皮质骨I型胶原的提取及胶原 明胶支架材料的制备
ⅰ型胶原蛋白的提取及其结构表征
ⅰ型胶原蛋白的提取及其结构表征ⅰ型胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，在人体中广泛存在，对于维持组织的稳定性和机体功能发挥着重要作用。
本文将介绍ⅰ型胶原蛋白的提取方法以及其结构的表征。
ⅰ型胶原蛋白的提取方法主要分为生物法和生化法两种。
生物法是指通过动物和人体组织中的ⅰ型胶原蛋白提取，常用的动物来源包括鸡、鱼、猪等，而人体组织来源主要是皮肤和骨骼组织。
生化法则是通过基因工程技术将ⅰ型胶原蛋白基因导入细胞中进行表达，然后通过细胞培养和分离纯化得到ⅰ型胶原蛋白。
提取得到的ⅰ型胶原蛋白需要进行结构表征，常用的方法包括X射线衍射、核磁共振、电子显微镜等。
其中，X射线衍射是最常用的方法之一。
通过X射线衍射，可以确定ⅰ型胶原蛋白的分子结构、晶体结构以及结晶度等。
核磁共振则可以研究ⅰ型胶原蛋白的分子运动和构象变化，从而揭示其功能机制。
电子显微镜则可以观察ⅰ型胶原蛋白的形态和微观结构，为进一步研究提供参考。
ⅰ型胶原蛋白的结构是由三股左旋螺旋状的多肽链组成，每股链由约1050个氨基酸残基组成。
每个氨基酸残基包含一个羟基脯氨酸残基，这是ⅰ型胶原蛋白特有的结构单元。
三股多肽链以右旋螺旋方式相互缠绕，形成三股螺旋结构，这种结构使得ⅰ型胶原蛋白具有很高的机械强度和稳定性。
此外，ⅰ型胶原蛋白还含有许多氧原子和羟基，这使得它具有良好的水合性和生物相容性。
ⅰ型胶原蛋白在人体中的分布非常广泛，主要存在于皮肤、骨骼、肌腱、血管、角膜等组织中。
在皮肤中，ⅰ型胶原蛋白构成了真皮层的主要成分，为皮肤提供了强度和弹性。
在骨骼中，ⅰ型胶原蛋白是骨骼组织的主要成分，赋予骨骼强度和韧性。
在肌腱和血管中，ⅰ型胶原蛋白的存在保证了它们的稳定性和弹性。
在角膜中，ⅰ型胶原蛋白形成了角膜的主要成分，为眼睛提供了保护和支撑。
ⅰ型胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，对于维持人体组织的稳定性和功能发挥着重要作用。
通过生物法和生化法可以提取得到ⅰ型胶原蛋白，并通过X射线衍射、核磁共振和电子显微镜等方法对其结构进行表征。
皮质骨I型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备
皮质骨I型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】探索一种较理想的皮质骨I型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料。
［方法］以牛皮质骨为原料，经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉。
通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉，经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原，SDS PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征；再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料，扫描电镜观察其内部结构。
［结果］所得胶原经SDS PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定符合I型胶原特征；制备的支架材料外观呈圆柱状，内部为孔径均匀平行排列的微管结构，具有仿生效果。
［结论］皮质骨中能够获得纯度较高的I 型胶原，可用于胶原材料的制作。
【关键词】组织工程胶原提取神经支架Abstract：［Objective］To develop an ideal method for extracting type I collagen from cortical bone and to prepare a collagen gelatin scaffold.［Method］The cortical bone was disintegrated into bone matrix powder in a high speed mill andwas subsequently dehydrated in alcohol,decalcificated in hydrochloric acid and defatted in chloroform:methanol (1:1,v/v).The osscins were extracted using improved pepsin digestion method after the bone matrix powder was dissolved,centrifuged,dialyzed and lyophilized. Type I collagen was then characterized by SDS PAGE and amino acid composition analysis. The biomaterial was made of type I collagen and gelatin using freeze drying method,and the alignment regularities of microscopic channels and their course directions were observed under the scanning electronic microscope.The size of the micropores and the factor of porosity were also measured. ［Result］ The collagen extracted was confirmed to be type I collagen by SDS PAGE and amino acid composition analysis. All the scaffolds looked like circular cylinder,the microscopic channels were arranged in parallel manners,and the pore sizes of the channels were uniform.［Conclusion］Ossein extracted from cortical bone is a real type I collagen that can be applied in the construction of collagen products.Key words：tissue engineering; collagen; extraction; nerve scaffold周围神经缺损后的修复再生和功能恢复一直是神经科学领域的难点和热点。
多种软骨修复支架纳米材料的制备方法
多种软骨修复支架纳米材料的制备方法专利名称申请号申请人摘要一种软骨修复支架材料的制备方法CN201310690006.1李克尊本发明涉及组织工程支架技术领域，尤其是涉及一种软骨修复支架材料的制备方法，首先通过静电纺丝制备含有羟基磷灰石的壳聚糖纳米纤维，然后使用透明质酸封装，通过冻干的实验方法，制备的软骨修复支架材料。
本发明的一种软骨修复支架材料的制备方法，得到的软骨修复支架材料具有较大的比表面积，有利于软骨细胞的生长和增殖，羟基磷灰石作为人体骨中的主要成分，为软骨细胞的生长提供的大量的必要原料，透明质酸是软骨液的主要成分，有利于给予软骨细胞一个良好的生长环境，同时透明质酸可以与壳聚糖复合，将纳米羟基磷灰石封装在壳聚糖纤维中，形成一种羟基磷灰石的缓释体系，生长因子可以促进软骨细胞快速增殖。
硫酸软骨素基纳米纤维无纺布及其制备方法和医用用途CN201310142588.X 常州大学本发明涉及一种硫酸软骨素基纳米纤维无纺布及制备方法和医用用途。
该纳米纤维无纺布包括硫酸软骨素和合成高分子，主要是利用静电纺丝技术将硫酸软骨素和合成高分子的混合溶液加工成纳米纤维，在静电纺丝过程中，随着溶剂的挥发，溶液产生分相，形成核壳结构纳米纤维。
得到的硫酸软骨素基纳米纤维无纺布具有均一性好、孔隙率高、透气性好、生物相容性好的特性，该硫酸软骨素基纳米纤维无纺布在制备过程中，采用的溶剂均为水，无有机溶剂残留；这种硫酸软骨素基纳米纤维无纺布能用作创伤敷料和伤口包敷材料，具有止痛、抗炎、加速伤口愈合的作用；同时，硫酸软骨素基纳米纤维无纺布在敷料方面的应用，拓宽了硫酸软骨素的应用范围。
一种以取向纳米纤维毡为骨架的纳米软骨修复材料及其制备方法CN201510545411.3中原工学院本发明涉及一种以取向纳米纤维毡为骨架的纳米软骨修复材料及其制备方法。
通过静电纺丝技术制备含有石墨烯的取向纳米纤维毡为骨架，浇注含有丝素、透明质酸、硫酸软骨素、羟基磷灰石粒子的混合溶液，并通过交联技术和冷冻干燥制备而成。
一种提取I型胶原蛋白的方法[发明专利]
![一种提取I型胶原蛋白的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/2b514ba66aec0975f46527d3240c844769eaa016.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710196069.X(22)申请日 2017.03.29(71)申请人 武汉医佳宝生物材料有限公司地址 430070 湖北省武汉市洪山区书城路28号(72)发明人 柯林松 陈鹏 唐小雄 (51)Int.Cl.C12P 21/06(2006.01)C07K 14/78(2006.01)C07K 1/36(2006.01)C07K 1/34(2006.01)C07K 1/30(2006.01)(54)发明名称一种提取I型胶原蛋白的方法(57)摘要本发明涉及一种提取I型胶原蛋白的方法，该方法包括如下步骤：将牛跟腱清洗干净后冷冻切片，采用75%酒精与正己烷进行消毒脱脂，进过脱杂蛋白和匀浆破碎工艺后，向匀浆液加入适量的活性酶进行酶解消化，再将上清液先后进行盐析和透析处理，将透析后的胶原原液进行冷冻干燥和真空包装得到I型胶原蛋白产品。
本发明的制备工艺简单、可实现大规模生产，是一种经济有效的提取方法。
本发明提取的I型胶原蛋白具有优良的生物相容性和生物活性，能够适应生物医学的应用，同时能够活化上皮细胞，促进上皮细胞增生和胶原酶生成，使皮肤紧致有弹力，在化妆品领域也具有重要的应用价值。
权利要求书1页 说明书4页CN 106701879 A 2017.05.24C N 106701879A1.一种提取I型胶原蛋白的方法，其特征在于，制备方法包括以下五个步骤：步骤一： 将新鲜的牛跟腱用超纯水清洗干净，采用手术刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中将牛跟腱冷冻至硬化，取出后沿着组织纤维方向将牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片；步骤二：称取适量跟腱片置于消毒脱脂溶液中浸泡，机械搅拌，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗若干次；步骤三：将步骤二处理后的跟腱片用碱性溶液浸泡进行脱杂蛋白，机械搅拌，间隔6~8h 更换一次碱性溶液，采用不锈钢丝网滤去溶液，取出后用超纯水清洗若干次至跟腱片表面为中性（pH值为7）；步骤四：将步骤三中脱杂蛋白后的跟腱片放入绞肉机中绞碎，并将绞碎后的跟腱组织置于1000mL的酸性溶液中，采用匀浆机对其匀浆破碎若干次，每次匀浆5min；步骤五：将步骤四中的匀浆液置于大容量的不锈钢容器中，继续向匀浆液中加入1000mL酸性溶液，再向其中加入适量的活性酶，搅拌消化，离心15~30min，取上清液备用；步骤六：使用氢氧化钠溶液将步骤五中的上清液中和至溶液呈中性，加入氯化钠进行搅拌盐析，离心15~30min，沉淀即为I型胶原蛋白初品，用超纯水冲洗沉淀若干次，沥干，将沥干的沉淀溶解于透析液中，在进行透析；步骤七：将步骤六中透析后的胶原原液进行干燥处理，取出后真空封装。
Ⅰ型骨胶原膜的制备及生物相容性研究
（ 三 军 医 大 学 西 南 医 院 骨 科 ， 庆 ４０ ３ ） 第 重 ００ ８
【 要 】 目的 摘
观 察 自创 增 强 酶 解 法 提 取 的 皮 质 骨 胶 原 所 制胶 原 膜 的 生 物 相 客 性 ， 利 用 该 胶 原 制 备 支 架 材 料 提 为
ｐｒ ｅ ｒ ｏａｄｃ－ｏｔｗｓＨ ｓｉｌ 】 ｌ ｒ Ｍｅｉ ｌ ｎ ｅ － ｈｎ ｑ ｇ４ ０３ ， ｈｎ ａｔ ｎ ｏ ｔ ｐｅｉ Ｓｕ ｅ ｏ ｔ ， － Ｍｉａｙ ｄ ａ Ｕ ｉ ｒ ｍ ｔｆＯ ｈ ｓ ｈ ｔ ｐａ ， ｄ ｉ ｃ ｖ ｓ Ｃｏｇｉ ００８ Ｃ ｉ ｔ ｎ ａ
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川 医 学 ２０ 年 ４爿 第 ２ ０７ ８卷 （ ４期 ） ＳｃｕｎＭｅｉ ｌ ｐｉ ２０ ， ，２ ． ｏ４ 第 ｉ ａ ｈ ｄ ａ ｒ ，０７ ．８ Ｎ ． ｃ Ａ ｌ 论 文 ●
Ｉ型 骨胶 原 膜 的制 备及 生 物 相 容性 研 究
供 可行 性依 据 。 方 法 以新 鲜猪 皮 质 骨 为 原 料 ， 过 增 强酶 解 法 提 取 技 术 获得 Ｉ型 胶 原 ， 将 胶 原 制 成 戊 二 醛 交 联 或 不 通 再
交 联 的胶 原 膜 。 最后 将 胶 原 膜 与 ｈ Ｓ Ｍ Ｃ共 培 养 观 察 细 胞 相 容 性 或 埋 植 到 兔 肌 袋 里 观 察 组 织 相 容 性 和 降 解 情 况 。 结 果 胶 原 膜 无 明显 细胞 毒 性 ，Ｍ Ｃ增 殖 迅 速 ， 明显 受抑 制 现 象 。埋 植 试 验 ， 交 联 的胶 原 膜 １周 时 即 明 显 降 解 ， 见 血 管 ｈＳ 无 未 可 长 入 ， 末 即被 完全 吸 收 ； 联后 的 胶 原 膜 ２周 时 开 始 明显 降 解 ， 左 右 才 完 全 被 吸 收 。 结 论 增 强 酶 解 法提 取 的 骨 ２周 交 ４周 胶 原 制 备 的 胶 原 膜 具 有 良好 的 细胞 相 容 性 、 织 相 容 性 和 降 解 性 。 适 当浓 度 戊 二 醛 交 联 可 提 高胶 原 的 强 度 而 不 引 起 明 组
缺钙纳米羟基磷灰石_胶原复合支架材料的制备(1)
重庆大学硕士学位论文缺钙纳米羟基磷灰石/胶原复合支架材料的制备姓名：帅丽申请学位级别：硕士专业：药物化学指导教师：季金苟2010-04摘要骨组织修复材料长期以来都是生物医学材料领域的热门课题。
近二十年来，由于组织工程支架材料的很多优点使得其已逐渐成为骨修复材料研究发展的方向。
支架材料的发展经历了由单一的生物高分子材料、无机生物陶瓷材料等向复合多孔支架材料发展的道路。
羟基磷灰石（HA）与有机聚合物复合的材料是当前硬组织修复材料研究中的热点之一。
HA是人骨无机结构的主要成分，具有较好的生物相容性和生物活性，能与骨组织中的其他成分形成牢固的键合，因此HA一直是骨修复和替代材料研究的主要课题。
但由于其脆性大，韧性差，在生理条件下缺乏抗疲劳性，因此限制了它的临床应用范围。
如果将HA与一些弹性和韧性较好，且成分与人骨接近的生物大分子复合，就可以将二者的优势充分结合起来，有望得到强度高、柔韧好、可塑性强、力学性能好且具有良好生物相容性和生物活性的新一代骨修复材料。
基于以上原因，本课题所采用的生物大分子为胶原，将胶原蛋白与HA进行复合，从而最大限度地发挥其各自的特点，扩大其临床应用范围。
本文以草鱼鱼鳞为原料，采用胃蛋白酶从鱼鳞中提取胶原蛋白，通过单因素实验考察不同前处理、提取介质以及不同的提取方式对胶原蛋白提取效率的影响，研究结果表明：鱼鳞胶原蛋白的最佳提取工艺为采用微波辅助去杂，以0.1mol/LHCl浸泡除钙，再以1%的柠檬酸（含1%胃蛋白酶）作为提取介质，并用超声辅助提取的方法得到的I型胶原蛋白。
把纯化后的鱼鳞胶原蛋白用以红外光谱分析，确定所提取鱼鳞胶原蛋白的特征基团。
本文以Ca(NO3)2·4H2O、(NH4)2HPO4和NH4HCO3为原料，采用化学沉淀法辅以微波辐射制备了含碳酸根的纳米缺羟基磷灰石（d-CHA）、磷酸三钙（TCP）、不含碳酸根的纳米缺钙羟基磷灰石（d-HA）、以及HA，通过共混法和共沉淀的方法制得不同类型的磷酸钙/胶原复合支架，并将其通过在模拟体液中的浸泡来考察其生物活性。
ⅰ型胶原蛋白的提取及其结构表征
ⅰ型胶原蛋白的提取及其结构表征
ⅰ型胶原蛋白是一种重要的蛋白质，存在于动物的皮肤、骨骼、软骨和结缔组织中。
其提取方法可通过以下步骤实现：
1.取动物组织（如骨骼、软骨等），将其清洁并切割成小块。
2.使用酸性溶液（如0.5M醋酸或0.5M盐酸）将组织进行提取，在常温下放置数小时，使胶原蛋白得到释放。
3.将溶液经过离心后分离出胶原蛋白。
4.使用醋酸、醇或其他方法除去胶原蛋白中的杂质，获得纯化后的ⅰ型胶原蛋白。
ⅰ型胶原蛋白的结构包括三个α螺旋螺旋通过氢键交叉连接而成的三股螺旋状高分子，其中每股含有约1000个氨基酸残基。
三股螺旋状高分子相互交缠在一起，形成强大的三维空间结构。
在结构中，ⅰ型胶原蛋白主体由 Gly-X-Y（X和Y代表一种氨基酸，通常是脯氨酸和羟脯氨酸）三肽单元组成，这些单元以Glycine为间隔排列在长的螺旋上。
同时，ⅰ型胶原蛋白还包含了多个依赖于金属离子的结构域和不同长度的开放环形（telopeptide）序列。
以上是ⅰ型胶原蛋白提取及其结构的简要介绍。
i型猪皮胶原用途
I型猪皮胶原的用途什么是I型猪皮胶原？I型猪皮胶原是一种来源于猪皮的胶原蛋白，它是一种结构蛋白，具有良好的生物相容性和组织相容性。
胶原蛋白在人体中广泛存在，它是构成皮肤、骨骼、肌腱、血管壁等组织的主要成分之一。
I型猪皮胶原因其具有高纯度和优异的性质，因此被广泛应用于医药、保健品和化妆品等领域。
I型猪皮胶原的医药应用I型猪皮胶原在医药领域有着广泛的应用。
首先，它可以用于制备胶原蛋白支架。
胶原蛋白支架是一种生物材料，可以用于修复和重建组织。
它具有良好的生物可降解性和生物相容性，可以在体内逐渐降解，并为新生组织提供支撑和定向引导。
因此，胶原蛋白支架可以用于骨组织修复、软骨修复、皮肤创面愈合等领域。
其次，I型猪皮胶原还可以用于生物医药领域的药物载体。
药物载体是一种用于将药物输送到特定部位的材料。
胶原蛋白作为药物载体具有许多优异的特性，如高稳定性、长期缓释效果、可控释药性等。
通过将药物包裹在胶原蛋白中，可以实现药物的靶向输送，提高药物的疗效和降低副作用。
此外，由于I型猪皮胶原具有良好的生物相容性和生物可降解性，它还可以作为组织工程材料的替代品。
组织工程是一种通过培养细胞或组织工程学技术来修复和重建受损组织的方法。
通过将细胞与胶原蛋白材料结合，可以促进细胞的生长和分化，实现组织的再生和重建。
I型猪皮胶原的保健品应用除了医药应用，I型猪皮胶原还被广泛应用于保健品领域。
胶原蛋白是皮肤的重要成分之一，可提供皮肤的弹性和紧致度。
随着年龄的增长，人体自身胶原蛋白的合成能力会逐渐下降，导致皮肤松弛和皱纹的出现。
因此，通过补充I型猪皮胶原可以提高皮肤的弹性和紧致度，减少皱纹的出现。
此外，I型猪皮胶原还可以促进指甲和头发的生长。
胶原蛋白是构成指甲和头发的重要成分之一，它可以增强指甲和头发的强度和韧性，降低断裂和脆弱的风险。
因此，补充适量的I型猪皮胶原可以改善指甲和头发的健康状况。
I型猪皮胶原的化妆品应用最后，I型猪皮胶原还被广泛应用于化妆品领域。
从四种生物原料中制备高纯度I型胶原的比较
从四种生物原料中制备高纯度I型胶原的比较作者：保毅, 胡蕴玉,毕龙, 孟国林,李丹,白雪东,刘民【摘要】［目的］比较从4种生物原料中制备高纯度I型胶原，以满足骨组织工程应用的需要。
［方法］分别以牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱和猪皮为原料，采用酸性条件下胃蛋白酶限制性酶解法提取I型胶原，并用紫外吸光度、氨基酸分析、SDS-PAGE电泳进行鉴定，计算提取率、纯度，同时与Sigma公司产品进行比较。
［结果］本法所提胶原的最大紫外光吸收波长为230nm，氨基酸分析、电泳鉴定符合I型胶原特征。
牛皮质骨所提胶原纯度最高(96.12％)，优于Sigma公司产品，而牛腱胶原提取率最高(75.34％)，超过常规方法。
［结论］限制性酶解法可以从4种生物原料中制备高纯度、高提取率的I型胶原产品，其中以牛皮质骨胶原最好，具有良好的应用前景。
【关键词】 I型胶原; 组织工程; 制备; 限制性酶解法［Method］Bovine cortical bone, bovine achilles tendon, porcine achilles tendon and porcine skin were splitted into pieces of 0.2-0.5 mm. After being immersed in glacial acetic acid, they were extracted with pepsin. Then the crude products were dissolved, centrifuged, dialyzed and freeze drying to prepare pure collagen type I. The final products were confirmed by absorbance, amino acid analysis and'SDS-PAGE electrophoresis comparing them with the products of Sigma Company.［Result］The wave length of maximum absorbance of the final products was 230 nm, and the amino acid analysis and SDS-PAGE electrophoresis confirmed that the final products were collagen type I. The purity of product extracted from bovine cortical bone was the highest (96.12%) and higher than that from Sigma Company. The extraction rate of bovine achilles tendon collagen was the highest (75.34%).［Conclusion］Collagen type I of higher purity and higher extraction rate can be prepared using a limited enzyme digestion method.And the product from bovine cortical bone is better than the others,which has a promising prospect.Key words：collagen type I; tissue engineering ; preparation ; limited enzymedigestion methodI型胶原是骨基质中的主要有机成分。
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皮质骨I型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备（作者： _________ 单位：___________ 邮编： ___________ ）【摘要】探索一种较理想的皮质骨I型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料。
［方法］以牛皮质骨为原料，经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉。
通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉，经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原，SDS1PAGE 电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征；再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料，扫描电镜观察其内部结构。
［结果］所得胶原经SDS'PAGEl泳、氨基酸分析等方法鉴定符合I型胶原特征；制备的支架材料外观呈圆柱状，内部为孔径均匀平行排列的微管结构，具有仿生效果。
［结论］皮质骨中能够获得纯度较高的I型胶原，可用于胶原材料的制作。
【关键词】组织工程胶原提取神经支架Abstract :］ Objective ］To develop an ideal method for extracting type I collagen from cortical bone and to prepare a collagen 拟gelatin scaffold.［Method］The cortical bone wasdis in tegrated into bone matrix powder in a high speed mill andwas subsequently dehydrated in alcohol,decalcificated in hydrochloric acid and defatted in chloroform:metha nol(1:1,v/v).The ossc ins were extracted using improved peps in digesti on method after the bone matrix powder wasdissolved,ce ntrifuged,dialyzed and lyophilized. Type Icollage n was the n characterized by SDS 拟、PAGE and ami ndlacid composition analysis. The biomaterial was made of type I collagen and gelatin using freeze 拟drying method,and the alignment regularities of microscopic channels and their course directions were observed under the scanning electronic microscope.The size of the micropores and the factor of porosity were also measured. [ Result ] The collagen extracted was con firmed to be type I collage n by SDS)；PAGEa nd amino 拎;acid composition analysis. All the scaffolds looked like circular cyli nder,the microscopic cha nn els were arran ged in parallel manners,and the pore sizes of the channels were uniform.[Conclusion ] Ossein extracted from cortical bone is a real type I collagen that can be applied in the construction of collagen products. Key words : tissue engineering; collagen; extraction; nerve scaffold周围神经缺损后的修复再生和功能恢复一直是神经科学领域的难点和热点。
由于周围神经结构和功能上的特殊性，损伤后大多数情况下无法直接对拉吻合，自体神经移植又有诸多限制，因此寻找一种神经替代物来修复缺损是十分必要的。
近年来，随着组织工程技术的发展，用于神经修复研究的材料品种越来越多。
目前I型胶原蛋白制品为组织工程修复神经研究中应用较多的生物材料之一[1]。
I型胶原通常来自牛腱、鼠尾或皮肤，由于上述组织中含有大量其它种类的胶原和非胶原成分，提取及纯化工艺复杂。
骨中I型胶原含量丰富，占骨基质中有机成分的95%以上，本实验将传统的酶提取法加以改进，提取牛皮质骨中I 型胶原并制备神经支架材料。
1材料与方法1.1骨基质粉的制备取新鲜牛长骨，去除软组织、骨膜、骨端松质骨及骨髓，然后将皮质骨劈成骨块，乙醇(60 %、70%、80%、90%)梯度脱水，液氮冷冻后放入高速组织粉碎机中，粉碎为直径0.6〜2 mm骨粉，持续搅拌下加入甲醇：氯仿(1 : 1, v/v)脱脂48 h，每24 h换脱脂液1次;0.6 mol/L盐酸脱钙84 h，分别于第12、36、60 h换脱钙液，脱钙结束后去离子水洗涤3次备用。
1.2胶原的提取将50 g牛皮质骨基质粉浸在500 ml 0.05 mol /L冰醋酸和500 mg 胃蛋白酶混合溶液中，持续搅拌96 h。
待混合物变为无色、透明、粘稠液体后高速低温离心20 min(10 000 r / min)，以去除未溶解杂质。
其上清即为液态粗制胶原。
在上清中缓慢加入NaCl，搅拌过夜，离心20 min(15 000 r / min)，去上清，沉淀物加入0.5 mol / L冰醋酸溶解，离心20 min(15 000 r / min)，取上清加入5 mol/L NaOH 调pH至7.3，缓慢加入NaCl，搅拌过夜，离心20 min(15 000 r/min)，去上清，沉淀物加入0.5 mol/L醋酸中透析溶解，离心10 min(15 000 r/min)，去沉淀，上清装入透析袋中持续透析72 h，每4 h更换透析液1次。
最终收获无色透明粘性液体，浓缩冻干。
以上液体及操作在4〜7C进行。
1.3支架材料的制备称取样品150 mg、明胶(Sigma公司)75 mg溶于0.05 mol /L冰醋酸溶液，4C条件下搅拌90 min(18 000 r/min)，负压抽真空后于4C 冰箱中过夜，充分混合成凝胶状悬浊液后将其注入长10 cm内径3 mm 的硅胶管中，密封两端，顺轴向以自制微型调速仪以2X 10-5 m / s 的速度浸入冷凝剂中，将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中，于-40 C、100 mTorr条件中冻干48 h，制得干燥成形的胶原蛋白支架材料［2］。
材料用戊二醛交联，60Co消毒密封备用［3］。
1.4胶原的鉴定1.4.1 取样品2卩g溶于420卩l加样缓冲液(1 mol/L Tris拟HCI 缓冲液，10% SDS2%巯基乙醇，50%甘油，微量溴酚蓝)过夜，100C，5min，离心10 min(12 000 r/min) ，取上清20卩l加样，进行SDSX P AGE垂直平板电泳，浓缩胶5%，分离胶8%，电极缓冲液SDSlTris拟甘氨酸系统，浓缩胶电压40 V,分离胶电压80 V, 0.25 % 考马斯亮蓝对以250染色，以牛腱I型胶原标准品(Sigma公司)作为对照。
142 将冻干样品水解后，应用Beckman 121MB型氨基酸自动分析仪进行氨基酸分析。
143用5以2001紫外可见分光光度计测定胶原最大光吸收波长。
1.5支架材料内部扫描电镜观察以扫描电镜观察上述制备的胶原蛋白支架材料横截面和纵切面并测量材料内部微孔的直径。
2 结果2.1选择适当时间点换脱钙液，持续脱钙84 h，可将骨粉中的钙离子含量降到较低水平（图1）。
2.2胶原样品鉴定结果2.2.1提取的样品冻干后呈蓬松的白色海绵状，具有吸潮性（图2）。
2.2.2 SDS拟PAGE电泳结果显示，提取的胶原样品与I型胶原标准品相同（图3）。
2.2.3 最大光吸收波长检验结果样品在230 nm波长处显示较强的光吸收，符合胶原特性。
2.2.4 样品氨基酸分析结果甘氨酸占氨基酸总量的31.12%,羟脯氨酸占氨基酸总量的9.12%,脯氨酸占氨基酸总量的12.85%,羟脯氨酸与脯氨酸之比约0.71，氨基酸构成比符合I型胶原特性（表1）。
表1皮质骨磁针原氨基酸组成2.3扫描电镜观察结果支架材料外观为表面封闭的圆柱状结构，电镜下见纵切面为轴向平行排列的微管结构，横切面上微管结构呈内径均一的蜂巢状分布，孔径在20〜100 a m接近于坐骨神经结构（图4、5）。
3讨论近年来，应用组织工程技术构建种子细胞和具有良好生物相容性的支架材料复合体——人工神经修复外周神经损伤成为研究的重点。
人工神经研究的关键之一在于如何选择合适的支架材料，以便复合种子细胞、神经营养因子从而更好的发挥促神经再生作用。
目前，以天然的细胞外基质为原料制备支架材料成了研究的新方向。
胶原是细胞外基质的主要成分，广泛分布于骨、肌腱、韧带、皮肤、软骨等结缔组织中，约占动物体内蛋白质总量的1/ 4〜1/3,在细胞的分化、运动化趋向、结缔组织修复等方面发挥重要作用，同时具有生物可降解性、低抗原性、低毒性、能诱导细胞再生及易获得性等诸多优点，可参与组织愈合过程，在软骨细胞再生诱导］4］、角膜移植］5］、人工皮肤制备］6］等方面得到广泛应用，应用在周围神经损伤修复中亦能刺激改善神经的再生］7］。
图1钙离子浓度变化图2冻干样品图3样品电泳图谱图4扫描电镜下观察支架材料横切面（X 400）图5扫描电镜下观察支架材料纵切面（X 200）以往胶原的提取多集中在相对易于处理的牛腱、猪皮和鼠尾腱。
由于胶原是一个大的蛋白家族，从上述组织中提取时分型、纯化难度较大，程序复杂，而且耗时较长，易导致胶原变性。
骨胶原的提取纯化报道较少，而骨中有机质90%以上为胶原，主要为I型胶原，有望作为制备I型胶原的重要来源。
作者将传统的酶溶解法加以改进应用于骨胶原的提取，在骨粉颗粒直径、脱脂脱钙时间、酶促溶解、抽提次数等方面加以细化，省去分型、纯化等冗长程序，耗时较短，经济简便。
I型胶原的氨基酸组成中，甘氨酸约占氨基酸总量的1/3;含有羟赖氨酸和羟脯氨酸，一般蛋白质中则不存在羟赖氨酸，羟脯氨酸也很少见；羟脯氨酸与脯氨酸之比约为0.7〜0.8。