微生物培养基配制及菌种管理作业指导书草稿

**HB-CZ

******环境监测站

培养基配制及标准菌种的管理作业指导书

HB-CZ-085

制定人：

批准人：

批准日期：

实施日期：

培养基配制及标准菌种的管理作业指导书

1适用范围

本作业指导书适用于无菌实验室培养基配制和标准菌种、参照菌种的管理。

2内容

2.1培养基配制

2.1.1实验室中各种培养基按实验需要进行配制，每次配制应有记录。

2.1.2配制好的培养基，不宜存放过久，以少量勤配为宜，存放于0～4℃，可保存7天。

2.2标准菌种的管理

2.2.1实验室内保存的标准菌种必须从认可的收集途径获得。

2.2.2标准菌种必须进行确认试验。

2.2.3菌种传代

从供应商处购买的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直至到第3代为工作菌种。按菌种说明书要求复溶所转菌种并转接于适当的营养琼脂培养基内，作为第一代。经菌种特性鉴定后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，作为第二代。将第二代保存，另取1支第二代冷冻保存管转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管（第三代）；斜面养基适当温度培养后作为工作用菌种（第三代）。将（第三代）菌种冷冻或低温保存用于试验。应及时进行菌种传代，避免菌种失活老化。当工作菌种代数小于5时，可直接用上代工作菌种转接下代工作用菌种。转接第四代，直至四代转为五代。标准菌种的传代次数不得超过5代。2.2.4菌种确认

每次传代中至少要对菌种进行形态学观察和革蓝染色检查，必要时应做菌种鉴定试验，所有被确认受到污染的菌种应及时销毁，不得用于常规实验。用于总大肠菌群和粪大肠菌群项目检验的大肠埃希菌的特性如下：

2.2.4.1形态特征： G-直短杆状杆菌、无芽胞、有周身鞭毛，能运动。有菌毛。

2.2.4.2培养特性：兼性厌氧，营养要求不高，普通营养琼脂培养基上生长良好，形成

较大的圆形、光滑、湿润、灰白色的菌落。

2.2.4.3分离培养：伊红美兰培养基（EMB平板）上呈现深紫黑色，具有金属光泽的菌

落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。

2.2.5菌种标识

应在保存菌种的容器表面粘贴标签，标签必须字迹清晰可见，应注明：菌种的名称，标准号，传代次数，接种时间等。一旦新一代菌种制备成功，上一代菌种务必灭菌处理，处理过程应记录。

2.2.6菌种接种（斜面接种法）

2.2.6.1从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。

2.2.6.2 将装有新鲜配制的培养基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种

一并移入接种室或超净工作台。打开紫外灯照射1小时。

2.2.6.3关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿

接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过三次。

2.2.6.4右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再

轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。

2.2.6.5塞上管塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，

照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线，然后从底部向上作连续曲线划线，一直划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。2.2.6.6取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在

火焰上烧灼灭菌。

2.2.6.7将已接种好的细菌管置35～37℃培养箱培养22 ～24h。

2.2.7菌种保存

2.2.7.1斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续。大肠埃希菌可在营养琼脂培养基上4℃～6℃斜面保存2～3个月。

2.2.7.2甘油冷冻管保藏法

将待保藏菌种接种在适宜的斜面培养基上，适宜温度下培养适宜时间后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中，调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管，向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装于无菌小管，最好在-30℃条件下储存，一般可保存2年。

3记录

培养基配制记录包括配制日期、培养基类型、体积、成分、pH值、灭菌条件、无菌检验、制造商、批号及配制人员。

标准菌种的管理记录包括菌种编号、名称、来源、保存条件、确认试验。

DZHJ/Z-C-040(01)《MFC琼脂培养基配制记录表》

DZHJ/ZY-C-040(02)《EC培养基配制记录表》

DZHJ/ZY-CB-040(03)《营养琼脂培养基配制记录表》

DZHJ/ZY-C-040(04)《品红亚硫酸钠琼脂配制记录表》

DZHJ/ZY-C-040(05)《无菌实验室标准菌种管理记录表》

DZHJ/ZY-C-040 (01) M FC培养基配制记录表

配制人：

共页第页

1

DZHJ/ZY-C-040 (02) EC培养基配制记录表

共页第页

2

DZHJ/ZY-C-040 (03) 营养琼脂培养基配制记录表

共页第页

3

DZHJ/ZY-C-040 (04) 品红亚硫酸钠琼脂培养基配制记录表

共页第页

4