＱ，ＹＡＮＨＢ．ＡｎｔｉｓｅｎｓｅｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＡＬｇｅｎｅｉｎＹａｌｉＰｅａｒ（Ｐｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，２０１８，３８（４）：４９２－５００鸭梨ＰＡＬ基因的反义遗传转化及表达分析李会宣∗，许冬倩，闫洪波（河北经贸大学生物科学与工程学院，石家庄０５００６１）摘㊀要：苯丙氨酸解氨酶（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅ，ＰＡＬ，ＥＣ４．３．１．５）是植物通过苯丙烷代谢途径合成木质素的关键酶和限速酶，其通过影响木质素的合成而与果实中石细胞的分化㊁发育及果实品质密切相关㊂为了降低鸭梨中苯丙氨酸解氨酶的含量，该研究利用反义ＰＡＬ基因遗传转化鸭梨㊁降低鸭梨内源ＰＡＬ基因的表达㊂结果表明：（１）采用ＲＴ⁃ＰＣＲ技术，利用根据ＧｅｎＢａｎｋ中西洋梨ＰＡＬ基因序列设计特异性引物，扩增得到４９６ｂｐ的鸭梨ＰＡＬ基因片段㊂（２）将扩增片段反向插入载体ｐＢＩ１２１的ＭＣＳ区域，构建植物ＰＡＬ基因反义表达载体ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ㊂接着采用电转化法将反义表达载体转入农杆菌ＥＨＡ１０５中，并制备出农杆菌工程菌液㊂（３）利用农杆菌介导法对鸭梨组培苗叶片外植体进行遗传转化，得到２３株转基因鸭梨苗㊂ＰＣＲ检测证实ＰＡＬ反义基因片段转入鸭梨中，实时定量ＰＣＲ检测表明转基因鸭梨苗体内ＰＡＬ基因表达量均有所降低，为非转基因苗的６５％ ７５％㊂该研究结果表明利用反义ＲＮＡ技术获得了抑制内源性ＰＡＬ基因表达的转基因鸭梨植株，为改善鸭梨果实品质㊁改良品种奠定了基础㊂关键词：鸭梨，苯丙氨酸解氨酶，反义ＲＮＡ，遗传转化，基因表达中图分类号：Ｑ９４３．２，Ｓ７７２．３，Ｓ６６１．２㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀文章编号：１０００⁃３１４２（２０１８）０４⁃０４９２⁃０９ＡｎｔｉｓｅｎｓｅｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＡＬｇｅｎｅｉｎＹａｌｉＰｅａｒ（Ｐｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）ＬＩＨｕｉｘｕａｎ∗，ＸＵＤｏｎｇｑｉａｎ，ＹＡＮＨｏｎｇｂｏ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｅｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＥｃｏｎｏｍｉｃｓａｎｄＢｕｓｉｎｅｓｓ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００６１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅ（ＰＡＬ，ＥＣ４．３．１．５）ｃａｔａｌｙｚｅｓｔｈｅｆｉｒｓｔｓｔｅｐｆｒｏｍｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇｌｉｇｎｉｎｉｎｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｐａｔｈｗａｙ．Ｌｉｇｎｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｓｔｏｎｅｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｆｒｕｉｔｑｕａｌｉｔｙ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＰＡＬ，ｔｈｅａｎｔｉｓｅｎｓｅＰＡＬｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｗａｓｕｓｅｄｔｏｒｅｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓ⁃ｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＰＡＬｇｅｎｅｉｎＰ．ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｐｅａｒＰＡＬｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎＧｅｎＢａｎｋ，ａｐａｉｒｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ，ａｎｄａ４９６ｂｐｐａｒｔｉａｌＰＡＬｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲＴ⁃ＰＣＲ．ＴｈｅＰＡＬａｎｔｉｓｅｎｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ收稿日期：２０１７－０５－２６基金项目：河北省自然科学基金（Ｄ２０１５２０７０１３）；石家庄市科学技术研究与发展计划项目（１４１４９０５２２Ａ）［ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ（Ｄ２０１５２０７０１３）；ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＰｒｏｇｒａｍｉｎＳｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ（１４１４９０５２２Ａ）］㊂作者简介：李会宣（１９７２－），女，河北石家庄人，博士，副教授，主要从事真核基因表达调控研究，（Ｅ⁃ｍａｉｌ）ｌｉｈｕｉｘｕａｎｅｒ＠１２６．ｃｏｍ㊂∗通信作者ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｅｉｎｓｅｒｔｉｎｇＰＡＬｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｔｏｐＢＩ１２１ＭＣＳｒｅｇｉｏｎ．ＴｈｅｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬｗａｓｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｉｎｔｏＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＥＨＡ１０５ｂｙｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｎ，ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｔｉｓ⁃ｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｄＰ．ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｐｌａｎｔｓｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｔｗｅｎｔｙ⁃ｔｈｒｅｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｈａｒｂｏｒｉｎｇｔｈｅａｎｔｉ⁃ｓｅｎｓｅＰＡＬｆｒａｇｍｅｎｔｗｅｒｅｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ．ＴｈｅＲｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＰＡＬｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｒ，ｗｉｔｈａｍｏｕｎｔｏｆｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｅａｒ６５％－７５％．Ｔｈｅｒｅ⁃ｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｗｉｔｈｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＰＡＬｇｅｎｅｗａｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｉｎａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＰ．ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｉｍｐｒｏｖｅ⁃ｍｅｎｔｏｆｔｈｅｐｅａｒｆｒｕｉｔｑｕａｌｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ，ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅ，ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ，ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀鸭梨（Ｐｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）作为中国的白梨品种，味甜多汁，香气浓郁，营养丰富㊂梨果肉中的石细胞团严重影响了梨果实的食用品质（田路明等，２０１１；吕芮宏等，２０１１）㊂木质素作为石细胞的主要成分，其合成是从苯丙氨酸解氨酶（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅ，ＰＡＬ）催化Ｌ⁃苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸开始的（Ｋｕｍａｒ＆Ｅｌｌｉｓ，２００１）㊂梨果实中的ＰＡＬ首先参与木质素单体的合成，然后在过氧化物酶的作用下聚合成为木质素，进而为石细胞的形成提供原料（Ｖａｎｈｏｌｍｅｅｔａｌ，２０１０）㊂因此，ＰＡＬ为木质素合成的第一个关键酶（Ｈｕａｎｇｅｔａｌ，２０１０），酶蛋白的合成与沉积以及酶蛋白的活性与石细胞的发育密切相关㊂以往的研究主要集中在控制植物果实中ＰＡＬ的活性，以期影响木质素的含量㊁石细胞的形成，进而影响果实品质㊂王斌等（２０１３）和刘艳等（２０１１）的研究就发现梨石细胞含量与果实中ＰＡＬ活性呈现极其显著的正相关关系，果实套袋能够降低ＰＡＬ的活性，导致木质素的合成减少㊁果实中石细胞的含量降低㊂邹丽红和张玉星（２０１２）对砂梨的研究也表明通过果实套袋抑制ＰＡＬ活性，可以减低石细胞的含量㊁密度和大小，在一定程度上改进了果品的品质㊂物理方法虽然抑制了ＰＡＬ的活性㊁降低木质素的含量和石细胞的形成，但在改善果品品质方面的作用有限㊂近年来，根癌农杆菌介导的遗传转化实现了对植物的遗传改造，为进一步改善植物果实或种质品质奠定了基础（陈晓艳等，２０１７；简兴等，２０１５）㊂随着对鸭梨ＰＡＬ基因结构㊁表达特性等方面研究的不断深入（刘志浩等，２０１１；闫洪波等，２０１４），以及利用反义ＲＮＡ技术抑制鸭梨多酚氧化酶㊁果胶甲酯酶及ＡＣＣ氧化酶等基因的表达也有了成功先例（李桂琴等，２０１０；李会宣等，２０１４；齐靖等，２０１４），这些为利用反义ＲＮＡ技术降低内源性鸭梨ＰＡＬ基因的表达水平，减少活性ＰＡＬ的合成提供了理论参考和实验经验㊂基于此，本研究通过构建鸭梨ＰＡＬ基因的反义表达载体，利用农杆菌介导法转化鸭梨组培苗，以期获得转化反义ＰＡＬ基因片段的鸭梨，为获得ＰＡＬ基因表达水平降低的转基因植株㊁研究ＰＡＬ在鸭梨中的作用以及为选育石细胞含量少的优质鸭梨品种提供参考，进而为改良品种奠定基础㊂１㊀材料与方法１．１材料植物材料：鸭梨，河北省农林科学院梨园栽植㊂载体和菌株：ｐＵＣｍ⁃Ｔｖｅｃｔｏｒ和大肠杆菌Ｔｏｐ１０购自上海生物工程公司，ｐＢＩ１２１和根癌农杆菌ＥＨＡ１０５由本室保存㊂试剂：ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ㊁ＳａｃＩ和ＸｂａＩ限制性内切酶㊁氨苄青霉素（Ａｍｐ）㊁链霉素（Ｓｔｒ）㊁卡那霉素（Ｋａｎ）㊁羧苄青霉素（Ｃａｒｂ）㊁Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ㊁连接试剂盒㊁ＩＰＴＧ㊁Ｘ⁃ｇａｌ㊁Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自上海生物工程公司；基因组ＤＮＡ提取试剂盒㊁质粒ＤＮＡ提取试剂盒㊁琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒㊁ｃＤＮＡ合成试剂盒购自天根生化科技有限公司；ＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔ试剂盒㊁ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ试剂盒购自宝生物工程公司；测序由上海生物工程公司完成㊂３９４４期李会宣等：鸭梨ＰＡＬ基因的反义遗传转化及表达分析１．２方法１．２．１引物设计㊀参考ＧｅｎＢａｎｋ公布的苯丙氨酸解氨酶基因ＰＡＬＣＤＳ序列（ＤＱ９０１３９９．１）的核心区，利用Ｏｌｉｇｏ６．０软件设计上游引物ＦＰ１（５ᶄ⁃ＴＴ⁃ＧＡＧＣＴＣＣＡＡＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＡＣＣＣＴ⁃３ᶄ）和下游引物ＲＰ１（５ᶄ⁃ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣ⁃ＣＴＣＣＴＣＡＡＡ⁃３ᶄ），粗体部引入的ＳａｃＩ和ＸｂａＩ酶切位点㊂１．２．２目的基因的克隆和测序㊀利用Ｔｒｉｚｏｌ法提取鸭梨叶片总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ㊂ＰＣＲ扩增：以ｃＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ，扩增ＰＡＬ基因片段㊂反应体系２０μＬ：２ˑＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬ，上㊁下游引物各１μＬ，模板１μＬ，用ｄｄＨ２Ｏ补至２０μＬ㊂反应条件：９５ħ预变性３ｍｉｎ，９５ħ变性３０ｓ，５８ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸４５ｓ，循环３０次，最后７２ħ保温１０ｍｉｎ㊂扩增产物的回收㊁与载体连接㊁转化及鉴定：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行回收纯化，纯化产物与ｐＵＣｍ⁃ＴＶｅｃｔｏｒ连接㊂连接体系１０μＬ：ＰＣＲ纯化产物６μＬ，Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ１μＬ，１０ˑＴ４ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ１μＬ，ｐＵＣｍ⁃ＴＶｅｃｔｏｒ１μＬ，５０％ＰＥＧ⁃４０００１μＬ㊂连接物采用热激法转化Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０感受态细胞，利用蓝白斑法筛选阳性菌落，提取质粒并进行ＳａｃＩ和ＸｂａＩ双酶切鉴定㊂１０μＬ的酶切体系：质粒ＤＮＡ６μＬ，ＳａｃＩ１μＬ，ＸｂａＩ１μＬ，１０ˑｂｕｆｆｅｒＭ１μＬ㊂重组质粒酶切鉴定后送交上海生物工程公司测序，并命名为ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＡｓＰＡＬ㊂１．２．３反义ＰＡＬ基因植物表达载体的构建及鉴定㊀将重组质粒ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＰＡＬ以及植物表达载体ｐＢＩ１２１进行ＸｂａＩ／ＳａｃＩ双酶切，回收目的片段并进行连接，由于ｐＢＩ１２１中ＳａｃＩ的酶切位点在下游，ＸｂａＩ的酶切位点在上游，使得ＰＡＬ基因片段反向与ｐＢＩ１２１连接㊂连接物转化Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０，ＰＣＲ筛选阳性克隆，所用引物ＦＰ２（５ᶄ⁃ＴＣＴＴＴＣＧ⁃ＧＣＡＡＴＡＧＧＧＴＴＴＴＣＡＧＴ⁃３ᶄ）和ＲＰ２（５ᶄ⁃ＣＡＡＴＴＣ⁃ＣＴＴＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＴＣＡ⁃３ᶄ）根据反向ＰＡＬ基因片段设计㊂对ＰＣＲ鉴定含有反向ＰＡＬ基因片段的菌落，进一步培养㊁提取质粒，使用ＸｂａＩ／ＳａｃＩ酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ㊂１．３反义ＰＡＬ基因植物表达载体转化农杆菌ＥＨＡ１０５１．３．１农杆菌感受态细胞的制备㊀保存的农杆菌ＥＨＡ１０５进行划线分离，挑取单菌落接种于含Ｒｉｆ（５０ｍｇ㊃Ｌ⁃１）和Ｓｔｒ（５０ｍｇ㊃Ｌ⁃１）的ＬＢ液体培养基，２８ħ，２２０ｒ㊃ｍｉｎ⁃１震荡过夜培养活化，过夜培养物转接至相同抗生素的ＬＢ液体培养基，ＯＤ６００ʈ０．６时离心收集菌体，用ＨＥＰＥＳ溶液和１０％甘油洗涤，最后用１０％甘油悬浮菌体，分装，－８０ħ保存备用㊂１．３．２反义ＰＡＬ基因植物表达载体电击法转化农杆菌ＥＨＡ１０５感受态细胞㊀将ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ与农杆菌ＥＨＡ１０５感受态细胞混匀，电压２５００Ｖ㊁４．３ｍｓ电击转化㊂转化后菌液黑暗条件下，２８ħ，在含Ｋａｎ（５０ｍｇ㊃Ｌ⁃１）㊁Ｒｉｆ（５０ｍｇ㊃Ｌ⁃１）和Ｓｔｒ（５０ｍｇ㊃Ｌ⁃１）抗生素平板上倒置培养２ｄ㊂与此同时转化ｐＢＩ１２１作为阴性对照㊂抗性平板上长出的菌落先通过ＰＣＲ筛选，在培养㊁提取质粒用ＸｂａＩ／ＳａｃＩ酶切鉴定㊂正确的农杆菌菌株用ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ表示，并用于制备工程菌液㊂１．４鸭梨的遗传转化与转反义ＰＡＬ基因无菌苗获得１．４．１农杆菌工程菌液的制备㊀在无菌条件下将保存的ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ菌液在含Ｋａｎ和Ｒｉｆ的ＬＢ培养基上划线，２８ħ倒置㊁暗培养㊂挑取单菌落接种于含同样抗生素的ＬＢ液体培养基中，２８ħ㊁２２０ｒ㊃ｍｉｎ⁃１，过夜培养，培养后的菌液１ʒ５０转接于含同样抗生素的ＬＢ液体培养基中继续振荡培养，直至ＯＤ６００＝０．５ ０．６，离心收集菌体，用ＭＳ液体培养基悬浮，稀释１０倍备用㊂同样方法制备含ｐＢＩ１２１空载体的农杆菌菌液作为对照组工程菌液㊂１．４．２农杆菌转化鸭梨及转基因鸭梨组培苗的获得㊀利用本室前期建立的再生转化体系对鸭梨外植体进行转化㊂取苗龄２８ｄ的鸭梨无菌组培苗叶片作为外植体，置于ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ工程菌液或含ｐＢＩ１２１空载体的农杆菌工程菌液中，浸染５ｍｉｎ后，将离体叶片放置于诱导选择培养基（Ｓ３０ｇ㊃Ｌ⁃１＋ＢＡ４．０ｇ㊃Ｌ⁃１＋ＩＡＡ０．３ｇ㊃Ｌ⁃１＋ＭＳ＋Ａｇａｒ４．０ｇ㊃Ｌ⁃１（ｐＨ５．８）＋Ｋａｎ５０ｍｇ㊃Ｌ⁃１）共培养２ｄ㊂转入添加２００ｍｇ㊃Ｌ⁃１羧苄青霉素的诱导选择培养基进行杀菌和诱导培养愈伤组织㊂将愈伤４９４广㊀西㊀植㊀物３８卷组织转入再生芽选择培养基（Ｓ３０ｇ㊃Ｌ⁃１＋ＢＡ３．０ｇ㊃Ｌ⁃１＋ＩＡＡ０．５ｇ㊃Ｌ⁃１＋Ｃａｒｂ２００ｍｇ㊃Ｌ⁃１＋Ｋａｎ５０ｍｇ㊃Ｌ⁃１ＭＳ＋Ａｇａｒ４．０ｇ㊃Ｌ⁃１（ｐＨ５．８））诱导抗性不定芽再生㊂切下４ ６ｃｍ的抗性不定芽并置于抗性苗筛选培养基（Ｓ３０ｇ㊃Ｌ⁃１＋１／２ＭＳ＋ＩＢＡ１．０ｇ㊃Ｌ⁃１＋Ａｇａｒ４．０ｇ㊃Ｌ⁃１（ｐＨ５．８）＋Ｃａｒｂ２００ｍｇ㊃Ｌ⁃１＋Ｋａｎ２０ｍｇ㊃Ｌ⁃１）上诱导生根㊁扩繁㊁并进行检测㊂１．４．３转基因植株的ＰＣＲ检测㊀按照ＴａＫａＲＡ公司的基因组提取试剂盒提取转基因鸭梨叶片基因组ＤＮＡ，使用ＦＰ２㊁ＲＰ２引物，利用ＰＣＲ检测鸭梨抗性植株ｐＢＩ１２１中插入的反向ＰＡＬ基因片段，含ｐＢＩ１２１空载体的农杆菌工程菌液侵染外植体后诱导再生的鸭梨苗作为对照㊂同时，使用ＮＰＴＩＩ基因序列设计的引物Ｎ１（５ᶄ⁃ＡＴＧＡＴＴＡＡＣＡＡＧＡＴＧ⁃ＧＡＴＴＧＣＡ⁃３ᶄ）和Ｎ２（５ᶄ⁃ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴ⁃ＣＡＡＧＡＡＧＧＣ⁃３ᶄ），通过ＰＣＲ检测ｐＢＩ１２１质粒，扩增片段的长度为７７８ｂｐ㊂１．５转基因植株ＰＡＬ表达水平检测采用ｑＲＴ⁃ＰＣＲ检测转基因植株中ＰＡＬ基因的表达水平㊂Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取鸭梨叶片总ＲＮＡ，经过ＤＮａｓｅＩ酶解㊁消化后，利用宝生物工程公司的Ｐｒｉ⁃ｍｅｓｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔ试剂盒反转录为ｃＤＮＡ，作为ｑＲＴ⁃ＰＣＲ模板㊂利用ＡＢＩ公司的ＰＲＩＳＭ７５００实时荧光定量ＰＣＲ系统，按照宝生物公司ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ说明书，两步法完成荧光定量ＰＣＲ，每个样品进行３次重复：９５ħ预变性３０ｓ，１个循环；９５ħ变性１０ｓ，６０ħ延伸３０ｓ，４０个循环㊂内参为鸭梨ａｃｔｉｎ２基因（ＧＵ８３０９５８．１），Ａ１（５ᶄ⁃ＧＧＡＣＡＴＴＣＡＡＣＣＣＣＴＣＧＴＣＴ⁃３ᶄ）和Ａ２（５ᶄ⁃ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＡＣＣＣＡＴＡＣＣＡＡＣＣ⁃３ᶄ）作为正㊁反向引物，转入的反向ＰＡＬ基因片段使用ＦＰ２和ＲＰ２作为正㊁反向引物㊂反应结束后，数据导入Ｅｘｃｅｌ表，根据得到的Ｃｔ值，运用Ｌｉｖａｋ和Ｓｃｈｍｉｔｔｅｎ报道的２－әәＣＴ方法计算目的ＰＡＬ基因ｍＲＮＡ相对表达量㊂使用ＤＰＳ软件进行差异的显著性分析㊂２㊀结果与分析２．１鸭梨ＰＡＬ基因反义表达载体的构建２．１．１鸭梨ＰＡＬ基因片段的克隆及鉴定㊀以鸭梨叶片ｃＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ技术扩增ＰＡＬ基因片段㊂琼脂糖凝胶电泳检测表明（图１：Ａ），扩增得到约５００ｂｐ特异性的单一条带，大小与预期相符㊂将扩增片段与ｐＵＣｍ⁃Ｔ载体连接，转化Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０感受态细胞，提取质粒进行ＸｂａＩ／ＳａｃＩ双酶切鉴定㊂重组质粒双酶切产物包含一个约５００ｂｐ小片段和一个约２８００ｂｐ的大片段，而空载ｐＵＣｍ⁃Ｔ载体只有一个约２８００ｂｐ大片段（图１：Ｂ）㊂重组质粒命名为ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＰＡＬ，送交上海生物工程公司测序进行测序，结果表明插入片段为４９６ｂｐ，与ＧｅｎＢａｎｋ中的西洋梨ＰＡＬ序列（ＤＱ９０１３９９．１）的一致性极高（图１：Ｃ），因此认定ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＰＡＬ含有鸭梨ＰＡＬ基因核心区４９６ｂｐ的片段㊂２．１．２鸭梨ＰＡＬ基因反义表达载体ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ的构建㊀利用ＸｂａＩ和ＳａｃＩ酶切植物表达载体ｐＢＩ１２１（切去１．９ｋｂＧｕｓ结构基因，并且保留ＣａＭｖ３５Ｓ㊁Ｎｏｓ等部分），与４９６ｂｐ的目的ＰＡＬ基因片段连接，由于ＸｂａＩ／ＳａｃＩ在载体和片段上的上㊁下游位置相反，使得目的ＰＡＬ基因片段反向与载体ｐＢＩ１２１连接㊂连接产物转化Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０感受态细胞，利用卡那霉素抗性筛选重组质粒并进行鉴定㊂一方面，以引物ＦＰ２和ＲＰ２（反向ＰＡＬ基因片段的上㊁下游引物）对重组质粒进行ＰＣＲ鉴定，扩增产物电泳（图２：Ａ）㊂另一方面，通过ＸｂａＩ／ＳａｃＩ对重组质粒进行双酶切鉴定，得到约４９６ｂｐ的特异条带（图２：Ｂ）㊂综上结果表明，ＰＡＬ基因片段已反向插入植物表达载体ｐＢＩ１２１中，鸭梨ＰＡＬ基因反义表达载体ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ构建成功㊂２．２农杆菌介导的鸭梨ＰＡＬ反义基因的遗传转化及鉴定２．２．１ＰＡＬ基因反义表达载体ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ转化农杆菌及ＰＣＲ鉴定㊀用电击法将鸭梨ＰＡＬ基因反义表达载体ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ转化农杆菌ＥＨＡ１０５细胞，与此同时转化ｐＢＩ１２１作为对照，培养后挑取单菌落用引物ＦＰ２和ＲＰ２对农杆菌菌落进行ＰＣＲ鉴定（图３）㊂图３结果表明，ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ转入农杆菌ＥＨＡ１０５㊂含ｐＢＩ１２１质粒的农杆菌命名为ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１，含反义表达载体ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ的农杆菌命名为ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ，并作为遗传转化的工程菌液㊂５９４４期李会宣等：鸭梨ＰＡＬ基因的反义遗传转化及表达分析注：（Ａ）１，２．ＰＣＲ扩增产物；Ｍ．ＤＬ２０００分子量标准㊂（Ｂ）Ｍ１．１ｋｂＤＮＡ标准分子量；１．ｐＵＣｍ⁃Ｔ；２．ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＰＡＬ；Ｍ２．ＤＬ２０００分子量标准㊂（Ｃ）Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．共同序列；ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＰＡＬ．插入ｐＵＣｍ⁃Ｔ的ＰＡＬ基因片段序列；ＤＱ９０１３９９．１．ＧｅｎＢａｎｋ公布的ＰＡＬＣＤＳ序列，其中方框中的序列为上㊁下游引物序列，划线部分为ＳａｃＩ和ＸｂａＩ的酶切位点㊂Ｎｏｔｅ：（Ａ）１，２．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ．（Ｂ）Ｍ１．１ｋｂＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１．ｐＵＣｍ⁃Ｔ；２．ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＰＡＬ；Ｍ２．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ．（Ｃ）Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ．Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＡｓＰＡＬ．ＩｎｓｅｒｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｐＵＣｍ⁃Ｔ；ＤＱ９０１３９９．１．ＰＡＬＣＤＳｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＰＡＬｉｎＧｅｎＢａｎｋ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｂｏｘｅｓｍｅａｎｔｈｅＰＣＲｆｏｒｗａｒｄａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ，ａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄａｒｅＳａｃＩａｎｄＸｂａＩｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓ．图１㊀鸭梨ＰＡＬ基因片段ＰＣＲ扩增产物㊁质粒ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＰＡＬ的ＸｂａＩ／ＳａｃＩ双酶切以及扩增片段与ＰＡＬＣＤＳ（ＤＱ９０１３９９．１）的序列比较图Ｆｉｇ．１㊀ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＰＡＬｆｒａｇｍｅｎｔ，ｐＵＣｍ⁃Ｔ⁃ＰＡＬｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＸｂａＩ／ＳａｃＩａｎｄａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｃｌｏｎｅｄＰＡＬｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔａｎｄＰＡＬＣＤＳ（ＤＱ９０１３９９．１）６９４广㊀西㊀植㊀物３８卷注：（Ａ）１，２．ＰＣＲ产物；Ｍ．ＤＬ２０００分子量标准㊂（Ｂ）Ｍ１．１ｋｂＤＮＡ分子量标准；１，２．ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ；Ｍ２．ＤＬ２０００分子量标准㊂Ｎｏｔｅ：（Ａ）１，２．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ．（Ｂ）Ｍ１．１ｋｂＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１，２．ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ；Ｍ２．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ．图２㊀ＰＣＲ及ＸｂａＩ／ＳａｃＩ酶切鉴定反义表达载体ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬＦｉｇ．２㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬｂｙＰＣＲａｎｄＸｂａＩ／ＳａｃＩｄｉｇｅｓｔｉｏｎ注：Ｍ．ＤＬ２０００分子量标准；１．ｐＢＩ１２１质粒；２．ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１菌落；３．Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０中提取的ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ质粒；４－６．ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ菌落㊂Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１．ｐＢＩ１２１；２．ＣｏｌｏｎｙｏｆＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１；３．ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬｆｒｏｍＥ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０；４－６．ＣｏｌｏｎｙｏｆＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ．图３㊀菌落ＰＣＲ鉴定含ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ的农杆菌ＥＨＡ１０５阳性克隆Ｆｉｇ．３㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬｉｎｓｔｒａｉｎＥＨＡ１０５ｂｙｃｏｌｏｎｙＰＣＲ㊀２．２．２转ＰＡＬ反义基因片段的鸭梨组培苗的获得及ＰＣＲ检测㊀参照李桂琴等（２０１０）构建的鸭梨的遗传转化和再生体系进行鸭梨反义ＰＡＬ基因的遗传转化㊂鸭梨叶片外植体经ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１或ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ工程菌液侵染后，经过再生培养基㊁再生芽选择培养基㊁抗性苗筛选培养基培养后，最终获得具有卡那霉素抗性的鸭梨组培苗９５株㊂提取再生的抗性鸭梨苗总ＤＮＡ，利用扩增ＮＰＴＩＩ基因序列的特异性引物Ｎ１和Ｎ２以及ＰＡＬ基因反向序列的引物ＦＰ２和ＲＰ２，对抗性鸭梨苗进行ＰＣＲ鉴定㊂其中，以ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ质粒作为ＰＣＲ的阳性对照，阴性对照为非转基因植株，同时还辅以转ｐＢＩ１２１鸭梨苗对照㊂９５株抗性鸭梨苗中，ＰＣＲ鉴定２３株含有反义ＰＡＬ基因片段，阳性率为２４．２％㊂部分结果如图４所示，抗性鸭梨苗（４－６泳道㊁１０－１２泳道）分别扩增得到８００ｂｐ和４９６ｂｐ特异条带，符合ＮＰＴＩＩ和反向ＰＡＬ基因片段的预期长度，证明转基因鸭梨苗基因组中含有外源的ＰＡＬ反向基因，即抗性鸭梨苗为转ＰＡＬ反义基因再生组培苗㊂２．３转基因鸭梨苗ＰＡＬ基因表达水平检测提取转基因鸭梨苗叶片总ＲＮＡ，利用ＲＴ⁃ｑＰＣＲ方法，以非转基因鸭梨苗作为对照，检测转基因鸭梨苗中ＰＡＬ基因的表达水平㊂检测结果表明，通过农杆菌介导的ＰＡＬ反义基因的遗传转化，与对照组非转基因鸭梨苗（其ＰＡＬ基因表达量设定为１）相比，２３株转基因鸭梨苗中ＰＡＬ基因表达量都有所降低，分别为对照的６５％ ７５％，其中相对表达量最低的为对照的６５．１％㊁最高的为对照的７９４４期李会宣等：鸭梨ＰＡＬ基因的反义遗传转化及表达分析注：Ｍ．ＤＬ２０００分子量标准；１，７．阴性对照（非转基因植株）；２，８．转ｐＢＩ１２１鸭梨苗；３，９．阳性对照（ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ质粒）；４－６，１０－１２．抗性鸭梨组培苗㊂Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１，７．Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（Ｎｏｎ⁃ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ）；２，８．ＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｓｅｅｄｌｉｎｇｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｂｙｐＢＩ１２１；３，９．Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ）；４－６，１０－１２．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｓｅｅｄｌｉｎｇｓｂｙｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ．图４㊀ＰＣＲ鉴定转基因鸭梨苗Ｆｉｇ．４㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｓｅｅｄｌｉｎｇｓｂｙＰＣＲ７５．２％㊂图５列出了部分转ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ鸭梨苗和转ｐＢＩ１２１鸭梨苗中ＰＡＬ基因的相对表达量㊂组１㊁组２和组３中转ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ鸭梨苗ＰＡＬ基因相对表达量，与ＰＡＬ基因相对表达量设定为１的对照非转基因鸭梨苗相比，分别为６８．１４％㊁７０．８７％和７３．２０％，均低于１，表明转ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ鸭梨苗中ＰＡＬ基因的表达量低于非转基因苗，即转ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ鸭梨苗中ＰＡＬ基因的表达受到了抑制；而转化ｐＢＩ１２１的鸭梨苗中，ＰＡＬ基因相对表达量分别为非转基因苗的１０２．８１％㊁１１１．２１％和１０１．３９％，虽然与ＰＡＬ基因表达量为１的非转基因苗有所不同，但差异不显著，表明转ｐＢＩ１２１鸭梨苗与非转基因鸭梨苗中ＰＡＬ基因表达没有差异㊂因此，即转入ＰＡＬ反义基因的鸭梨苗中内源ＰＡＬ基因的表达在一定程度上均受到了抑制，发挥抑制作用的是ＰＡＬ反义基因表达载体ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ，而非ｐＢＩ１２１空载体㊂３㊀讨论与结论石细胞的主要成分为木质素，由薄壁细胞的细胞壁强烈增厚形成，是影响鸭梨果实品质的重要因素㊂目前发现的影响梨木质素合成以及石细注：１－３．鸭梨苗㊂非转基因鸭梨苗为对照（其ＰＡＬ基因表达量为１），ＰＡＬ基因相对表达量为相对于对照的表达量㊂Ｎｏｔｅ：１－３．Ｐｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｓｅｅｄｌｉｎｇｓ．ＵｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＰ．ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｓｃｏｎｔｒｏｌ（ｗｈｏｓｅＰＡＬｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｄｅｆｉｎｅｄｉｓ１），ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＰＡＬｇｅｎｅｉｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｃｏｎｔｒｏｌ．图５㊀转基因鸭梨苗ＰＡＬ基因相对表达水平检测Ｆｉｇ．５㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＰＡＬｇｅｎｅｉｎＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｐｌａｎｔｓ胞含量㊁发育的有ＰＰＯ（李玲等，２０１１）㊁ＰＡＬ（闫洪波等，２０１４）㊁Ｆ５Ｈ（徐超等，２０１５）㊁ＣＯＭＴ（程敏等，２０１５）㊁ＰｂＣＣｏＡＯＭＴ（王丹阳等，２０１５）㊁ＰＯＤ４（李文慧等，２０１７）基因等，其中ＰＡＬ是木质素合成的首个关键酶基因㊂因此，可以通过基因表达调控８９４广㊀西㊀植㊀物３８卷控制ＰＡＬ的生成量，调节木质素的代谢，抑制石细胞的形成和发育，从而提高梨果实的口感及经济价值㊂借助农杆菌介导的反义ＲＮＡ或ＲＮＡｉ技术，可以特异性调控基因在生物体内的表达㊂本研究根据西洋梨ＰＡＬ基因序列设计引物，通过ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增得到４９６ｂｐ的ＰＡＬ基因片段，并连接到植物表达载体ｐＢＩ１２１，构建鸭梨ＰＡＬ基因特异性反义表达载体ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ㊂利用电击法将ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ转入农杆菌ＥＨＡ１０５中，制备ＥＨＡ１０５⁃ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ工程菌液㊂通过农杆菌介导的遗传转化将ｐＢＩ１２１⁃ＡｓＰＡＬ导入鸭梨，最终获得了转化ＰＡＬ反义基因片段的转基因鸭梨㊂实时定量ＰＣＲ对转基因鸭梨的ＰＡＬ表达分析表明，反义ＰＡＬ基因的遗传转化降低了鸭梨内源ＰＡＬ基因的表达，为特异性抑制鸭梨ＰＡＬ活性奠定了基础，也为应用反义ＲＮＡ技术改善鸭梨果实品质再次提供理论参考㊂在以往对鸭梨ＰＡＬ基因的研究中发现了两个基因，即家族成员ＰｂＰＡＬ１（ＧＵ９０６２６８．１）和ＰｂＰＡＬ２（ＧＵ９０６２６９．１），与大多数植物一样，均含有一个内含子（闫洪波等，２０１４）㊂两个基因编码的蛋白在分子大小㊁结构㊁带电荷特性等方面没有明显的差异，但在果实发育期过程中二者的表达量却存在差异，说明ＰＡＬ不同基因家族成员在果实发育的不同阶段可能发挥着不同的功能（闫洪波等，２０１４）㊂本研究根据西洋梨ＰＡＬ基因设计引物，扩增序列与ＰｂＰＡＬ１和ＰｂＰＡＬ２序列存在极大差异，推测原因可能是ＰｂＰＡＬ１和ＰｂＰＡＬ２的ＣＤＳ区是根据ＧｅｎＢａｎｋ中苹果ＥＳＴ序列设计的两对引物扩增得到的㊂虽然，苹果的６１个ＥＳＴ⁃ＳＳＲ和６８个ＳＳＲ可以定位于梨的连锁图上，证实苹果和梨二者的基因组结构存在保守性，但不同类型基因以及基因的不同区域在进化过程中还存在保守性差异（施泽彬等，２０１１；韩明丽等，２０１０）㊂与本研究一样，刘志浩等（２０１１）也根据西洋梨ＰＡＬ基因（ＤＱ９０１３９９．１）保守区的序列设计引物，使用鸭梨果实ｃＤＮＡ模板，扩增得到了４７８ｂｐ的ＰＡＬ基因ｃＤＮＡ片段（ＧＵ３５５６７３），虽然与本文中扩增得到的４９６ｂｐ序列在西洋梨ＰＡＬ基因序列中的位置有所不同，但二者与西洋梨的ＰＡＬ基因ＣＤＳ序列的同源性都达到了９９％㊂因此推测在鸭梨中可能还存在除ＰｂＰＡＬ１和ＰｂＰＡＬ２以外的基因家族成员，这有待于进一步的研究和证实㊂通过以上对基因的深入研究，也有待于将鸭梨ＰＡＬ基因信息应用于遗传转化，基于此，本研究利用反义ＰＡＬ基因遗传转化鸭梨，为进一步应用于遗传育种奠定基础㊂对鸭梨ＰＡＬ基因家族基因表达水平分析表明，ＰＡＬ作为合成酚类物质关键酶参与了鸭梨幼果期木质素和石细胞的合成，而且在果实发育过程中ＰＡＬ基因的表达存在明显差异（闫洪波等，２０１４）㊂以往的研究也证实反义ＲＮＡ技术在转基因鸭梨的愈伤组织以及幼苗中表现出了良好的效果（李会宣等，２０１４；齐靖等，２０１４）㊂本研究中得到的２３株转基因鸭梨苗中，ＰＡＬ基因的表达量均有所降低，为对照的６５％ ７５％不等，达到了利用反义ＲＮＡ技术抑制基因表达的效果㊂虽然都表现出了抑制内源基因表达的作用，但转基因鸭梨苗中ＰＡＬ基因表达降低的幅度不尽相同，可能与环境或植株个体特异性影响基因的表达有关㊂鸭梨属于木本科植物，营养生长期较长，本研究也只对ＰＡＬ基因的反义表达载体转化的鸭梨苗进行了证实和鉴定，并未能够对转基因植株各个生长期以及植株各个部位的ＰＡＬ基因表达情况进行系统检测和研究㊂因此，后期研究主要针对转基因鸭梨不同时期㊁不同部位的ＰＡＬ基因的表达情况的分析，尤其是果实发育期，对ＰＡＬ基因的表达及ＰＡＬ的活性进行分析，为开发鸭梨种质资源和提升果品品质提供理论依据㊂参考文献：ＣＨＥＮＧＭ，ＹＩＮＭ，ＺＯＵＨＷ，ｅｔａｌ，２０１５．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘ⁃ｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＯＭＴｇｅｎｅｉｎＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｃｖ．ＤａｎｇｓｈａｎＳｕｆｒｕｉｔ［Ｊ］．ＪＮｕｃｌＡｇｒｉｃＳｃｉ，２９（３）：４５４－４６１．［程敏，尹梅，邹鹤伟，等，２０１５．砀山酥梨果实ＣＯＭＴ基因的克隆和表达分析［Ｊ］．核农学报，２９（３）：４５４－４６１．］ＣＨＥＮＸＹ，ＭＥＮＧＹＸ，ＪＩＡＸＸ，ｅｔａｌ，２０１７．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｏｔａｔｏｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔａｎｔｉ⁃ｖｉｒｕｓｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｔｏｂａｃｃｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，３７（１）：８７－９５．［陈晓艳，孟亚雄，贾小霞，等，２０１７．四价抗马铃薯病毒植物表达载体构建及其对烟草的转化［Ｊ］．广西植物，３７（１）：９９４４期李会宣等：鸭梨ＰＡＬ基因的反义遗传转化及表达分析８７－９５．ＨＡＮＭＬ，ＬＩＵＹＬ，ＺＨＥＮＧＸＹ，ｅｔａｌ，２０１０．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｇｅｎｅｔｉｃｌｉｎｋａｇｅｍａｐａｎｄＱＴＬａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｓｏｍｅｆｒｕｉｔｔｒａｉｔｓｉｎｐｅａｒ［Ｊ］．ＪＦｒｕｉｔＳｃｉ，２７（４）：４９６－５０３．［韩明丽，刘永立，郑小艳，等，２０１０．梨遗传连锁图谱的构建及部分果实性状ＱＴＬ的定位［Ｊ］．果树学报，２７（４）：４９６－５０３．］ＨＵＡＮＧＪＬ，ＧＵＭ，ＬＡＩＺＢ，ｅｔａｌ，２０１０．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＰＡＬｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈ，ｄｅｖｅｌｏｐ⁃ｍｅｎｔ，ａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙ⁃ｓｉｏｌ，１５３（４）：１５２６－１５３８．ＪＩＡＮＸ，ＭＩＡＯＹＭ，ＳＵＩＹＨ，ｅｔａｌ，２０１５．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓ⁃ｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒＬＤＣａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｏｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，３５（２）：２５５－２６０．［简兴，苗永美，隋益虎，等，２０１５．黄瓜ＬＤＣ克隆㊁表达载体的构建及烟草转化研究［Ｊ］．广西植物，３５（２）：２５５－２６０．］ＫＵＭＡＲＡ，ＥＬＬＩＳＢＥ，２００１．Ｔｈｅｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｒａｓｐｂｅｒｒｙ．ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，１２７（１）：２３０－２３９．ＬＩＧＱ，ＱＩＪ，ＧＡＯＺＨ，ｅｔａｌ，２０１０．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａ⁃ｔｉｏｎｆｏｒａｎｔｉｓｅｎｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅｇｅｎｅｉｎＹａｌｉＰｅａｒ（ＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉＲｅｈｄ．）［Ｊ］．ＪＰｌａｎｔＧｅｎｅｔＲｅｓ，１１（５）：６３５－６３９．［李桂琴，齐靖，高志华，等，２０１０．鸭梨多酚氧化酶基因反义表达载体的构建及农杆菌介导的遗传转化［Ｊ］．植物遗传资源学报，１１：６３５－６３９．］ＬＩＨＸ，ＸＵＤＱ，ＱＩＪ，ｅｔａｌ，２０１４．ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｓｅｎｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｐｅｃｔｉｎｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒａｓｅｇｅｎｅａｎｄｉｔｓｔｒａｎｓｆｅｒｔｏＹａｌｉｐｅａｒ（ＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉＲｅｈｄ．）［Ｊ］．ＪＮｕｃｌＡｇｒｉｃＳｃｉ，２８（４）：５９７－６０４．［李会宣，许冬倩，齐靖，等，２０１４．鸭梨果胶甲酯酶基因反义表达载体的构建及转化［Ｊ］．核农学报，２８（４）：５９７－６０４．］ＬＩＬ，ＹＵＪＪ，ＪＩＮＱ，ｅｔａｌ，２０１１．ＰＰＯｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄａＰＰＯｃＤＮＡｃｏｌｏｎｉｎｇｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｔｏｎｅｃｅｌｌｉｎＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｃｖ．［Ｊ］．ＡｃｔａＬａｓＢｉｏｌＳｉｎ，２０（３）：３５３－３５９．［李玲，于娟娟，金青，等，２０１１．砀山酥梨石细胞发育过程中ＰＰＯ酶学特性及其ｃＤＮＡ片段克隆［Ｊ］．激光生物学报，２０（３）：３５３－３５９．］ＬＩＷＨ，ＦＥＮＧＪＲ，ＴＡＮＧＺＨ，ｅｔａｌ，２０１７．ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｏｌｉｄｓｔｏｎｅｃｅｌｌｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＯＤ４ｇｅｎｅｉｎＫｏｒｌａｆｒａｇｒａｎｔｐｅａｒ［Ｊ］．ＸｉｎｊｉａｎｇＡｇｒｉｃＳｃｉ，５４（１）：６０－６５．［李文慧，冯建荣，唐章虎，等，２０１７．库尔勒香梨成熟果实石细胞含量与ＰＯＤ４基因表达量的相关性分析［Ｊ］．新疆农业科学，５４（１）：６０－６５．］ＬＩＵＹ，ＬＵＸＹ，ＨＵＡＮＧＸＤ，ｅｔａｌ，２０１１．Ｓｔｕｄｙｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｍｏｎｇｓｔｏｎｅｃｅｌｌｃｏｎｔｅｎｔ，ＰＡＬａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｆｒｕｉｔｈａｒｄｎｅｓｓ［Ｊ］．ＸｉｎｊｉａｎｇＡｇｒｉｃＳｃｉ，４８（９）：１５９７－１６０１．［刘艳，鲁晓燕，黄学东，等，２０１１．梨石细胞含量与ＰＡＬ活性和果实硬度的相关性研究［Ｊ］．新疆农业科学，４８（９）：１５９７－１６０１．］ＬＩＵＺＨ，ＺＨＡＮＧＹＸ，ＳＨＥＮＬＹ，ｅｔａｌ，２０１１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏ⁃ｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａ⁃ｌｙａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＹａｌｉ［Ｃ］．ＲｅｓＤｅｖＰｅａｒ（Ｆｉｖｅ）．［刘志浩，张玉星，申连英，等，２０１１．鸭梨苯丙氨酸解氨酶基因ｃＤＮＡ片断的克隆与序列分析［Ｃ］．梨科研与生产进展（五）．］ＬÜＲＨ，ＺＨＡＮＧＳＨ，ＮＩＥＪＱ，ｅｔａｌ，２０１１．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌｉｇｎｉｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｓｔｏｎｅｃｅｌｌｓａｎｄｔａｓｔｅｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓｐｅａｒ［Ｊ］．ＡｃｔａＬａｓＢｉｏｌＳｉｎ，２０（６）：７６５－７７１．［吕芮宏，张土鸿，聂敬全，等，２０１１．不同基因型梨木质素代谢对石细胞含量和果实口感的影响［Ｊ］．激光生物学报，２０（６）：７６５－７７１．］ＱＩＪ，ＤＯＮＧＺ，ＺＨＡＮＧＹＸ，２０１４．ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＡＣＣｏｘｉｄａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＹａｌｉｐｅａｒａｎｄｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｉｔｓａｎｔｉｓｅｎｓｅｅｘｐｒｅｓ⁃ｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗｉｔｈａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＤｉｖｅｒｓＲｅｓ，３６（５）：６２２－６２８．［齐靖，董祯，张玉星，２０１４．鸭梨ＡＣＣ氧化酶基因ｃＤＮＡ片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化［Ｊ］．植物分类与资源学报，３６（５）：６２２－６２８．］ＳＨＩＺＢ，ＷＡＮＧＹＺ，ＤＡＩＭＳ，ｅｔａｌ，２０１１．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｐｐｌｅｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｆｏｒｐｅａｒｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ［Ｊ］．ＪＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃＵｎｉｖ，３４（６）：３６－４０．［施泽彬，王月志，戴美松，等，２０１１．苹果基因序列在砂梨引物开发中的应用［Ｊ］．南京农业大学学报，３４（６）：３６－４０．］ＴＩＡＮＬＭ，ＣＡＯＹＦ，ＧＡＯＹ，ｅｔａｌ，２０１１．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｔｏｎｅｃｅｌｌｓｓｉｚｅａｎｄｆｌｅｓｈｔｅｘｔｕｒｅｉｎｐｅａｒｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃＳｉｎ，３８（７）：１２２５－１２３４．［田路明，曹玉芬，高源，等，２０１１．梨品种果肉石细胞团大小对果肉质地的影响［Ｊ］．园艺学报，３８（７）：１２２５－１２３４．］ＶＡＮＨＯＬＭＥＲ，ＤＳＥＭＥＤＴＢ，ＭＯＲＲＥＥＬＫ，ｅｔａｌ，２０１０．Ｌｉｇｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌ，１５３（３）：８９５－９０５．ＷＡＮＧＢ，ＺＨＡＮＧＮ，ＹＡＮＣＣ，ｅｔａｌ，２０１３．ＢａｇｇｉｎｇｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｔｏｎｅｃｅｌｌａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆＬｉｇｎｉｎｉｎＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ ＤａｎｇｓｈａｎＳｕｌｉ ［Ｊ］．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃＳｉｎ，４０（３）：５３１－５３９．［王斌，张楠，闫冲冲，等，２０１３．套袋对砀山酥梨果实石细胞发育及木质素代谢的影响［Ｊ］．园艺学报，４０（３）：５３１－５３９．］ＷＡＮＧＤＹ，ＧＡＯＦＹ，ＳＵＮＷ，ｅｔａｌ，２０１５．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓ⁃ｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｉｎｆｒｕｉｔｏｆ Ｄａｎｇｓｈａｎｓｕｌｉ ［Ｊ］．ＪＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃＵｎｉｖ，３８（１）：３３－４０．［王丹阳，高付永，孙炜，等，２０１５． 砀山酥梨 果实ＣＣｏＡＯＭＴ基因的克隆与表达分析［Ｊ］．南京农业大学学报，３８（１）：３３－４０．］ＸＵＣ，ＦＡＮＧＺＨ，ＹＡＮＧＦＭ，ｅｔａｌ，２０１５．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＦ５ＨｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｔｏｎｅｃｅｌｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎＰｙｒｕｓｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉｃｖ．ＤａｎｇｓｈａｎＳｕＦｒｕｉｔ［Ｊ］．ＡｃｔａＰｈｙｔｏｐｈｙｓｉｏｌＳｉｎ，５１（５）：７７８－７８４．［徐超，方志，杨芳梅，等，２０１５．砀山酥梨果实Ｆ５Ｈ表达与石细胞发育的分析［Ｊ］．植物生理学报，５１（５）：７７８－７８４．］ＹＡＮＨＢ，ＣＨＥＮＧＹＤ，ＨＥＪＧ，ｅｔａｌ，２０１４．ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＰＡＬｇｅｎｅｉｎ Ｙａｌｉ ｐｅａｒａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｆｒｕｉｔｄｅｖｅｌｏｐ⁃ｍｅｎｔａｎｄｗｏｕｎｄｉｎｇ［Ｊ］．ＳｃｉＡｇｒｉｃＳｉｎ，４７（２１）：４３４１－４３４８．［闫洪波，程玉豆，何近刚，等，２０１４．鸭梨ＰＡＬ克隆及其在果实发育和机械伤害过程中的表达［Ｊ］．中国农业科学，４７（２１）：４３４１－４３４８．］ＺＯＵＬＨ，ＺＨＡＮＧＹＸ，２０１２．ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｌｅｓｈｂｒｏｗｎｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎｐｈｅｎｏｌｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄａｎｄｒｅｌａｖｅｎｔｅｎｚｙｍａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｆｒｕｉｔｏｆＰｙｒｕｓｐｙｒｉｆｏｌｉａ［Ｊ］．ＪＦｒｕｉｔＳｃｉ，６：１０２２－１０２６．［邹丽红，张玉星，２０１２．砂梨果肉褐变与酚类物质及相关酶活性的相关分析［Ｊ］．果树学报，６：１０２２－１０２６．］００５广㊀西㊀植㊀物３８卷。
梨石细胞形态-概述说明以及解释
梨石细胞形态-概述说明以及解释1.引言概述部分的内容可以介绍梨石细胞形态的研究背景和重要性。
以下为文章1.1 概述的一种可能写作方式：概述随着科学技术的不断进步，对细胞形态的研究变得越来越深入。
梨石细胞作为一类特殊的细胞类型，其形态特征一直受到广泛关注。
梨石细胞是植物细胞中的一种特殊细胞，其具有独特的外形和结构，对植物的生长发育和功能发挥着重要的作用。
本文旨在系统地探讨梨石细胞的形态特征以及其在生物学中的功能和作用。
通过对梨石细胞起源和发展的研究，可以更好地理解植物细胞的发育过程和细胞形态的形成机制。
同时，深入了解梨石细胞的形态特征，有助于揭示其在植物生长和适应环境方面的重要作用。
本文的结构如下：首先，我们将简要介绍梨石细胞的起源和发展，包括其细胞分化的过程和相关的分子机制。
接着，我们将详细描述梨石细胞的形态特征，包括其外形、结构和组成成分等方面。
最后，我们将讨论梨石细胞的功能和作用，重点探讨其在植物生长发育和适应环境中的重要性。
本文的研究成果对深入了解梨石细胞形态的重要性具有重要意义。
通过探索梨石细胞形态与功能之间的关系，我们可以为植物生长发育过程中的个体变异和适应性进化提供更深入的理解。
同时，对梨石细胞形态研究的展望也将有助于拓宽我们对细胞形态多样性的认识，并为植物学领域的研究提供新的思路和方法。
总之，本文旨在对梨石细胞的形态特征进行系统研究，探讨其在生物学中的重要性。
通过深入了解梨石细胞形态的起源、发展和功能，我们可以更好地理解细胞形态的形成机制，为植物生长发育和适应环境提供理论和实践的依据。
同时，本文的研究成果还将为细胞形态研究的展望提供新的思路和方向。
1.2文章结构1.2 文章结构:本文主要包括引言、正文和结论三个部分。
下面将详细介绍各个部分的内容和组织架构。
引言部分首先对梨石细胞形态的重要性和研究现状进行简要概述，引发读者对该主题的兴趣和思考。
接着，本部分将阐明本文的主要结构和内容，即在下一部分中将详细探讨梨石细胞的起源和发展、形态特征以及功能和作用。
梨石细胞实验报告
一、实验目的1. 观察梨石细胞在显微镜下的形态结构。
2. 掌握制作植物切片的方法。
3. 熟悉显微镜的使用技巧。
二、实验原理梨石细胞是植物体内的一种细胞类型，具有发达的细胞壁和细胞腔，常呈多边形。
在显微镜下观察梨石细胞，可以了解其形态结构和细胞壁的构造。
三、实验材料1. 梨果实2. 刀片3. 稀释液（1:1的甘油和蒸馏水混合液）4. 盖玻片5. 封片胶6. 显微镜7. 显微镜载物台8. 显微镜目镜和物镜四、实验步骤1. 将梨果实洗净，用刀片将果实切成薄片，厚度约为0.5mm。
2. 将切片放入稀释液中浸泡，以防止切片变形和干燥。
3. 取出切片，用吸水纸吸去多余的稀释液。
4. 将切片放在载玻片上，用盖玻片轻轻覆盖。
5. 将载玻片放入封片胶中，使封片胶均匀覆盖在盖玻片上。
6. 将封片好的载玻片放在显微镜载物台上，调整显微镜焦距，观察梨石细胞。
五、实验结果与分析1. 梨石细胞呈多边形，细胞壁较厚，细胞腔较大。
2. 细胞壁由纤维素、半纤维素和木质素等组成，呈多层结构。
3. 细胞腔内含有淀粉粒、油滴等物质。
六、实验讨论1. 通过本次实验，我们掌握了制作植物切片的方法，并学会了使用显微镜观察细胞。
2. 梨石细胞在显微镜下的形态结构具有明显的特征，为植物学研究提供了重要的参考依据。
3. 在实验过程中，我们注意到梨石细胞的细胞壁较厚，这可能是为了适应梨果实的生长环境和功能需求。
七、实验结论1. 成功制作了梨石细胞切片，并观察到了其形态结构和细胞壁的构造。
2. 梨石细胞在显微镜下的形态结构具有明显的特征，为植物学研究提供了重要的参考依据。
八、实验反思1. 在制作切片的过程中，应尽量保证切片的厚度均匀，以避免观察时出现误差。
2. 在观察细胞时，应注意调整显微镜焦距，以获得清晰的图像。
3. 实验过程中，应严格遵守操作规程，确保实验结果的准确性。
木质素合成与梨石细胞
摘要:从木质素的分类分布，木质素合成过程中相关酶类，木质素研究方法及木质素与梨果实石细胞形成的关系方面对木质素的研究进展作了综述介绍。
并对木质素研究方向作了展望。
关键词：木质素；苯丙氨酸解氨酶；肉桂酸脱氧酶；过氧化物酶；水杨酸The metabolic relationship between Synthesis of lignin-related enzyme and phenolicDong QianwenAbstract：Lignin,which plays an important role in pulping industry, represents 15%~36% of dry weight of wood and is amajor component second to cellulose. Lignin content and its related enzyme activity were highly correlated with plant growth，antidisease ability , adverse resistance。
The lignin in pasture also effect the ability to digest of plant-eating animals. In paper made industry，lignin dispose was the main source of environmental pollution. This article commented on the studies on the metabolic relationship between Synthesis of lignin-related enzyme such as Phenylalanine ammonia-lyase, Cinnamic acid-enzyme, Peroxidase and and phenolic such as salicylic acid .Also，the prospects for control the compound of lignin are put forward．Keywords: lignin;Phenylalanine ammonia-lyase(PAL) ; Cinnamic acid-enzyme(CAD);Peroxidase(POD); salicylic acid(SA)前言:木质素(Lignin)是维管植物进化过程中的一种结构产物之一,在细胞壁木质化过程中,逐步渗入到细胞壁,填充于纤维素构架内,加大了细胞壁的硬度,增强了细胞的机械支持力或抗压强度,促进机械组织的形成,有利于巩固和支持植物体及水分输导等作用[1]。
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摘要:从木质素的分类分布，木质素合成过程中相关酶类，木质素研究方法及木质素与梨果实石细胞形成的关系方面对木质素的研究进展作了综述介绍。
并对木质素研究方向作了展望。
关键词：木质素；苯丙氨酸解氨酶；肉桂酸脱氧酶；过氧化物酶；水杨酸The metabolic relationship between Synthesis of lignin-related enzyme and phenolicDong QianwenAbstract：Lignin,which plays an important role in pulping industry, represents 15%~36% of dry weight of wood and is amajor component second to cellulose. Lignin content and its related enzyme activity were highly correlated with plant growth，antidisease ability , adverse resistance。
The lignin in pasture also effect the ability to digest of plant-eating animals. In paper made industry，lignin dispose was the main source of environmental pollution. This article commented on the studies on the metabolic relationship between Synthesis of lignin-related enzyme such as Phenylalanine ammonia-lyase, Cinnamic acid-enzyme, Peroxidase and and phenolic such as salicylic acid .Also，the prospects for control the compound of lignin are put forward．Keywords: lignin;Phenylalanine ammonia-lyase(PAL) ; Cinnamic acid-enzyme(CAD);Peroxidase(POD); salicylic acid(SA)前言:木质素(Lignin)是维管植物进化过程中的一种结构产物之一,在细胞壁木质化过程中,逐步渗入到细胞壁,填充于纤维素构架内,加大了细胞壁的硬度,增强了细胞的机械支持力或抗压强度,促进机械组织的形成,有利于巩固和支持植物体及水分输导等作用[1]。
同时,由于木质素具不可溶性及多酚类物质的化学特性,也增强了植物的抗病能力;对用作燃料的木材来说,高木质素含量的木材能释放较多的热量[2]。
木质素是膳食纤维(Dietary fibres,D F)中的.重要组成部分，它能够改变肠道系统中微生物的活性、降低肠运转时间、降低血中胆固醇和高血糖含量、延缓营养吸收时间、降低结肠、抑制癌细胞活性，甚至具有维持适当体重的生理和治疗功效[3][4]。
但从另一角度看,木质素对人类生产实践活动产生一些负面影响,如木质素含量的牧草会影响草食动物的消化;而对造纸用木材来说,木质素是影响造纸工艺和纸张质量的主要因素之一[5]。
因此有关木质素的研究受到许多学者的关注，现仅就木质素合成相关酶、酚的代谢关系做一介绍。
1木质素1.1木质素的种类和分布木质素在木材中是仅次于纤维素的主要成份,是由三种醇单体或单木质酚如香豆醇、松柏醇和芥子醇等合成的一种复杂的酚类聚合物。
通常占木材干重的15%~36%,贮存于次生厚组织中,与植物的硬度和防水作用密切相关。
木质素不是单一的结构,而是一组相关联的苯基丙烷单元———称为木质素单体(monolignol),通过一定方式聚合一起的总称,是芳香类物质的高聚物,到目前为止尚未有任何办法能从植物中分离出完全没有变化的原木质素。
其单体主要分为:由香豆醇衍生的对苯基单体(H型)、由松柏醇衍生的愈创木基单体(G型)和由芥子醇衍生的紫丁香基单体(S型)等三类。
H型主要存在于禾本科植物中,S型主要存在于被子植物中,G型则广布于裸子植物和被子植物中。
木质素是属细胞壁的次生结构之一,主要贮存于细胞中,其结构方式和含量依不同的种类、个体、组织、细胞类型、细胞层以及环境条件而变化的,在垂直分布上木质素含量随高度的增加而逐渐降低;在径向分布上对针叶树是心材比边材少、秋材比春材少,而在阔叶树中则没有显著差异。
1.2木质素的作用木质素在土壤中降解为腐殖质，有利于改善土壤结构，提高土壤肥力，促进化学肥料的有效利用，加速植物细胞繁衍，提高植物的生命活动，进一步达到促长、增产的作用。
木质素在植物体的形态建成、抗性诱导等方面具有重要的生理功能，开展木质素合成代谢规律及其调控的研究具有十分重要的理论价值和应用意义。
木质素及其生理功能的具体应用涉及到很多方面。
利用木质素的抗性功能，可以使羟自由基、壳聚糖等诱抗剂来诱导木质素的合成，从而提高植物的抗性。
利用外源木质素对植物生长发育的作用，可以制造新型生物肥料。
利用生物工程手段生产低木质素含量的树木，可望从源头解决造纸制浆过程中的工业污染问题。
同事同时，利用纸浆中的木质素还可以生产生物肥料，变废为宝，使治理污染走上良性循环的道路（Connell等，1999[59]）。
通过对木质素代谢基因进行调控来改造物种也具有广阔的前景。
例如，在饲料生产上，可以通过转基因手段降低木质素含量，提高饲草的适口性、营养价值和利用率[49]；在木材生产上，可以通过转基因等手段来促进木质素的合成，提高木材的质量[48]；在作物育种上，可以通过木质素正调控来产生新的种质，提高抗倒伏能力[52];在果树生产上，首先开展不同矮化型果树木质素代谢规律的研究，然后通过基因工程等手段调控木质素合成来降低树高，这将为果树矮化栽培开辟新的思路。
1.3木质素的生物合成途径木质素的生物合成虽然未完全清楚,但经过多年的研究,普遍认为大致可分为3个步骤:(1)首先是植物光合作用后的同化产物到芳香氨基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等的合成过程,称为莽草酸途径。
(2)其次是从苯丙氨酸到羟基肉桂酸(HCA)及其辅酶A酯类,称为苯丙酮酸途径。
(3)最后是从羟基肉桂基辅酶A酯类到合成木质素单体及其聚合物的过程,称为木质素合成的特异途径。
其中起主要作用和研究重点大都放在苯丙氨酸途径和木质素合成特异途径这两个阶段。
在木质素合成的过程中有很多的酶参与作用,参与第二阶段的苯丙氨酸途径中有:苯丙氨酸基裂解酶(PAL)、肉桂酸4-羟基裂解酶(C4H)、香豆酸3-羟化酶(C3H)、香豆醇辅酶A-3-羟化酶(CCoA3H)、咖啡酸5-羟化基阿魏酸0-甲基转移酶(COMT)、咖啡醇辅酶A-0-甲基转移酶(CCoAOMT)、阿魏酸5-羟化酶(F5H)和4-香豆基辅酶A裂解酶等等。
参与第三阶段的木质素单体合成特异途径的酶主要有:香豆醇辅酶A降解酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)两种,但在多途径中还发现了松柏醛5-羟基降解酶(CAld5H)和松柏醛甲基转移酶(AldOMT)等。
最后,在过氧化物酶(peroxi-dase)和漆酶(Laccase)等的催化下,各种木质单体聚合成为木质素。
木质素单体的合成过程是在细胞质中完成的,然后转移到细胞壁中进行脱氢聚合形成木质素。
2 木质素合成相关酶和酚的代谢关系2.1 木质素合成相关酶的代谢关系木质素单体合成是经过苯丙酸途径开始进行的，首先由葡萄糖发生芳环化反应而形成莽草酸[6]，然后经过一系列经基化、甲基化与还原反应，生成三种基本结构。
整个过程涉及到许多酶系[7]十分复杂。
至今仍未明确其准确的合成途径，但它给我们指明了酶的活性与木质素前体浓度的关系，证明一些酶系控制着木质素含量变化。
１根据大量资料和木质素的合成途径来看，苯丙氨酸解氨酶(PAL )，肉桂酸脱氧酶(CAD)，过氧化物酶(POD) 三种酶是木质素合成途径中的关键酶类。
其中PAL处于苯丙烷类代谢的起点，与类黄酮物质、黄酮、色素、木质素的合成有关。
Taylor等[8]利用白日菊叶肉细胞诱导出不同分化类型的细胞管状分子。
在诱导过程中，细胞壁上伴随有木质化的发生，同时对木质化形成相关的酶类进行了测定。
PAL伴随细胞木质化活性有增强趋势。
而CAD 和POD是木质素单体形成过程中的酶，它们的活性变化更能体现木质素代谢的活动情况，进而说明与之相关的导管分化和抵御病害的防御机制。
2.1.1苯丙氨酸解氨酶PAL催化L-苯丙氨酸直接脱氨产生反式肉桂酸，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶[9]。
此酶自1961年Koukol和Conn发现以来己在所有研究的绿色植物中找到[10、11、12、13、14、15]，在真菌、细菌、藻类中也有发现。
细胞中此酶定位于线粒体、白色体、叶绿体、过氧化酶体、乙醛体等细胞器中。
植物的不同组织和不同部位PAL的分布也不同，在萌发5天的黄化水稻幼苗中，幼叶活性最高，其次为根和胚轴，胚芽鞘的活性很低，而胚乳中未检测到。
丛斌(1997)等[16]在小麦根尖分生区无法检测到PAL的活性。
PAL活性随叶片的成熟度的增加而降低，越嫩的部位PAL活性越高 [17]。
尹德明等[18]研究水稻感染小球菌核病后，PAL 呈现先上升后下降的趋势，发现植物的抗病性与木质素形成有关。
Kchrel和Wiermanl[19]应用免疫化学定位法在郁金香花药中PAL主要位于花药绒毡层细胞中。
通过硫酸钱分级沉淀、DEAF-纤维素层析、亲和层析等分离纯化步骤，PAL己在马铃薯、玉米、芥菜、小黄瓜等f一儿种高等植物中得到纯化，并系统地研究了其基本性质。
PAL 的酶蛋白为分子量220000-330000道尔顿的酸性蛋白，其全酶由四个相同亚基组成四聚体[20]。
PAL的最适PH为8-9.5，水稻PAL最适PH偏碱，这和氨基酸成分一致。
Butland等[21]发现班克松(P banksiana Lamb. ) PAL基因的多个成员(PALL-5) 。
Fukuda等[22]用分离的百日草(Zimnia elegans)叶肉单细胞研究了苯丙烷类代谢酶系与木质素形成、管状分子形成和细胞分化的关系。
管状分子与薄壁细胞的区别在于木质化次生壁的加厚，木质素是次生壁结构材料之一，是木质细胞特有的组成，因此木质化作用可以作为管状分子分化的指标。
朱海英(1997)等 [23]在丝瓜果实发育期间，发现PAL的活性高峰出现在木质素大量合成的第5天。