高效液相色谱法

二、 化学键合相色谱法
BPC） （bonded phase chromatography, BPC）
化学键合相： 化学键合相：采用化学反应的方法 将固 定液的官能团键合在载体表面上。 定液的官能团键合在载体表面上。
优点：固定相不易流失 优点： 适用于各种样品的分离分析
分
类
♠正相键合相色谱法： 正相键合相色谱法： 极性键合相，如氨基柱、 极性键合相，如氨基柱、氰基柱 适用：极性化合物 适用： ♠反相键合相色谱法： 反相键合相色谱法： 非极性键合相， 非极性键合相，如C18柱、C8柱 适用： 适用：非极性至中等极性化合物
2 p
Dm ∝T/η
减免方法： ） 减免方法：1）减少固定相颗粒直径 2）减少流动相液体黏度（甲醇） ）减少流动相液体黏度（甲醇）
静态流动相传质阻力项C 4. 静态流动相传质阻力项Csmu
原因： 原因：处于固定相颗粒 内部孔洞内静态流动相 引起
影响C 的因素与C 影响Csmu的因素与Cm相同
固定相的传质阻力项C 5. 固定相的传质阻力项Csu
基本理论第2节 基本理论-速率理论
一、柱内展宽
H = A + B / u + (C m + C sm + C s )u
Csm为静态流动相传质阻力系数
1. 涡 流 扩散 项 A 组分在色谱柱中运行时间不同， 组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱 峰展宽。 峰展宽。 影响因素： 影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度
1、反相键合相色谱法（RP-HPLC） 反相键合相色谱法（RP-HPLC） 1）分离原理 ） 流动相与溶质有排斥力， 流动相与溶质有排斥力 ， 促使溶质分子与键 合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可 合相的烃基发生疏水缔合， 逆的。 逆的。 k↓，组分 R↓ ，组分t
反相键合相色谱法（ 反相键合相色谱法（RP-HPLC） ） 2）固定相：极性小的烷基键合相 ）固定相： C8柱，C18柱（ODS柱） 柱 十八烷基键合相：常用的非极性键合相 十八烷基键合相：
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常用于HPLC流动相溶剂的性质 流动相溶剂的性质 常用于
溶剂 全氧烃 正戊烷 正已烷 正庚烷 环已烷 四氯化碳 苯 甲苯 乙醚 二氯甲烷 正丙醇 P/ <-2 0 0.1 0.2 -0.2 1.6 2.7 2.4 2.8 3.1 4.0 ε 0.25 0 0.01 0.01 0.04 0.18 0.32 0.29 0.38 0.42 0.82 Xe Xd Xn 选择
第12章 高效液相色谱法 章
high performance liquid chromatography HPLC
HPLC与经典 区别 与经典LC区别 与经典
经典液相色谱 固定相颗粒较大， 固定相颗粒较大，不均 匀 常压下输送流动相 柱效低 分析周期长
现代液相色谱 固定相颗粒小，均匀 固定相颗粒小， 高压下输送流动相 柱效高 分析周期短
液相色谱中Dm比GC中小 5 比 中小10 液相色谱中 中小 u是最佳流速的 倍 是最佳流速的3-5倍 是最佳流速的
B/u忽略 忽略
3.流动的流动相传质阻力项C 3.流动的流动相传质阻力项Cmu 流动的流动相传质阻力项
流动相本身， 流动相本身，处于不 同层流的分子具有不 同流速。 同流速。
C m ∝ d / Dm
Kromasil
Zobax Eclipse
Zobax Extend
min
Zobax SB
流动相的性质和选择
1、流动相的物理性质 、 1)流动相要求： 流动相要求： 流动相要求 易得易纯化，无毒不易燃。 ①易得易纯化，无毒不易燃。 检测器的适应性:如紫外检测器对 ②检测器的适应性 如紫外检测器对 溶剂的透明波长要求；示差折光不能 溶剂的透明波长要求；示差折光不能 用梯度洗脱 ③对样品有一定溶解度而不反应 纯净,低廉 低粘度(5× 低廉,低粘度 ④纯净 低廉 低粘度 ×10-4Pa.S), 低沸点(>柱温 柱温(20~50)) 低沸点 柱温
反相键合相色谱法（ 反相键合相色谱法（RP-HPLC） ） 3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈 水 ）流动相：极性大的甲醇 水或乙腈 水或乙腈-水 流动相极性 > 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 有机调节剂（极性调节剂） 甲醇，乙腈， 例：水 + 甲醇，乙腈，四氢呋喃
反相键合相色谱法（ 反相键合相色谱法（RP-HPLC） ） 4）流动相极性与k的关系： ）流动相极性与 的关系 的关系： 流动相极性↑ 洗脱能力↓ k↑，组分t 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 5）出柱顺序：极性大的组分先出柱 ）出柱顺序： 极性小的组分后出柱 6）适用：非极性-中等极性组分 ）适用：非极性-
正相键合相色谱法（NP-HPLC） 正相键合相色谱法（NP-HPLC） 4）流动相极性与k的关系： ）流动相极性与 的关系 的关系： 流动相极性↑，洗脱能力 ，组分t ， 流动相极性 ，洗脱能力↑，组分 R↓，k↓ 5）出柱顺序：极性小的组分先出柱 ）出柱顺序： 极性大的组分后出柱
6）适用： ）适用： 氰基键合相： 氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似 氨基键合相：糖类等 氨基键合相：
Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5µm （ × ， µ ）色谱柱 (Aschaffenburg, Germany)。流动相： 。流动相： (A)乙腈 乙腈-(B)0.3%醋酸水溶液进行梯度洗脱： 醋酸水溶液进行梯度洗脱： 乙腈 醋酸水溶液进行梯度洗脱 0-30min：A 28%，B 72%； ： ， ； 30-53min： A 28％升至 ％， 72％降至 ％； ： ％，B ％降至66％； ％升至34％， 53-70min： A 34％升至 ％， 66％降至 ％。 ： ％，B ％降至20％。 ％升至80％， 流速： 流速：1.0 ml·min-1； 检测波长： 检测波长：275 nm； 进样量： 进样量：20µl； ； 柱温： ℃ 柱温：30℃；
影响因素： 影响因素：固定相内部阻力影响
C m ∝ d / Ds
2 f
减免方法： 减免方法：减少固定相液膜厚度 ——化学键合相 ——化学键合相
6、HPLC法中分离条件的选择 HPLC法中分离条件的选择 H = A + （Cm+Csm）u 1. 固定相与装柱方法的选择： 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（ 选粒径小的、分布均匀的球形固定相（ dp≤10µm） 首选化学键合相，匀浆法装 ） 首选化学键合相， 柱
例： ODS柱分离苯 甲苯，流动相为甲醇柱分离苯、 用ODS柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇-水 95： （95：5） 问：①哪个先出柱 ②若要增大tR，应增大甲醇还是水的比例? 应增大甲醇还是水的比例?
2、正相键合相色谱法（NP-HPLC） 正相键合相色谱法（NP-HPLC） 1）分离机制： ）分离机制： 2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相 ）固定相：极性大的氰基或氨基键合相 氰基 3）流动相：极性小 ）流动相： 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿氯仿-甲醇，氯仿-乙醇
减少方法 ： a 降低 p：目前商品柱多采用 降低d 目前商品柱多采用3-5µm粒径 粒径 b 降低λ：采用球形、均匀分布固定相。 降低 ：采用球形、均匀分布固定相。
2. 纵 向 扩 散 项 B/u 样品分子沿流动相方向产生扩散， 样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起 峰展宽 B=2γDm Dm ∝T/η
3．离子对色谱法（IPC或PIC） 离子对色谱法（IPC或PIC）
反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂， 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 离子对试剂 与其中的反离子形成中性离子对 增加k和 中性离子对， 与其中的反离子形成中性离子对，增加 和tR，以改善分离
离子对试剂：烷基磺酸钠→ 1）离子对试剂：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季胺盐→ 四丁基季胺盐→分析酸 影响k 2）影响k的因素 的极性有关（同反相色谱） a．与m的极性有关（同反相色谱） 的链长有关：R↑长 极性↓ b．与R的链长有关：R↑长，极性↓小，tR↑，k↑ 适用：较强的有机酸、 3）适用：较强的有机酸、碱
流动相及其流速的选择： 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 甲醇， 选粘度小、低流速的流动相 甲醇 1ml/min 柱温的选择： 3. 柱温的选择： 选室温25-300C左右。太低，流动相黏度增加， 左右。 选室温 左右 太低，流动相黏度增加， 太高容易产生气泡
二、柱 外 展 宽
3．洗脱方式 ． 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） ）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱 类似 的等温度洗脱 2）梯度洗脱： ）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵） 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品） 的程序升温（ 类似 的程序升温 沸程较长样品）
2)流动相的物理性质 流动相的物理性质 流动相的 沸点bp、分子量 、密度、介电常数e 沸点 、分子量M、密度、介电常数 粘度η、折射率RI、 粘度 、折射率 、紫外吸收截止波长 溶剂强度参数ε(Al2O3)、溶解度参数 溶剂强度参数 、 δ(色散 d、取向极性 0、受质子 a 色散δ 取向极性δ 受质子δ 色散 给质子δ 、溶剂极性参数P 质子接 给质子 h)、溶剂极性参数 / (质子接 给质子x 偶极x 、 受xe、给质子 d、偶极 n)、选择性分 表面张力、 组、表面张力、离子对色谱溶剂强度 (P/+0.25e)
DAD1 E, Sig=275,16 Ref=off (F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG035.D) mAU
Luna
20 0 0 10 20 30 DAD1 E, Sig=275,16 Ref=off (F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG050.D) mAU 20 10 0 0 10 20 30 VWD1 A, Wavelength=275 nm (F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG051.D) mAU 100 50 0 0 10 20 30 DAD1 E, Sig=275,16 Ref=off (F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG054.D) mAU 75 50 25 0 0 10 20 30 DAD1 E, Sig=275,16 Ref=off (F:\DONNA\AJX\JX0-66\JIANG057.D) mAU 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 min 40 50 60 70 40 50 60 70 min 40 50 60 70 min 40 50 60 70 min
R1 Si OH + Cl R1 C18H37 Si O
Si
R2
Si
R2
C18H37 + HCl
键合相分类
高碳型： 高碳型：R1、R2是两个甲基 特点：载样量大， 特点：载样量大，保留能力强 中碳型： 其中一个是氢， 中碳型：R1、R2其中一个是氢，一个为氯 低碳型： 低碳型： R1、R2都是氯
表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目， 表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目， 占硅胶表面硅醇基总数的比例。 占硅胶表面硅醇基总数的比例。 作用：决定了键合相是分配还是吸附占 作用： 主导 封尾：为了减少残余的硅醇基， 封尾：为了减少残余的硅醇基，一般在 键合反应后， 键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子 进行钝化处理。 进行钝化处理。
从进样器到检测器之间的体积称柱外死 体积，均可导致色谱展宽，柱效下降。 体积，均可导致色谱展宽，柱效下降。 减免方法： 减免方法：应尽可能减少柱外死体积
第3节
各类高效液相色谱法
吸附色谱法 化学键合相 离子对色谱法
一、吸 附 色 谱 法 1．分离原理 2．固定相：极性和非极性固定相 ．固定相： 3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 ．流动相：底剂（烷烃）