限制性内切酶和引物

引物Tm值
• 一般要求：55℃-65℃。 • 计算：
– 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 – 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参 数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也 是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
• Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物设计软件
• Primer Premier 5.0
• Oligo • primer 3 • The Primer Generator • NetPrimer
Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence
Preimer Premier 启动界面
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识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具 体可分为以下几种情况。 ① 同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同，如 HindⅡ 与 HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC ， HpaⅡ 与 HapⅡ 识别切割位 点为 C↓CGG ， MobⅠ 与 Sau3AⅠ 识别切割位点为 ↓GATC 。 ② 同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是相同的，但它们的 切割位点不同，分别为 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。另外， Asp718Ⅰ 识别和切割位点为 G↓GTACC 。 ③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的 功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC ， ApoⅠ 识别和切 割位点为 R↓AATTY ，后者可识别前者的序列。另外， HpaⅠ 和 HincⅡ 的识别位点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为 GTT↓AAC 和 HincⅡ 。 ④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在 pUC 系列质粒的多克 隆位点中有一个 SalⅠ 位点（识别切割位点为 G↓TCGAC），该位 点也可被 AccⅠ（识别切割位点为 GT↓MKAC）和 HincⅡ（识别切 割位点为 GTY↓RAC）切割。
7、同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。 这些酶统称为同尾酶。这些酶切割 DNA 得到的产 物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同 的。通过表 4-3 很容易判断哪些酶可产生相同的 DNA 末端。
· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY · SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA · BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG · ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）
引物设计界面
Sequence name Original sequence
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好
引物二级结构
• 引物二聚体
– 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多
碱基互补
• 发夹结构
– 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则
将严重影响DNA聚合酶的延伸。
引物3’端
• 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个
碱基与模板DNA均需严格配对，不能进
行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，
甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码
四、III类限制修饰酶
（ 1）亚基 R ， MS 亚基组成。 MS 亚基具有识别和甲基 化修饰双重作用. （2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。
（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 MboII 识别 5’-AAGA- 3’ 切割位点 5’-GAAGANNNNNNNN/N-3’ 3’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’
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引物设计界面
First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
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五、用于分析限制性酶切位点的软件
sequencher
DNAman
引物的设计
引 物 设 计
• 引物 • 引物的重要性 • 引物设计的原则 • 引物与PCR • 引物设计软件
引物（primers)
• 引物是人工合成的两段
寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
五、用于分析限制性酶切位点的网站
Web Map http://pga.mgh.harvard.edu/web_apps/web_map/start
Mapper http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/mapper/index.ht ml restriction mapper http://www.restrictionmapper.org/ NEBcutter V2.0 http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php
引物类型 搜索模式
引物搜索选项设定
引物长度
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
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28对引物
搜索结果
每对引物的信 息
引物分值 100分为满分
双击选中一对 引物
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回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
引物的内部稳定性
• 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能 有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。 • 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结 构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。
– 仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低 稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。 – 如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与 模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。
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引物编辑
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引物编辑
编辑引物
分析引物结果
确认编辑的引物
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子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好
不与密码子第三个碱基配对。
引物5’端
• 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基， 在5’端引入一段非模板依赖性序列。
– 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 – 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 物中引入该位点的点突变以作研究。 – 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生 物素、地高辛等）。
一 ．限制性内切酶的分类：（三大类）
I． I类， II类, III类.
2． I类，III类为限制---修饰酶。
限制性内切活性和甲基化活性，都作为 亚基的功能单位包含在同一酶分子中。 3 ． II类限制性内切酶与甲基化酶是分离 的，切割位点专一，适合于DNA重组。
6、同裂酶（isoschizomer）
5’ 3’
Forward primer (Sense primer)
→
5’
Reverse primer (Antisense primer)
←
3’
引物的重要性
• 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的
地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特
异结合，不与其他非目的DNA结合，PCRwk.baidu.com
的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行
有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结
果密切相关。
引物设计的原则
引物长度
• 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做
某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最 多不超过50个核苷酸。
碱基分布的均衡性
• 同一碱基连续出现不应超过5个
• GC含量一般40-60%
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的退火温度不利于提高PCR的特异性 – GC含量太高也易于引发非特异扩增。