A549细胞培养方案——适用于各种细胞培养

A549细胞的培养

A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以1：2～1：3传代培养都是可行的。

一、 [所需溶液]

1，细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)——无Ca、Mg

NACL 8.00g；

KCL 0.20g;

KH2PO4 0.20g;

Na2HPO4 .。12H2O 1.15g

加水至 1 000mL,将PH调至7.4，高压灭菌。

2，胰酶-PBS消化液

结晶胰酶 2.5g;

高压灭菌后的PBS 1000ml

用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，分装备用，放置—20℃保存。

3，细胞培养液：RPMI 1640培养液

二、［细胞的维持和培养］

１，细胞的复苏

（１）准备一个盛有40℃温水的烧杯，从液氮罐中取出存有Ａ５４９细胞的冻存管，放于40℃温水中，用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化（2-3 min）。

（２）在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后打开冻存管，注意动作要轻柔。

（３）加入10ml以上预热的细胞培养液至25cm2培养瓶中。（４）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。

（５）8-10h后，更换新的培养液。

（６）常规传代培养。

２， A549细胞更换新的培养液

（１）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。

（２）用PBS反复冲洗细胞2～3遍。

（３）加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。

（４）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。

３， A549细胞的传代

（１）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。

（２）向已经长满的细胞中加入消化液1ml，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细胞表面2～3遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。

（３）加入1ml消化液，在室温1-2min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后，立即终止消化。

（４）加入5ml预热至37℃的培养液，用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有的底部都被吹到。

（５）吸取一半的细胞悬液，接种到新的25cm2培养瓶中，补足培养液，并且添加10%～20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为5～10ml。

（６）倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。

注意事项：

（１）所有液体在加入细胞瓶前均应预热到37℃。所有液体均应调整PH至7.2左右，均不能超过7.4。

（２）细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过多，否则会损伤细胞。

（３）严格执行无菌操作的要求。

（４）尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤，可多添加些含牛血清的培养液中和。

（５）培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。

４， A549细胞的冻存

（１）消化已生长融合的单层细胞。

（２）用生长液悬浮细胞，并且添加10%的FCS和10%DMSO(二甲基亚砜)。分装在2ml容积的冻存管中。

（３）用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管，放在-70℃冰箱中过夜。

（４）放入液氮中冻存。