核酸凝胶电泳.终

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛 效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷， 在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的 重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电 荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
琼脂糖凝胶电泳的操作
操作步骤： 配胶 EB染色 点样
胶图分析
二、EB染色
1.碰到EB的手套要及时丢弃。 2.加量要适当，加EB至终浓度 0.5μ g/ml 3抹布要严格区分，不可交叉使用。
三、点样电泳
1.加样时，枪头要上紧，吸样均一准确，排液 时吸头不要有残留。 2.点完样后及时盖上胶垫，注意不要盖反。 3.点电泳前最好检查待用胶是否合格，点电泳 时要对准胶孔，尽量点完所有的样。 4.点完样勿忘marker,并摆正胶位，电泳仪正 负极不要插反，电泳槽的盖子要盖紧。
二·聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲 基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N’，N’ 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联向成的具有网状立体结 构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同分子所带电荷的差异及分子 大小的不同所产生的不同迁移率将DNA或蛋白质分离成若干条区 带，如果分离纯化的样品中只含有同一种DNA蛋白质，样品电泳 后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打 断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成 复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩 盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响， 只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (简称SDS—PAGE)。
垂直交变电场
脉 冲 电 场 凝 胶 电 泳 类 型
倒转电场系统
箝位匀强电场系统
反转电场系统
脉冲电泳的操作步骤
DNA样品制备
限制酶消化
脉冲
EB染色，拍照
分离、纯化大 的DNA 片段
紫外递质监测DNA
收集目的DNA
1.脉冲电泳凝胶电泳的DNA样品制备（以金黄 色葡萄球菌为例）
（1）取100ml对数生长期的金黄色葡萄球菌细胞于 4℃，5000g离心5分钟 （2）用20ml TEN缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5 分钟。在用10ml EC缓冲液使细胞悬浮。 （3）取1.5ml细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque琼 脂糖的EC缓冲液迅速混合均匀并等分流溶液至封闭 的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷 却至50℃。
核酸凝胶电泳
什么是电泳？
带点颗粒在电场作用下，向着与 其电性相反的电极移动，称为电泳。 生物大分子如蛋白质，核酸，多糖 等大多都有阳离子和阴离子基团， 称为两性离子在电场中，带电颗粒 向正极或负极迁移，迁移的方向取 决于它们带点的符号。
凝胶电泳有几类？
一· 琼脂凝胶电泳（分辨DNA范围为 0.2~50kb)
（2）凝胶后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切 成与样孔一致的大小，将样心的插入加样孔，避免 产生气泡。 （3）把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的 表面即可，缓冲液事先14℃冷却。
（4)将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关 设备相连。打开电源，调节蠕动泵到适当流速 (5～10mL/rain)或打开变速泵至40。 （5) 通过计算机启动极性转换程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉 冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。小于 50kb 的限制性片段在0.4s正向和0.2s 反向的电脉冲 (比率为2:1)下得以分离，时间为3～5h。 （6)在 0.5μ g/mL 溴化乙锭中进行染色并拍照。
常见的电泳仪
水平电泳仪
垂直电泳仪
脉冲电泳
电 泳 的 梳 子
电泳槽
电泳仪
一· 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种 电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒 等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼 脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大 分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带 电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取 决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。 凝胶的分辨 能力 同凝胶的类型和浓度有关。分辨DNA片段范围 0.2~50kb；而要分辨较小分子质量的DNA片段，则要用 聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1~1000bp。凝胶浓度的 高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其 分辨能力也就越强；反之，浓度越低，孔隙就增大，其分 辨能力也就越弱。
用途；制备高纯度的DNA片段。
操作步骤
制板
制分离胶
制浓缩胶 电泳槽安装 加样 电泳
观察结果 脱色 染色 固定
剥胶
1.制胶
1）在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，并立即在浓缩胶溶 液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶 溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 2）浓缩胶聚合完成后（30分钟）小心移出梳子。把凝胶固 定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。
成像拍照
电泳
1、配胶
按所要分离的DNA分子的大小，称取适量 的琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加适量1×TAE 电泳缓冲液； 然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化成 透明状，适当冷却后倒入胶托；胶完全冷凝 后放入电泳槽，电泳槽里的缓冲液必须没过 胶面。
铺
胶
凝胶凝固后取出梳子
加缓冲液
2、EB染色
溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核 酸双链的配对碱基之间。在在紫外照射 EB-DNA复合物时，出现不同的效应。 注意：严格区分污染区和非污染区，不 把污染区的物品拿到非污染区碰过EB的 手套要及时丢弃！
2.样品制备
取样品加入0.5ml2×SDS凝胶加样缓冲液混匀。
百度文库3.加样及电泳
用吸嘴吸取50μ l，从加样孔底部缓慢加样。 注意：加样时不得插伤凝胶孔面，不得产生气泡、样品不 得溢出加样孔。
4.接电源与电泳
上槽接负极，下槽接正极。调节电压至80V电泳至样品前 沿刚好进入分离胶后，把电压提高到120V（凝胶上所加电 压为8V/cm），继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方 约1cm（约2—3小时），然后关闭电源，取出插头。
聚丙烯酰胺凝胶电泳种类
1.变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）
变性聚丙烯酰胺凝胶是分子生物学常用技术之一， 是根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与 不完整的短分子分开。电泳时通常每一泳道至少加 1mg合成的寡核苷酸，电泳后在紫外灯下定位寡核苷 酸条带，将长度正确的寡核苷酸从凝胶上切下。主要 用于单链DNA片段的分离或纯化。 用途；放射性DNA探针的分离，DNA测序等。
2.限制酶消化
（1）25ul 10x反应缓冲液，30U 限制酶，加 双蒸馏水至250ul混匀。
（2）取一个凝胶块置其中，合适温度下过夜 后，用TE缓冲液洗涤并贮存。
3.应用PFGE对样品DNA进行分析
（1）用0.5xTBE缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT琼脂 糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用 Wide Mini-Sub Cell进行电泳的话，50ml该溶液即 可。
（4）对于每一个菌株，需要15-20个凝胶块，将
它们放至含有30-45ug/ml RNase的10ml EC缓冲 液中，于37℃振荡过夜。
（5）去掉裂解缓冲液，换为10ml ESP缓冲液于 50℃轻度摇温育48h。 （6）将凝胶块放在10ml含有174ug/ml 苯甲基 磺酰氟（PMSF）的TE缓冲液中，室温温育4h,以 灭活ESP中的蛋白酶K。 （7）用TE清洗琼脂块6h，至于TE中4 ℃保存。
5.剥胶
从电泳装置上卸下玻璃，用水果刀撬开玻璃板。并用刀在 紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
6.染色与脱色
用考马氏亮蓝染色液对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色 1~2小时后，用脱色液在脱色摇床上与脱色3~4次，每次 20~30分钟。
注意事项
1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附 于皮肤，操作时应避免沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次 性手套进行操作。 2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙 烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵 商品不能使用。此外，10 ％过硫酸铵必须现配现用。 3.灌制凝胶时，应避免产生气泡，因为气泡会影响电泳分 离效果。 4.刚灌制注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加 1~2cm高得水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别 小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶的胶面。 5.聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长，电泳过程中产热多，特别 是夏天产热更多。顾电泳过程中应安装循环冷却水以带走 热量，或在4 ℃ 冰箱中电泳。
成像拍照
胶图分析
注意事项
一、配胶
1.电子称的使用，要时刻注意保持电子称的精确性， 保持清洁，根据不同的浓度的胶称取琼脂糖。 2.加TAE的量要适当，以避免配出来的胶太薄导致胶 孔太浅或浓度太低。 3.倒胶前胶托一定要洗干净，并檫干。倒胶时要待 胶冷到一定温度摇匀尽量不要产生气泡。若胶液的 温度太高胶托容易变形。
2.非变性聚丙烯酰胺凝胶（native-PAGE）
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为 活性电泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件 下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。使生物大分子 在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，尤其是在电 泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活 性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，用于双链DNA 片段的分离于纯化。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸 基团，是呈离子状态的。从这种意义上讲，DNA和RNA 的多核苷酸链可称为多聚阴离子。因此，当核酸分子 被放置在电场当中时，它们就会向正极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相当数量的 双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样 的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度，DNA分 子的这种迁移速度，亦即电泳迁移率，取决于核算分 子本身的大小和 结构。分子质量较小的DNA分子比分 子质量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其 电泳迁移率也就比同等分子质量的的松散型的开环 DNA分子或线性分子要快些。这就是应用凝胶电泳技 术分离DNA片段的基本原理。
二· 聚丙烯酰胺凝胶电泳（分辨范围为 1~1000kb）
三· 脉冲电场凝胶电泳（分离到高达107bp的 DNA大分子）
前言；核酸凝胶电泳是分子克隆技术之一，用于 分离· 鉴定和纯化DNA或 RNA片段。
核酸凝胶电泳的基本原理
凝胶电泳的原理比较简单。当一种带电分子放在电场 当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。带点 分子在电场作用下的移动速度，称之为电泳迁移率，它 同电场的强度和电泳分子本身携带的静电荷数成正比。 也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的静电荷越 多，其移动速度也就越快，反之则慢。在哪电泳中，使 用无反应活性的琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶作支持介质， 从而将电泳分子的对流运动降低到极低，使电泳分子的 移动速度与其分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是 分子大小、极性及介质黏度的函数，因此根据分子大小 的不同、构型或形状的差异，以及所带净电荷的多寡， 便可以通过电泳将核酸或蛋白质分子混合物中的各种成 分彼此分离开来。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
三· 脉冲电场凝胶电泳（PFGE ）
在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向随着电 场方向的周期性变化而不断改变。在标准的 PFGE中，第一个脉冲的电场方向在另一侧成 45°夹角。由于琼脂糖凝胶的电场方向、电 流大小及作用时间都在交替变化，使得DNA 分子能够随时调整其游动方向，以适应凝胶 孔隙的无规则变化。与相对分子质量较小的 DNA相比，相对分子质量较大的DNA需要更 多的脉冲次数来更换其构型和方位，使其按 新的方向游动。应用脉冲电场凝胶电泳技术， 可成功分离到高达107bp的DNA大分子。
3、点样
根据样品不同可分两种点样体系： A、样品+6Xloading buffer B、样品可以直接点样
4、电泳
点完样后连接电源，设置好电源的参数，开始 电泳。当溴酚蓝的带（蓝色）的移动至一定长 度即可停止电泳。 电压要求：≤20V/CM胶，在样品出孔用低压 （3V/CM，15min）,然后调回标准电压，跑出 的条带较好。