限制性内切酶和引物
反向pcr原理
反向pcr原理反向PCR（Reverse PCR）是一种常用的PCR技术，用于在DNA序列未知的情况下，扩增目标DNA片段的两端序列。
它通过反向延伸的方式，从目标序列的内部区域扩增出未知序列的两端，以便进一步的克隆和分析。
本文将介绍反向PCR的原理、方法和应用。
一、原理反向PCR的原理基于PCR技术，但与常规PCR有所不同。
常规PCR是通过设计引物扩增已知序列的DNA片段，而反向PCR则是通过设计引物扩增未知序列的两端。
其基本步骤包括DNA片段的限制性内切酶切割、反向连接、PCR扩增和测序分析。
目标DNA片段被限制性内切酶切割生成两个互补的末端。
然后，这些末端通过反向连接，形成一个环状的DNA分子。
接下来，使用引物对环状DNA进行PCR扩增，以得到目标DNA片段的两端序列。
最后，通过测序分析，可以确定目标DNA片段的未知序列。
二、方法反向PCR的方法包括样品处理、引物设计、PCR扩增和测序分析。
样品处理：从待扩增的DNA样品中提取DNA，并进行限制性内切酶切割。
酶切割产生的DNA片段应具有一定的长度，以便进行反向连接。
引物设计：设计两对引物，分别位于目标DNA片段的内部和外部。
内部引物用于反向连接后的PCR扩增，外部引物用于验证扩增产物的特异性。
PCR扩增：将反向连接后的DNA作为模板，使用内部引物进行PCR 扩增。
PCR条件根据具体实验需求进行优化。
测序分析：对PCR扩增产物进行测序分析，以确定目标DNA片段的未知序列。
三、应用反向PCR在生物学研究中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.基因组测序：反向PCR可用于扩增未知序列的两端，以便进行全基因组测序或特定基因的测序。
2.基因克隆：通过反向PCR扩增未知序列的两端，可以获得目标基因的完整序列，从而进行基因克隆和功能研究。
3.基因突变分析：反向PCR可以用于检测基因的突变位点，并进一步研究突变对基因功能的影响。
4.基因组重排检测：反向PCR可用于检测基因组的重排事件，如基因重排、染色体倒位等。
简析限制性内切酶
简析限制性内切酶限制性内切酶（即限制酶）是基因工程中的必用操作工具之一。
基因工程是近年来高考中的热点，而对于限制酶的考查也是历年高考题中的常考知识点。
1限制酶的作用及影响因素1.1 作用：切割特定的核苷酸序列[高考赏析]（2008，全国I）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。
现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）A.3B.4C.9D. 12【答案】C【解析】：每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。
若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的DNA片段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的DNA片段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的DNA片段。
因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的DNA分子。
1.2 作用结果：形成DNA片段末端黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。
平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。
[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。
以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。
请根据以下图表回答下列问题。
（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。
（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。
表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。
请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。
（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？。
常见限制性内切酶识别序列
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioer Hits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。
常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.酶类型识别序列ApaIType II restrictionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restrictionenzyme5' G^GATCC 3'BglIIType II restrictionenzyme5' A^GATCT 3'EcoRIType II restrictionenzyme5' G^AATTC 3'HindIIIType II restrictionenzyme5' A^AGCTT 3'KpnIType II restrictionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restrictionenzyme5' C^CATGG 3'NdeIType II restrictionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restrictionenzyme5' G^CTAGC 3'NotIType II restrictionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restrictionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restrictionenzyme5' G^TCGAC 3'SphIType II restrictionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restrictionenzyme5' T^CTAGA 3'XhoIType II restrictionenzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PCR引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
基因工程复习(含答案)
基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。
转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。
转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。
逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
引物设计原则及酶切位点选择和设计
引物设计原则及酶切位点选择和设计[整理]：最初的时候，由于害怕设计酶切位点最后且不开，所以经常采用最通用的方法，用T载体克隆解决问题，但后来发现她也有问题，就是浓度提不上去，你需要体大量的载体来酶切，所以感到还是直接扩增好一点。
但这就需要你仔细设计引物。
连入质粒中的重要目的就是进行酶切和连接，当然首先就是在想要合成或者是进行PCR扩增出靶基因的时候在核酸的两端接入酶切位点，酶切位点是与你的质粒的特点相关的，可以在质粒的图谱说明书上找取相应的位点，进行设计。
（一）设计引物前应做的准备工作：准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）设计引物所要考虑的问题两个位点应是载体上的，，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，往往导致两个酶都切不好。
因此，紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点。
我看promega的说明书上说，最好隔四个。
还有一种情况是：不能有碱基的交叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。
两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切。
最好使用酶切效率高的。
最好使用双酶切有共同buffer的酶。
最好使用较常用的酶（如hind3，bamh1，ecor1等），最好使用自己实验室有的酶，这样可以省钱。
Tm的计算，关于Tm的问题，很多的战友都有疑惑。
其实园子里有很多的解释了。
Tm叫溶解温度（melting temperature, Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
实验五 DNA的限制性内切酶酶切反应(定稿)
实验五DNA的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程。
二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'…G AATTC…3' ；3'…CTTAA↑G …5' →3'…CTTAA G…5' 。
Pvu I 的识别序列5'…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3' →5'…ＣＧＡＴＣＧ…3'三、实验仪器与设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统四、实验材料与试剂pUC18质粒：2686bp，0.5μg/μl，40μl/管（日本东洋纺织株式会社） Pvu I 酶及其酶切缓冲液：10U/μl，200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在pUC18质粒上有两个酶切位点，分别为酶切第一个碱基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为1X）琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭：5×TBE 电泳缓冲液：（使用时稀释10倍）6×电泳载样缓冲液：五、实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入pUC18质粒2μl（1μg）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水15μl（使总体积为19μl）, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机2000rpm数秒,使溶液集中在管底。
引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点是一种在分子生物学实验中常用的技术，用于引导限制性内切酶切割特定的DNA序列。
其原理如下：
1. 设计引物：首先，根据需要切割的DNA序列，设计两个引物。
这两个引物通常位于目标序列的两端，其序列会与目标序列的末端互补配对。
引物的设计要求尽可能准确，以确保引物与目标序列的互补配对能够稳定形成。
2. 引物结合：将设计好的引物与待切割的DNA序列加热至高温，使其双链DNA解链。
随后，将体系温度降低，使引物与DNA序列的互补链能够重新结合。
3. 添加限制性内切酶：在引物结合的体系中添加限制性内切酶。
限制性内切酶是一类能够识别并切割特定DNA序列的酶。
它
们通常与特定的核酸序列互作，并在该序列特定的位置引发剪切作用。
4. 酶切：限制性内切酶与DNA序列中的酶切位点结合，以酶
切作用切割DNA链。
由于引物结合形成的DNA序列中引入
了酶切位点，因此限制性内切酶能够在这些位点上发挥作用，导致DNA序列在酶切位点处断裂。
5. 分析：酶切作用后，可通过各种分析方法来检测DNA序列
的切割情况。
常见的方法包括琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应（PCR）、或者直接观察DNA条带的可见性。
总结起来，在引物加酶切位点的方法中，引物的设计与酶切位点的结合是关键步骤。
通过合理设计引物，并选择适合的限制性内切酶，可以实现精确的DNA序列切割。
这对于分子生物
学研究、基因工程、或者遗传性疾病诊断等领域具有重要意义。
基因克隆与表达的研究方法
基因克隆与表达的研究方法基因克隆和表达是生命科学中重要的研究方法，它们在基因工程、药物研发、癌症治疗等领域发挥着重要作用。
在克隆和表达一个基因之前，需要先建立一个可重复的实验方法，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍基因克隆和表达的一些通用方法和技术。
1. PCR扩增PCR扩增是一种常用的克隆方法，它可以在短时间内高效地扩增DNA序列。
这种方法需要一对引物，在PCR反应中引物定向扩增目标序列。
PCR反应需要一个DNA模板、引物和聚合酶，在合适的反应条件和温度下进行。
PCR扩增后的产物可以纯化、酶切、克隆到表达载体上。
2. 限制性内切酶消化限制性内切酶消化是一种分子生物学技术，可以将DNA分子切成不同的长度，并生成暴露的粘性末端。
这样的末端可以与其他的DNA分子的互补末端连接起来，从而实现DNA的克隆。
在DNA克隆中，选择合适的限制性内切酶可以实现目标DNA序列的克隆。
3. 匀浆凝胶电泳匀浆凝胶电泳是一种检测DNA大小的技术，它可以用于确认PCR扩增产物的大小，鉴定DNA克隆的有效性以及纯化DNA等。
在匀浆凝胶电泳中，DNA样品被负载到凝胶上，并在电场作用下迁移。
根据DNA分子大小的不同，可以通过在凝胶上形成特定的DNA带和条带，从而检测DNA分子的大小。
4. 蛋白表达的研究方法蛋白表达是生命科学研究中重要的实验方法，可以获得对生命过程和重要分子的深入了解。
在蛋白表达中，需要克隆一个给定的基因到一个特定的表达载体上。
表达载体中包含能够转录和翻译蛋白质所需的所有元件。
在表达系统中，可以使用细胞培养、原核生物、真核生物等不同的宿主来表达蛋白。
5. 功能分析的研究方法在获得基因克隆和表达蛋白之后，需要通过功能分析进一步了解目标基因和蛋白的生物学功能。
在功能分析中，常用的方法包括基因敲除、蛋白互作、基因组学、蛋白质修饰等。
通过这些方法，可以深入研究生物学体系的信号传导、调节机制、发育和疾病机制等问题。
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法
限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。
酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。
不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。
可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。
杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。
确认酶切效果不好，做标记，更换] 。
【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。
并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。
当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。
b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。
这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。
因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。
偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。
c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。
有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。
个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略一、实验原理：1.首先，将待连接的两个DNA片段通过限制性内切酶酶切，产生两个具有互补末端的DNA片段。
2.再利用DNA连接酶，以这些互补末端为引导，将两个DNA片段连接在一起。
3.最后，通过热激励反应，将连接酶不活性化。
二、实验步骤：1.设计引物：根据待连接的两个DNA片段的序列，设计合适的引物，使得限制性内切酶切割后的末端具有互补性。
2.DNA酶切：将待连接的两个DNA片段与限制性内切酶一同反应，根据内切酶的适宜反应条件进行酶切反应。
3.酶切产物纯化：将酶切产物进行电泳分离，通过切胶取带的方式将目标片段分离出来，然后进行片段纯化。
4.连接反应：将纯化后的两个DNA片段与DNA连接酶一同反应，根据连接酶的适宜条件进行连接反应。
一般而言，反应体系中还需要包含ATP供能和缓冲液等。
5.连接产物纯化：对连接反应的产物进行纯化，一般选择柱层析法（如凝胶过滤法、离心柱法等）或酸酶消化法（如酚氯仿法）等方法。
6.验证连接效果：通过DNA测序等方法验证连接效果，确保连接成功。
三、实验注意事项：1.引物设计要合理：引物的设计要充分考虑到限制性内切酶的切割位点和连接效率。
合理选择引物长度和碱基组成，避免引物之间产生非特异性连接。
2.内切酶酶切条件的选择：根据所使用的内切酶的反应条件和切割位点，合理选择反应温度和反应时间，确保内切酶可以有效切割DNA片段。
3.DNA连接酶的选择和反应条件：根据实验需要，选择合适的DNA连接酶，考虑到连接效率和连接酶的活性等因素。
同时需要注意反应缓冲液的pH和温度等条件。
4.连接产物纯化：选择合适的纯化方法，确保连接产物的纯度和浓度。
同时注意纯化过程中的温度和pH等条件，避免产物降解或损失。
5.连接效果的验证：通过DNA测序方法验证连接效果，并且需要对连接的序列进行分析，确保连接正确。
四、实验应用：1.基因克隆：用于将外源基因克隆到载体上，以便于大规模扩增和表达。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶切位点是指酶在DNA或RNA分子中特定的位置识别并切割的区域。
在分子生物学研究中，酶切位点的保护碱基是进行引物设计的重要参考依据之一、本文将介绍各种酶切位点的保护碱基以及在引物设计中的应用。
1.核酸酶A切割位点保护碱基核酸酶A（RNase A）是一种特定的核酸酶，能够将单链RNA切割为5'-磷酸核酸和3'-核磷酸。
核酸酶A识别和切割位点的保护碱基主要为对尿嘧啶核苷酸（Uridine，U）和鸟嘌呤核苷酸（Adenine，A）。
具体来说，核酸酶A主要作用于RNA链上U和A的周围碱基，特别是位于U或A的下一个碱基。
在引物设计中，需要考虑核酸酶A切割位点的保护碱基，以避免产生无法预测的酶切割产物。
特别是在设计RNA引物时，需要避免在酶切位点附近出现U和A的保护碱基。
2.核酸酶T1切割位点保护碱基核酸酶T1（RNase T1）是一种特定的核酸酶，能够识别并切割由磷酸鸟苷（Guanosine，G）形成的RNA链。
核酸酶T1在RNA链上识别和切割位点的保护碱基为G。
具体来说，核酸酶T1主要作用于G的下一个碱基。
在引物设计中，需要考虑核酸酶T1切割位点的保护碱基，以避免产生无法预测的酶切割产物。
特别是在设计RNA引物时，需要避免在酶切位点附近出现G的保护碱基。
3.限制性内切酶切割位点保护碱基限制性内切酶是一类广泛应用于DNA分子生物学研究的酶，其识别和切割DNA分子中的特定序列。
限制性内切酶识别和切割位点的保护碱基由酶自身的特异性决定。
每一种限制性内切酶都有其特定的酶切位点保护碱基要求。
一般来说，酶切位点的保护碱基主要存在于酶切位点的上下游碱基中。
在引物设计中，需要考虑限制性内切酶切割位点的保护碱基，以避免引物和酶切位点之间存在相互作用而导致切割不完全或无法切割的情况。
总而言之，在引物设计中，需要考虑各种酶切位点的保护碱基，以提高引物的特异性和稳定性。
根据不同酶的切割特点和要求，设计合适的引物序列可以避免酶切位点的保护碱基产生干扰，保证实验结果的准确性。
引物加酶切位点的原理
引物加酶切位点的原理引物加酶切位点是分子生物学实验中常用的技术手段，它的原理是利用引物与DNA序列的互补配对特性，结合酶切位点的特异性切割作用，实现对目标DNA序列的选择性扩增和切割。
这项技术在基因克隆、PCR扩增、基因组编辑等领域有着广泛的应用，下面将详细介绍引物加酶切位点的原理。
首先，引物是DNA序列的部分互补片段，通常由20-30个碱基组成。
在引物加酶切位点技术中，引物的设计是非常关键的，它需要与目标DNA序列的两端互补配对，以确保在PCR扩增或酶切反应中能够特异性地结合目标DNA。
引物的选择要考虑到引物的长度、GC含量、Tm值等因素，以确保引物与目标DNA的特异性结合和扩增。
其次，酶切位点是DNA序列中特定的核苷酸序列，它是许多限制性内切酶识别并切割的靶点。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶，它们的作用使得DNA分子在特定的酶切位点处产生特定的切割。
在引物加酶切位点技术中，选择合适的限制性内切酶和其对应的酶切位点是非常重要的，它决定了对目标DNA序列的特异性切割。
引物加酶切位点技术的原理是将引物与目标DNA序列特异性地结合，然后利用PCR扩增或酶切反应对目标DNA进行扩增或切割。
在PCR扩增中，引物与目标DNA序列互补配对后，通过DNA聚合酶的作用，将目标DNA序列进行扩增，从而得到大量的目标DNA。
而在酶切反应中，引物与目标DNA序列互补配对后，加入相应的限制性内切酶，使其在特定的酶切位点处切割DNA链，从而实现对目标DNA的特异性切割。
总之，引物加酶切位点技术是利用引物与DNA序列的互补配对特性，结合酶切位点的特异性切割作用，实现对目标DNA序列的选择性扩增和切割。
它在分子生物学实验中有着广泛的应用，为基因克隆、PCR扩增、基因组编辑等领域的研究提供了重要的技术支持。
引物加酶切位点技术的原理清晰，操作简便，是分子生物学研究中不可或缺的重要技术手段。
限制性内切酶的一般原则和建议
限制性内切酶的一般原则和建议1．如何做酶切反应？该问题看似什么简单：DNA中加上酶，然后保温一段时间就可以了。
但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。
问题在什么地方？能系列生产限制性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。
这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。
您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。
下面几点对你的酶切是有帮助的。
1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。
DNA样品中不能含有有机溶剂（会使酶变性或产生星号货性），不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA 浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。
2) 选用合适的酶。
根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。
3) 正确使用和保存酶。
酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。
运输和临时存放时需要将酶至于冰上。
手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。
用完后需要及时送回原处。
注意：酶通常是最后加。
所有4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定10-20ul就可以了。
5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。
浓度过低，也会影响酶活性。
6)注意模板用量和反应体积的关系。
对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。
7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。
一般不能使用振荡器混匀。
8) 反应温度的选择。
一般反应都用37度，但是Sma I 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。
部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。
限制性内切酶和引物
引物设计软件
• Primer Premier 5.0
• Oligo • primer 3 • The Primer Generator • NetPrimer
Primer Premier 5.0使用介绍sequence Load
Preimer Premier 启动界面
子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好
不与密码子第三个碱基配对。
引物5’端
• 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基， 在5’端引入一段非模板依赖性序列。
– 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 – 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 物中引入该位点的点突变以作研究。 – 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生 物素、地高辛等）。
7、同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。 这些酶统称为同尾酶。这些酶切割 DNA 得到的产 物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同 的。通过表 4-3 很容易判断哪些酶可产生相同的 DNA 末端。
· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY · SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA · BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG · ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）
四、III类限制修饰酶
（1）亚基R，MS亚基组成。MS亚基具有识别和甲基 化修饰双重作用. （2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。
（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 MboII 识别 5’-AAGA- 3’ 切割位点 5’-GAAGANNNNNNNN/N-3’ 3’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’
pcr-pira原理
pcr-pira原理PCR-PIRA原理引言:PCR-PIRA（Polymerase Chain Reaction with Primer-Induced Restriction Analysis）是一种常用的分子生物学技术，它结合了PCR和限制性内切酶切割的原理，用于检测、鉴定和分析DNA序列。
PCR-PIRA技术具有高度的灵敏度和特异性，广泛应用于基因突变检测、病原微生物鉴定、DNA指纹图谱构建等领域。
一、PCR原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外扩增DNA的方法，通过反复进行DNA的变性、引物结合和DNA合成三个步骤，使目标DNA序列得以放大。
PCR反应体系包括目标DNA 模板、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液等重要组分。
PCR反应主要由三个步骤组成：变性、退火和扩增。
在变性步骤中，PCR反应体系被加热至94-98°C，使DNA两链解开，形成单链模板。
在退火步骤中，反应体系降温至目标引物的退火温度，引物与目标DNA特异性结合。
在扩增步骤中，反应体系升温至聚合酶最适温度，聚合酶沿引物向5'→3'方向合成新的DNA链。
二、PIRA原理限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并切割DNA的酶。
PCR-PIRA技术利用引物引导PCR扩增得到特定DNA片段，然后使用限制性内切酶切割PCR产物，生成特定长度的DNA片段。
限制性内切酶的选择需要考虑PCR产物的大小和限制酶切位点的特异性。
通常情况下，PCR产物的大小在100-1000 bp之间，限制酶切位点应该位于PCR产物的内部，并且PCR产物与限制酶的切割位点之间应该有足够的距离。
通过PCR-PIRA技术，可以根据限制酶切割产物的大小差异，对不同的样品进行鉴定和分析。
三、PCR-PIRA原理PCR-PIRA技术结合了PCR和限制性内切酶切割的原理，通过扩增特定DNA片段并使用限制性内切酶切割产物，实现对DNA序列的检测和分析。
⑤酶切位点分析及引物设计
⑤酶切位点分析及引物设计酶切位点分析及引物设计是分子生物学中常用的技术手段，用于确定DNA序列中特定的酶切位点，以及设计引物来扩增目标序列。
本文将从酶切位点分析的原理、方法和应用，以及引物设计的原则和方法等方面进行介绍。
一、酶切位点分析的原理和方法酶切位点是指DNA分子中特定的序列，该序列能够被特定酶切割成两个或多个片段。
酶切位点分析的原理是将待分析的DNA序列与特定酶的识别序列进行比对，发现匹配的序列，则认定这里可能存在酶切位点。
常用的酶切酶有限制性内切酶和特异性内切酶。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在特定位置切割DNA分子的酶，其切割位点是特异性的；特异性内切酶则是能够在DNA序列中找到特定的序列并切割的酶。
酶切位点分析的方法包括PCR-RFLP法、Southern blotting法和测序法等。
PCR-RFLP法是通过PCR扩增DNA片段，然后用特定酶切割PCR产物，并通过凝胶电泳分析切割后的片段大小来确定酶切位点；Southern blotting法则是将DNA分子进行电泳分离，然后经过膜转移，用酶切破坏特定序列，并通过探针的杂交来确定酶切位点；测序法则是通过直接测序DNA序列，发现具有酶切位点的序列。
二、引物设计的原则和方法引物是用于扩增目标DNA序列的短链DNA片段，通常由两个互补的引物组成，分别位于目标序列的两个末端。
引物设计的原则是要确保引物与目标序列的互补度高、无二次结构、无引物间的互相结合等。
引物设计的方法主要有基本方法和计算机辅助方法。
基本方法是根据特定的DNA序列设计引物，考虑引物长度、GC含量以及互补性等因素；计算机辅助方法则是利用计算机软件根据序列的特征自动设计引物。
常用的引物设计软件有Primer3、OligoAnalyzer等，这些软件可以根据用户设定的参数，自动生成合适的引物。
引物设计的时候需要考虑引物的长度、GC含量、互补度、Tm值、引物间的互补性等参数，以确保引物能够特异性地结合到目标序列上，并且能够在PCR反应中起到良好的扩增效果。
几种PCR技术的介绍
热启动PCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。
尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。
因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。
这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。
在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。
这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。
包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。
其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。
在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。
象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效。
Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。
此酶在常温下活性被封闭，要在94℃－95℃下加热数分钟才能够恢复酶活性。
同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。
使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。
Touch-down PCRTouch-down PCR又称降落PCR.即选定一个温度范围，如50—35℃，每降1-2 ℃进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。
基因工程中的基因重组方法及实验步骤探讨
基因工程中的基因重组方法及实验步骤探讨基因工程是一项重要的生物技术，它涉及到对生物体的基因进行操作和编辑，以改变其遗传特征。
基因重组是基因工程中常用的一种方法，它通过重新组合DNA分子，创造出具有特定功能的基因。
基因重组的方法有多种，包括限制性内切酶法、聚合酶链式反应法、DNA连接酶法等。
下面我们将对这些方法进行探讨，并介绍相应的实验步骤。
限制性内切酶法是基因重组中最常用的方法之一。
限制性内切酶是一类能够识别DNA序列并切割DNA链的酶。
在基因重组中，首先需要选择合适的限制性内切酶，根据目标基因或DNA片段的序列，确定限制性内切酶的切割位点。
然后，将目标基因和载体DNA分别用相同的限制性内切酶切割，生成切割的DNA片段。
接下来，将目标基因和载体DNA的切割片段进行混合，然后使用DNA连接酶将它们连接在一起。
最后，将连接好的DNA转化到宿主细胞中，使其表达目标基因。
聚合酶链式反应（PCR）法是另一种常用的基因重组方法。
PCR是一种在体外扩增DNA片段的技术。
在基因重组中，首先需要设计引物，引物是一对短的DNA序列，它们能够与目标DNA片段的两个末端互补结合。
引物结合到目标DNA片段后，通过PCR反应体系中的DNA聚合酶，通过不断的酶切和合成反应，使得目标DNA片段得以扩增。
PCR反应通常具有循环反应的性质，每个循环包括DNA的解性、引物结合、DNA合成和DNA的再解性。
通过多个循环的反复操作，可以在较短的时间内扩增出大量目标DNA片段。
DNA连接酶法是基因重组中用于连接两个DNA片段的方法。
DNA连接酶是一种酶类，它能够识别DNA的末端序列，并在双链DNA末端之间形成一个磷酸二酯键。
在基因重组中，首先需要将待连接的DNA片段分别用限制性内切酶切割，并生成具有互补末端序列的DNA片段。
然后，将这些片段与DNA连接酶一起反应，使它们连接成一个完整的DNA分子。
连接反应通常在适当的温度和时间下进行。
最后，通过转化技术将连接好的DNA分子导入宿主细胞中，使其表达目标基因。
引物添加酶切位点
引物添加酶切位点
引物添加酶切位点是分子生物学中常用的一种技术，用于在PCR 扩增过程中选择性地切割目标DNA的特定部位。
这种技术可以在PCR 扩增和DNA克隆等实验中起到很好的作用。
在引物设计时，可以将酶切位点添加到引物的两端。
当PCR扩增产生一段DNA片段后，酶切位点可以被特定的限制性内切酶识别并切割。
这样，只有目标DNA的特定部位被切割并保留下来，而非目标部位的DNA则被消除。
引物添加酶切位点的优点在于可以选择性地扩增目标DNA，减少了污染和杂交的可能性。
同时，也方便了后续实验的进行，如DNA克隆、测序等。
然而，引物添加酶切位点也存在一些缺点。
例如，酶切位点的添加可能会影响引物的互补性和特异性，导致扩增效率下降和非特异性扩增的出现。
此外，有些限制性内切酶的切割效率也可能受到PCR条件的影响，需要进行优化。
总的来说，引物添加酶切位点是一种有用的技术，可以在PCR扩增和DNA克隆等实验中起到很好的作用。
在实际应用中，需要根据具体实验的需要进行优化和调整，以确保实验的成功。
- 1 -。
目的基因与载体连接的方法
目的基因与载体连接的方法基因工程技术是通过将外源基因导入到宿主细胞中，以改变宿主细胞的遗传特征。
在基因工程中，目的基因常常需要连接到载体上才能被导入到宿主细胞中。
下面将介绍几种常见的目的基因与载体连接的方法。
1. 限制性内切酶切割连接法限制性内切酶是一类能够识别特定的DNA序列并切割DNA链的酶。
利用限制性内切酶的特异性切割性质，可以在目的基因和载体的DNA链上选择合适的切割位点。
切割后的DNA链上会留下一段不互补的单链，这个单链被称为粘性末端。
将目的基因和载体分别经过限制性内切酶切割后，可以利用这种粘性末端相互结合，形成互补碱基配对，然后使用DNA连接酶将其连接起来。
2. PCR扩增连接法PCR (聚合酶链反应) 是一种常用的基因扩增技术。
利用PCR技术，可以通过引物扩增得到目的基因和载体的DNA片段。
设计引物时，在其序列的3'端加入适当的限制性内切酶切割位点，然后通过PCR扩增获得含有限制性内切酶切割位点的DNA片段。
然后，将PCR产物和载体经过限制性内切酶切割后，利用DNA 连接酶将它们连接起来。
3. 转座子连接法转座子是一种能够在基因组内移动的DNA序列。
转座子连接法的原理是利用转座酶催化转座子在目的基因和载体之间的移动。
首先，将转座子序列插入到载体的DNA链上，然后通过反转录酶合成一个带有转座子的RNA分子。
此RNA 分子与目的基因连接后，通过转座酶的作用，将整个RNA-目的基因-转座子复合物插入到目的细胞的基因组中。
4. DNA连接酶片段连接法DNA连接酶片段连接法利用DNA连接酶催化DNA片段之间的连接。
该方法使用DNA连接酶作为催化剂将目的基因和载体的DNA片段连接起来。
此方法需要目的基因和载体之间有一段互补的序列，以便DNA连接酶能够催化它们连接起来。
5. Ligation-Independent Cloning (LIC)连接法LIC连接法是一种无连接酶的连接方法。
该方法不需要限制性内切酶切割，也无需互补的粘性末端。
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引物设计界面
First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
四、III类限制修饰酶
（ 1）亚基 R ， MS 亚基组成。 MS 亚基具有识别和甲基 化修饰双重作用. （2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。
（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 MboII 识别 5’-AAGA- 3’ 切割位点 5’-GAAGANNNNNNNN/N-3’ 3’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具 体可分为以下几种情况。 ① 同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同，如 HindⅡ 与 HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC ， HpaⅡ 与 HapⅡ 识别切割位 点为 C↓CGG ， MobⅠ 与 Sau3AⅠ 识别切割位点为 ↓GATC 。 ② 同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是相同的，但它们的 切割位点不同，分别为 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。另外， Asp718Ⅰ 识别和切割位点为 G↓GTACC 。 ③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的 功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切 割位点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。另外， HpaⅠ 和 HincⅡ 的识别位点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为 GTT↓AAC 和 HincⅡ 。 ④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质粒的多克 隆位点中有一个 SalⅠ 位点（识别切割位点为 G↓TCGAC），该位 点也可被 AccⅠ（识别切割位点为 GT↓MKAC）和 HincⅡ（识别切 割位点为 GTY↓RAC）切割。
引物的内部稳定性
• 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能 有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。 • 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结 构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
– 仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低 稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。 – 如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与 模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。
引物类型 搜索模式
引物搜索选项设定
引物长度
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
28对引物
搜索结果
每对引物的信 息
引物分值 100分为满分
双击选中一对 引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
7、同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。 这些酶统称为同尾酶。这些酶切割 DNA 得到的产 物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同 的。通过表 4-3 很容易判断哪些酶可产生相同的 DNA 末端。
· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY · SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA · BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG · ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）
引物设计界面
Sequence name Original sequence
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好
5’ 3’
Forward primer (Sense primer)
→
5’
Reverse primer (Antisense primer)
←
3’
引物的重要性
• 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的
地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特
异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR
的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行
有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结
果密切相关。
引物设计的原则
引物长度
• 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做
某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最 多不超过50个核苷酸。
碱基分布的均衡性
• 同一碱基连续出现不应超过5个
• GC含量一般40-60%
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的退火温度不利于提高PCR的特异性 – GC含量太高也易于引发非特异扩增。
引物二级结构
• 引物二聚体
– 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多
碱基互补
• 发夹结构
– 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则
将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
• 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个
碱基与模板DNA均需严格配对，不能进
行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，
甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码
五、用于分析限制性酶切位点的软件
sequencher
DNAman
引物的设计
引 物 设 计
• 引物 • 引物的重要性 • 引物设计的原则 • 引物与PCR • 引物设计软件
引物（primers)
• 引物是人工合成的两段
寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
引物Tm值
• 一般要求：55℃-65℃。 • 计算：
– 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 – 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参 数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也 是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
• Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
五、用于分析限制性酶切位点的网站
Web Map /web_apps/web_map/start
Mapper /molkit/mapper/index.ht ml restriction mapper / NEBcutter V2.0 /NEBcutter2/index.php
引物设计软件
• Primer Premier 5.0
• Oligo • primer 3 • The Primer Generator • NetPrimer
Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence
Preimer Premier 启动界面
引物编辑
引物编辑
编辑引物
分析引物结果
确认编辑的引物
一 ．限制性内切酶的分类：（三大类）
I． I类， II类, III类.
2． I类，III类为限制---修饰酶。
限制性内切活性和甲基化活性，都作为 亚基的功能单位包含在同一酶分子中。 3 ． II类限制性内切酶与甲基化酶是分离 的，切割位点专一，适合于DNA重组。
6、同裂酶（isoschizomer）
子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好
不与密码子第三个碱基配对。
引物5’端
• 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基， 在5’端引入一段非模板依赖性序列。
– 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 – 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 物中引入该位点的点突变以作研究。 – 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生 物素、地高辛等）。