植物改良方面的研究及应用

基因工程技术应用植物品质改良进展

1 传统植物品质改良技术

1．1 品种间杂交

世界各国大多数优质植物品种是通过品种间常规杂交的常规育种途径育成的。由于要求所育成的品种适应性良好，并具有丰产、抗病等特性，品质育种往往采取2个以上的亲本问杂交的方式。前苏联的优质春小麦品种萨拉托29，就是通过3次阶梯杂交育成的。美国的优质、高产、抗病品种Lancota则是通过两轮杂交，从后代中选育成的，其籽粒蛋白质含量又显著地高于亲本【1】。

1．2 远缘杂交

植物中的其他种和近缘种属中的有关品质性状存在很大的遗传差异，对小麦品质的遗传改良具有很大的研究利用价值。利用远缘杂交已有不少成功的事例。前苏联全苏植物育种遗传研究所育成的小黑麦品种，其籽粒蛋白质和赖氨酸含量都超过了小麦和黑麦。齐津等【2】从小麦与冰草及滨麦草的杂交中都育成了高蛋白质含量的品种类型。

1．3 诱发变异

诱发变异也是植物品质改良的有效手段之一。通过物理或化学等诱变手段，例如r射线、紫外线或EMS 等处理植株或其单倍体，从而在染色体层面上发生突变畸变，以期获得特异性状。如多倍体植物，其植物的高大肥厚特性，如奇数倍染色体植株的无籽特性，三倍体西瓜。

1 农杆菌参与的植物转化

1 ．1 整株感染在整体植株上造成创伤后把农杆菌接种于创伤面上，或把农杆菌注射到植物体内使其进行侵染转化【3】。这种方法具有较高的转化成功率，可以避开组织培养的过程，对于诱导再生困难的植株，是一条可以选择的途径。

1 ．

2 叶盘法应用于基因转化外植体，是双子叶植物较为常用的简单有效的方法。将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有外源基因的Ti和Ri质粒的农杆菌液进行短期共培养，使外源基因整合进植物基因组中。

1 ．3 原生质体法是指将处于再生壁时期的原生质体与农杆菌一起共培养，在选择培养基上即可得到转化的细胞克隆【4】。优点：得到的转化体一般不会是嵌合体。

2 DNA直接转化

2．1 DNA直接转化法即用裸露的DNA(在5端加上一个启动子，在3端加上终止子)直接转移到植物细胞和原生质体中导致细胞转化的技术。它适用于对农杆菌感染不敏感的植物。

2．2 基因枪法其原理是将DNA包裹于微小的金属钨或金粒的表面，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入受体细胞核并整合表达的过程。选择钨或金作为子弹的原因，在于它们在植物细胞和原生质体中呈现惰性，不会影响植物细胞或原生质体正常的生理活动性。

2 ．

3 电穿孔法( electroporation ) 是在高压电脉冲作用下原生质体的质膜上形成可逆性的瞬间通道，从而发生外源DN A的摄取。电穿孔法对植物细胞不产生毒性，而且转化效率较高，特别适于瞬间表达。但该法存在易造成原生质损伤的缺点。

2．4 显微注射法( microinjection ) 在用进行基因导入时，通常把原生质体或培养的细胞固定在琼脂上，或用聚赖氨酸处理使原生质体附着在玻璃平板上，再进行操作。该方法的优点是转化效率高，无特殊的选择系统。

3 脂质体介导转化

脂质体为人工拟造的类脂与磷脂构成的小体，可将核酸包裹并跨膜转运，免于核酸酶的作用，而保

持核酸的完整性。该法在包装DNA时需短时间超声处理，会使相当多的DNA断裂，所用的材料必须使用具有全能性的原生质作为受体细胞【5】。

4 病毒载体转化

在2 0世纪8 0年代初期开始研究将病毒作为植物基因转移载体的可能性。双链DN A病毒、单元边DNA病毒和RNA病毒在侵染植物后都可以把基因转移到完整的植物体或组织中，并得到表达。这种方法的基因转化效率比较高，但是它的安全性受到质疑，目前主要用于动物的基因转移【6】。

2.4 分子标记辅助选择育种

选择优良的目标性状是植物育种中最重要的环节。要提高选择的效率，最理想的方法就是用分子标记法直接对基因型进行选择，此种方法的应用不仅提高了性状选择的效率，而且提高了准确性，减少了育种过程的盲目性、不确定性、周期性。如果目标基因与某个分子标记紧密连锁,那么通过对分子标记基因型的检测,就能获知目标基因的基因型[7]。孟金陵等[8]认为，通过分子标记辅助选择技术,借助于饱和的分子标记连锁图，对各选择单株进行整个基因组的组成分析,进而可以选出带有多个目标性状而且遗传背景良好的理想个体。到目前为止，利用分子标记辅助选择育种在水稻以及玉米的改良方面应用的比较多，主要是涉及到质量性状的辅助选择和数量性状辅助选择育种。Tankeley[9]利用分子标记在一小果西红柿中标记了两个果重基因，并将其转移到一大果品种，果重提高了31 %。

4 RNAi技术

现今，RNAi技术已被广泛应用于植物品质的改良，如改善植物营养价值方面的研究，使得满足人们对植物的品质需求成为可能。应用RNAi技术下调两个主要脂肪酸脱氢酶基因(硬脂酰载体蛋白脱氢酶和油酰卵磷脂脱氢酶) 的表达，从而将棉籽油中的高油酸和高硬脂含量水平降低[10]。利用RT-PCT技术克隆了油菜PEP基因片段并构建了对应于PEPase基因的RNAi载体，以利用RNAi技术抑制PEPASE基因的表达，使代谢流偏向油脂合成，从而提高油菜籽粒中的油脂含量[11]。咖啡是世界上主要的饮料之一，但咖啡植物里咖啡因含量多，饮用后易引起心慌、失眠、过度兴奋等症状，对于高血脂患者来说容易使血压升高并诱发心脏病。虽然也可以用一些物理和化学方法来降低咖啡中咖啡因的含量，但这不仅增加成本而且咖啡的部分风味也丧失了[12]。利用RNAi技术对控制咖啡因合成的基因进行抑制，使材料中的咖啡因含量降低了50％—70％。采用果实特异启动子结合RNAi技术抑制番茄内源光形态，建成调节基因DET的表达，结果显示再生植株中DET1的表达下降，类胡萝卜和类黄酮含量明显升高，而果实的其他品质参数没有发生大的改变[13]。这些均表明利用器官特异基因的沉默可以改善植物营养价值．另有研究者发现利用RNA i来沉默番茄的多聚半乳糖醛酸酶(该酶在果实成熟时能消化细胞壁)基因[14]，结果番茄可以推迟采摘期，其香味变得更浓。

RNAi技术可针对植物的一些表型进行改良，改善植物经济品质价值。日本生物研究所使用RNAi 技术成功地诱导花色和类黄酮生物合成的关键酶查尔酮合成酶(CHS)基因沉默，成功地将花由原来的蓝色变为白色和粉色，创造了新的商品花卉[15]。澳大利亚和日本的研究者通过去除玫瑰中Enzyme dinydioflavonal reductase (DRF)基因，培育出了世界上唯一的蓝玫瑰[16]。这些都显示了RNAi技术在调节花卉的花色等观赏器官方面所具有的独特的经济价值。

RNAi除具有高效性、特异性等优点外，还有一大优点，即它能够调节基因表达程度[17]，而且可以获得抑制目标基因的特定程度．我们可以通过使用大量同源于目标基因的相近或远缘种“设计”基因表达的抑制程度．如水稻突变系LGC-1(LOW GLUTELIN Content-1)，研究中由RNAi引起的同源依赖型抑制现象，能降低麦谷蛋白表达水平，给不能消化麦谷蛋白的肾病患者带来了福音[18]。这也是第一个商品化的RNAi品种．