地中海贫血的诊断方法

地中海贫血的诊断方法 Revised by Liu Jing on January 12, 2021
地中海贫血的诊断方法
B-地中海贫血的筛查和诊断主要依赖实验室检查，方法主要有：
1 血常规检测
地中海贫血的重要特征之一是小细胞低色素性贫血，如MCV≤80 fl，MCH≤25．0 Pg，则可疑为地中海贫血患者或基因携带者，可同时测定血清铁和铁蛋白，以排除缺铁性贫血。

2 红细胞渗透脆性试验(一管法)
其原理是地中海贫血红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩展，膜与内容物之比增大，对渗透溶解的抗性增加，在0．32％(或0．36％)NaC1中溶解度降低(脆性降低)。

一管法可用于地中海贫血群体筛查。

3 血红蛋白(Hb)电泳Hb电泳
是检测地中海贫血、异常血红蛋白最常用的方法，可观察到HbE、HbH等异常血红蛋白区带，同时可定量检测HbF、HbA2的含量并区分常见类型的地中海贫血。

有研究显示MCV、Hb电泳和红细胞脆性实验三者联合检测的灵敏度可达100％，阴性预告值达100％，联合特异度可达100％，阳性预告值达100％DS。

4 高效液相色谱技术(HPLC)
原理：采用微柱法离子交换层析和梯度洗脱技术，全自动分析仪可分离血红蛋白的变异体与亚型，容易发现重型和轻型B地中海贫血。

在操作上，HPLC采用的是全血标本，不需要制备Hb液，只要将全血标本直接放在仪器上，通过电脑操作便能实现HbA、HbA2、HbF等定量检测。

优点：所需样本量少，自动化程度高，操作简单，快速，能消除人为误差，结果准确。

HPLC也可用于胎儿脐带血的产前
诊断，可诊断出重型B地中海贫血，但不能区分正常胎儿和杂合子胎儿。

近年来，地中海贫血高发地区也采用此法进行携带者检测。

5 基因诊断
近年来，随着分子生物学研究领域的不断发展，从最初的B珠蛋白基因簇限制性酶切多态性检测至目前的聚合酶链反应(PCR)技术结合其他分子生物学方法，B 地中海贫血的诊断已逐步改进和完善。

基因诊断方法有下列几种：
5．1 限制性片段长度多态性连锁分析(RFLP连锁分析) 原理：DNA限制性内切酶可识别并切割DNA上特定的核苷酸序列，得到一定长度的DNA片段，而碱基的突变可导致酶切位点的丢失或形成，从而改变酶切片段的大小。

突变基因在经过相应的限制性内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可判断出突变是否存在。

缺点：由于单独使用该方法，不能直接测出受试者突变基因的类型，必须结合寡核苷酸探针等技术，故其应用范围有一定限制，且操作繁琐。

如果母亲或父亲在所有的多态性位点上都为纯合子，无法用此方法进行产前诊断，或者患儿和父母所有位点上都是杂合状态，只能进行50％的排除性诊断。

5．2 探针斑点杂交技术(allele—specific oligonucleotide ASO)应用引物扩增珠蛋白基因，同时合成与正常序列和突变序列完全互补的寡核苷酸探针。

将PCR扩增产物点在尼龙膜上，分别与标记的正常和突变的ASO探针杂交，不完全互补的探针，在一定条件下可以完全洗脱，再从放射自显影观察杂交结果。

如果两个等位B珠蛋白基因正常，仅与正常探针杂交，反之，均带有突变时，则仅与突变探针杂交。

这种检测方法快速、灵敏。

缺点：对DNA的纯度和数量要求较高，一次杂交能检测一种突变，对于具有高度异质性的B地中海贫血往往需要多次
更换探针杂交，才能确定诊断，如使用同位素标记探针，还存在放射性污染等问题。

5．3 反向点杂交方法(Reverse dot blot hybridization，RDB) 与传统等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交的基本原理相同，所不同的是：将膜上固定探针取代固定靶DNA，经一次杂交就可对未知样品中多个突变进行检测，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的方式。

优点：较快速、敏感，操作简单。

缺点：只能检测已知位点突变的B地中海贫血，不能检出未知突变。

5．4 缺口PCR(gap PCR) 原理：设计三个或两对引物，即在缺失区域外侧，靠近缺失位点的位置设计一对引物，另外一个或一对引物在缺失区域内。

在缺失区域内的引物能够在杂合子和正常人中扩增出片段，在缺失纯合子中不能扩增。

在缺失区域外侧的一对引物，因为缺失使相距甚远的两端DNA拉进，从而可扩增出特定的DNA片断。

从而检测出纯合子患者，杂合子携带者。

Wang等报道用此方法对89个B珠蛋白基因突变的检测。

5．5 扩增不应突变系统(amplification refractorymutation sys—tems，ARMS)或称等位基因特异性PCR 原理：在PCR中，针对某个点突变设计出3端碱基与目的基因的突变碱基互补的引物，PCR反应中，只有突变的基因才有相应的扩增产物，而正常的基因则不能扩增。

从而将正常与突变的DNA区别开来。

优点：仅需微量的DNA样品(100～400 ng)，通过简单的设计，仅需同一种PCR循环体系便可同时探测常见B珠蛋白基因突变，无需PCR之后的分子杂交等过程，不需限制性内切酶及放射性核素。

缺点：特异性较低，易出现假阳性或假阴性。

有报道应用该方法进行B地中海贫血的检测。

5．6 实时荧光定量PCR(real—time PCR) 在实验过程的PCR体系中加入荧光集团，由于被测产物的数量与起始模板拷贝数直接相关，具体可以通过特定的
定量PCR仪监测每次循环产生的荧光信号强度，并参照对照基因的标准曲线来定量，荧光染料能与所有的DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制。

缺点：由于选取的相对定量和标准曲线本身存在局限性，所得结果存在误差。

国内外有报道采用该方法进行B地中海贫血的检测。

5．7 单链构向多态性PCR(PCR—SSCP) 与PCR联合应用，即PCR．SSCP是一种基于单链DNA构象差别来检测未知点突变的常用方法。

原理：PCR产物在加热或变性剂下生成单链，单个核苷酸的改变即可造成DNA片断单链的改变。

根据构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)条件下电泳表现不同的迁移率，电泳带用银染法显示，无放射性核素污染。

可用于检测B地中海贫血基因缺失的病人及携带者，是一种筛查未知点突变的有效方法。

缺点：当PCR产物小于200 bp．可检出70％～90％的突变率，敏感度随PCR的长度
5．8 等位基因特异性扩增技术(Allele Specific PCR，AS—PCR) 原理：针对B地中海贫血的突变类型设计特异碱基引物，根据扩增得到的电泳带判断是否存在对应的点突变，结果清晰、准确可靠，尤适用于小片段DNA分析，可作为快速检测携带者的筛查手段。

5．9 DNA芯片技术(DNA chip) 以反向斑点杂交为基本原理。

将预先设计好的大量核酸探针有序、高密度地显微打印在玻璃片、硅片等固体支持物上，制成DNA微阵列。

用荧光标记的待测样品DNA、eDNA或RNA与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，用特制的软件对荧光信号进行分析处理，便可得到待测样品的遗传信息或表达信息。

优点：高通量，基因诊断可在一张芯片上完成，适用于大面积的筛查。

缺点：设备要求及费用较高，目前难以推广。

5．10 DNA序列测定法(DNA sequencing) 常用于分析基因的未知或已知突变。

应用PCR扩增产物在DNA自动测序仪上进行序列分析。

该法快速、简便、灵敏，重复性好，是基因突变检测的最直接、最准确的方法。

5．11 荧光聚合酶链反应(Fluorescent PCR) 荧光PCR是近年发展起来的新兴技术，它比普通的PCR敏感性高出一千倍以上。

用不同颜色的荧光素对PCR扩增产物进行标记，在DNA测序仪上同时检测出不同颜色、不同片段的PCR扩增产物，从而分辨正常人，杂合子和纯合子。

国外已有报道利用荧光PCR检测B珠蛋白基因簇大片段缺失。

而国内应用荧光PCR进行地中海贫血植入前遗传学诊断，胎儿羊水和脐带血地中海产前基因诊断，及检测单单细胞B地中海贫血基因。