ELISA步骤及注意事项
ELISA原理方法操作及注意事项
ELISA原理方法操作及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测目标分子的存在和浓度。
ELISA方法基于抗原-抗体反应的原理，通过酶标记的二抗或底物来标记和检测特定抗原或抗体的结合。
1.涂覆：将特异性抗体或抗原溶液加入微孔板的孔中，使其在孔壁上吸附，形成“涂覆抗原”或“涂覆抗体”的微孔板。
孔顶部通常需要使用一个覆膜或负压干燥来防止蒸发。
2.阻断：将孔中添加阻断剂如牛血清白蛋白（BSA）或乳糖，以防止非特异性结合。
3.样品加入：将待测样品加入微孔板，并充分搅拌孔内溶液，以使潜在的目标分子与涂覆的抗原或抗体结合。
4.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
5.次级抗体加入：加入酶标记的二抗，以与结合到涂覆抗原或抗体的目标分子结合。
这种二抗可以是对目标物质抗体的抗体，也可以是对使用的抗原的抗体。
6.洗涤：使用缓冲溶液洗涤孔内溶液，以去除未结合的物质。
7.底物加入：加入底物（通常为染色底物），以使酶标记的二抗产生可观察的信号。
底物反应产生的颜色或荧光强度与目标分子的浓度成正比。
8.停止反应：加入停止剂如酸，以停止底物反应，并防止进一步的信号增加。
此步骤通常在一定时间后进行。
1.注意对ELISA试剂的保存和使用条件，避免试剂的过期或不适当的保存导致结果偏差。
2.样品收集和处理方面要仔细。
避免样品的污染和交叉污染。
根据检测的目标分子选择适当的样品收集方法和处理方法。
3.在操作过程中，严格控制操作温度和时间。
不同的ELISA方法和试剂可能需要不同的温度和时间条件。
4.遵循相关的操作规程和实验室安全准则，使用个人保护装备，确保实验室安全。
5.在操作过程中，要准确记录每个步骤的时间、温度和取样量等信息，以便进行准确的数据分析和结果解释。
6.ELISA的结果通常是通过测量光密度或荧光强度来表达的，因此在结果分析时需要针对每个样品和对照进行准确的光度或荧光测量。
ELISA步骤试剂及注意事项
ELISA步骤试剂及注意事项ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生命科学、医学和工业领域的实验技术，用于检测和测定生物样本中的抗原或抗体。
以下是ELISA的一般步骤、试剂及注意事项的详细介绍。
一、ELISA步骤：1.样品制备：首先，需要将待测样品（血清、细胞上清、组织提取物等）制备成特定体积的稀释液，以便进行ELISA实验。
2.涂布：将测定物（抗原或抗体）加入固相（例如，微孔板或磁珠）上，使其与固相表面发生特异性结合。
3.阻断：将非特异性结合位点阻断，以降低假阳性结果。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）和干奶粉等。
4.孵育：将样品（稀释液）加入到涂布的微孔板孔中，与固相上的结合位点结合，并孵育一定时间，促使特异性结合反应进行。
5.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
6.探针反应：加入特定的称量标记的抗体或标记化的抗原，使其与待测样品特异性结合，并与固相上的结合位点结合。
7.洗涤：反复用洗涤缓冲液洗涤孔内的非特异性结合物质，以去除干扰因素。
8.显示：加入染色剂或底物，使其与标记物发生特异性反应，并显示颜色或荧光。
9.终止反应：加入终止液停止底物与染色剂的反应。
10.读板：使用酶标仪或光度计测量吸光度，在特定波长下测量显示产物的光密度，并根据标准曲线或控制组数据计算待测样品中特定抗原或抗体的浓度。
二、常用ELISA试剂：1.涂布缓冲液：主要用来将测定物溶解在其中，涂布在微孔板或磁珠上。
2.试样稀释液：用于制备待测样品的稀释液。
3.标准物：用于制作标准曲线，以确定待测样品中抗原或抗体的浓度。
4.阻断剂：用于封闭非特异性结合位点，以降低假阳性结果。
5.洗涤缓冲液：用于去除孔内非特异性结合物质。
6.探针：用于特定抗体或抗原的检测，通常经过标记，如HRP（辣根过氧化物酶）或荧光染料等。
7.显示试剂：用于显示标记物与底物的特异性反应，如碱性磷酸酶底物或H2O2和TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二唑基）等。
ELISA
ELISA实验指导1．实验操作步骤：（1）包被：用包被缓冲液稀释PC，使其终浓度为20μg/mL，每孔100μL于96孔板（ELISA用），4℃孵育过夜。
（2）清洗：取出96孔板，倒置，甩掉孔中液体，并在纸上使劲拍掉黏附的剩余液体。
每孔加大约250μL的清洗液，37℃摇床中速孵育5min*3次，每次都要用力甩掉孔中液体。
（3）封闭：每孔加入100μL 封闭液，37℃摇床中速孵育1h。
（4）清洗：重复（2）（5）上样：LB稀释两倍上样，每孔100uL，37℃摇床中速孵育1h（6）清洗：重复（2）（7）一抗：将anti-strep按1：1000稀释比例稀释到1% BSA-TBS-Ca中，每孔100uL，37℃摇床中速孵育1h。
（8）清洗：重复（2）（9）二抗：按照1:6000将anti-mouse稀释到1% BSA-TBS-Ca中，每孔100uL，37℃摇床中速孵育1h。
（10）清洗：重复（2）（洗第三次的时候加入H2O2）（11）显色：稀释后的TMB显色，每孔100uL，室温避光孵育20min 左右。
（12）终止：每孔加100μL 1M 硫酸，显色终止。
（13）吸光值：终止后立即放入酶标仪检测吸光值（450nm，570nm）。
（14）数据处理：去除对照背景，计算实验结果。
2．实验试剂：（1）包被缓冲液：100mM Na2CO3，100mM NaHCO3，将两者分别配好，再将两者相互调配至pH9.6（2）清洗液：0.02% NP-40+TBS-Ca（10mM Tris，140mM NaCl，2mM CaCl2，pH 7.4）（3）封闭液：1%BSA，需用TBS-Ca 配置。
（4）样品处理：①非Ca螯合：50μL样品+10μL 10%BSA+40μL TBS-Ca②Ca螯合：50μL样品+10μL 10%BSA+10μL 100mMEDTA+30μL TBS-Ca（5）TMB：100μM，1mL DMSO，使用前需要稀释（1:100），稀释液为0.2M CH3COONa-柠檬酸，调至pH4.0，第三次洗的时候，按1：4229加入H2O2 （终浓度约为3mM）。
ELISA操作原理、步骤及注意事项
ELISA操作原理、步骤及注意事项优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
1 标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液、分泌物和排泄物）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。
有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。
大部分ELISA检测均以血清为标本。
血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。
制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。
除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。
在ELISA中血浆和血清可同等应用。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。
如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。
如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。
一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。
冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。
混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。
反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。
保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见3.2.4）。
2 试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。
自配的缓冲液应用pH计测量较正。
从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。
试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3 加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。
加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析特定抗原或者抗体的存在。
本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA实验步骤，以确保实验的准确性和可重复性。
二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 酶标仪3. 微量移液器和相应的可调移液器架4. 基质溶液（PBS等）5. 抗原或者抗体样品6. 酶标记的二抗7. 洗涤缓冲液8. 底物溶液9. 住手液三、实验步骤1. 准备工作a. 将96孔ELISA板放置在可调移液器架上。
b. 准备基质溶液，并将其加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，以避免溶液的蒸发。
2. 样品处理a. 将待测样品加入ELISA板的相应孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使样品均匀分布。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
3. 一抗孵育a. 将酶标记的一抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使一抗均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
4. 洗涤步骤a. 将洗涤缓冲液加入ELISA板的每一个孔中，每孔200μL。
b. 轻轻拍打ELISA板，使洗涤液充分覆盖孔底。
c. 倒掉洗涤液，重复以上步骤3次。
5. 二抗孵育a. 将酶标记的二抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使二抗均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
6. 洗涤步骤a. 重复步骤4中的洗涤步骤，以去除未结合的二抗。
7. 底物反应a. 将底物溶液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使底物均匀覆盖样品。
c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。
8. 反应住手a. 在适当的反应时间后，将住手液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在和浓度。
本文将介绍ELISA的操作规程，包括试剂准备、样品处理、板上反应、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，选择适当的缓冲液配方。
常用的缓冲液有PBS、TBST等。
按照配方将所需试剂溶解于适当的体积的去离子水中，并进行调节和混合。
确保所有试剂的pH值和浓度符合实验要求。
2. 标准曲线的制备：准备一系列已知浓度的标准样品，按照实验设计的需求进行稀释。
标准样品的浓度应该覆盖实验样品的范围，并且至少包含一个空白对照。
3. 酶标板的涂覆：根据实验需要，选择合适的酶标板（如96孔板），将需要检测的抗原或者抗体溶解在适当的缓冲液中，按照要求的浓度将其加入到酶标板的孔中。
尽量避免气泡的产生，并确保涂覆均匀。
三、样品处理1. 样品采集：根据实验目的，选择合适的样品类型（如血清、尿液、细胞上清等），并进行采集。
确保样品的采集过程符合规范，避免污染和损坏。
2. 样品稀释：根据实验要求，将样品进行适当的稀释。
通常，样品的初始浓度较高，需要进行多次稀释以使其浓度在标准曲线范围内。
3. 预处理：根据实验需求，对样品进行预处理，如去除杂质、离心沉淀等。
确保样品的处理过程不会影响到所需的分析结果。
四、板上反应1. 标准样品的加入：将标准样品按照实验设计的要求加入到酶标板的孔中。
每一个标准样品应该有至少两个孔进行重复测量，以提高结果的可靠性。
2. 样品的加入：将稀释后的样品加入到酶标板的孔中。
同样，每一个样品应该有至少两个孔进行重复测量。
3. 阳性和阴性对照的加入：为验证实验的准确性，加入阳性和阴性对照。
阳性对照顾该包含所需的抗原或者抗体，而阴性对照则不含。
4. 孔板的封闭：将酶标板封闭，避免样品的蒸发和污染。
可以使用密封膜或者盖板进行封闭。
五、洗涤1. 洗涤缓冲液的配制：根据实验要求，配制适当的洗涤缓冲液。
ELISA测定操作中的注意事项
ELISA测定操作中的注意事项ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的工具，用于测定病毒、细菌、蛋白质和其他生物分子在生物样本中的存在量。
ELISA检测方法操作相对简单，但仍然需要遵循一定的操作步骤和注意事项。
以下是ELISA测定操作中需要注意的几个关键点：1.准备工作：在进行ELISA测定之前，必须仔细准备实验室，并确保所有需要的试剂和仪器设备都得到妥善处理。
所有试剂应按照说明书储存和使用，并检查试剂有效期。
2.样品处理：样品的处理方法会因样品类型的不同而异。
无论是血清、尿液、细胞上清液还是其他类型的样品，都需要进行预处理以提取目标分析物。
必须注意避免样品污染和误导，以避免结果扭曲。
3.标准曲线制备：标准品的浓度应按照所需浓度系列依次配制。
标准曲线对于测量未知样品中目标物质的浓度至关重要。
应准确测量并稀释标准品，以保证标准品在适宜阶段内。
4.试板板块的涂覆：试板板块在试验中起到一个基础角色，对于测定结果至关重要。
在涂布之前，应完全清洗和干燥，以确保涂覆的均匀。
涂覆的目标抗体或抗原浓度也应该掌握好，以便获得准确的结果。
5.反应时间和温度：在试验进行过程中，应遵循说明书上的指导，严格控制每个反应的时间和温度。
反应时间和温度的变化可能会导致结果不准确或可读性差。
6.洗涤的重要性：洗涤步骤是ELISA测定中用来去除未结合的试剂或物质的重要步骤。
洗涤过程必须彻底，在每次洗涤中使用足够的洗涤缓冲液来确保彻底去除未结合物质。
7.底物的选择和反应停止：底物的选择对于结果的解读和显示至关重要。
不同的底物可能在不同的波长下显示颜色。
在选择底物时应确认设计好测定的波长。
同时，在底物反应后需要及时停止反应，使反应停止时间相对一致。
8.数据分析：9.消毒与废液处理：10.质量控制：为了确保ELISA测定的结果准确可靠，应进行质量控制。
包括使用质控样品、校准标准品和内部参比物来保证所得结果的精确性和可重复性。
总结起来，ELISA测定是一种有效的生化实验方法，但在操作过程中需要注意细节和实验操作的准确性。
elisa法检测步骤
elisa法检测步骤ELISA法，即酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用于检测特定抗原或抗体的方法。
它基于免疫学原理，通过特异性抗体与抗原结合并利用酶的催化作用产生可测定的信号，从而实现对目标物质的定量检测。
下面将介绍ELISA法的基本步骤以及注意事项。
1. 抗原或抗体的固定需要将待测抗原或抗体固定在固相载体上，常用的载体有微孔板等。
固定的目的是为了使待测物能够与特异性抗体或抗原结合，并保持其稳定性。
2. 阻断非特异性结合位点在固定的抗原或抗体上，加入一种阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼胶蛋白（Gelatin），以防止非特异性结合。
3. 特异性抗体的结合将待测样品加入到固定的抗原上，使其中的抗原与特异性抗体发生结合反应。
特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其选择应根据具体实验需求。
4. 酶标记二抗的结合经过特异性抗体的结合后，再加入酶标记的二抗。
酶标记的二抗与特异性抗体的结合形成免疫复合物。
5. 酶底物的加入在免疫复合物形成后，加入酶底物。
酶底物与酶标记的二抗结合后，酶会催化底物的反应，产生可测定的信号。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
6. 反应停止根据酶底物的选择，选择合适的反应停止液，使酶催化反应停止。
常用的反应停止液有硫酸或碳酸氢钠。
7. 信号检测将停止反应后的溶液转移到酶标仪或光度计中，测定产生的信号强度。
ELISA法可以通过颜色反应或发光反应来进行信号检测。
ELISA法作为一种常用的检测方法，在临床诊断、生物医学研究和生物工业等领域都有广泛应用。
但在进行ELISA实验时，还需要注意以下几点：1. 严格控制实验条件，包括温度、时间和pH值等，以确保实验结果的准确性。
2. 选择合适的阳性和阴性对照，以验证实验的可靠性和敏感性。
3. 遵循操作规范，注意实验操作的无菌和无污染。
4. 合理选择稀释倍数，以保证实验结果在检测范围内。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immuno sorbn ent Assay)的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELI SA间接法。
(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量分析生物样本中的特定抗原或者抗体。
本操作规程旨在提供详细的步骤和指导，确保ELISA实验的准确性和可重复性。
二、实验材料准备1. 缓冲液：根据实验需求选择合适的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或者TBS（三氯甲烷缓冲液）。
2. 抗原或者抗体：根据实验目的选择合适的抗原或者抗体，并进行适当的稀释。
3. 酶标记的二抗：根据实验需求选择合适的酶标记的二抗，如HRP（辣根过氧化物酶）或者AP（碱性磷酸酶）。
4. 底物：选择合适的底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）或者ABTS（2,2'-联氨基二乙基三乙酸）。
5. 住手液：根据实验需求选择合适的住手液，如2M硫酸或者2M盐酸。
三、ELISA实验步骤1. 板涂覆a. 取ELISA板，将每一个孔加入适量的抗原或者抗体，通常为100-200ng/mL。
b. 将板封闭剂（如BSA或者牛血清白蛋白）加入每一个孔中，封闭非特异性结合位点。
c. 在4℃下孵育过夜，或者在室温下孵育2小时。
2. 样本处理a. 采集待测样本，如血清或者细胞上清。
b. 根据实验需求对样本进行适当的稀释。
c. 加入样本到孔中，每一个孔加入适量的样本，通常为50-100 μL。
d. 在室温下孵育1小时。
3. 二抗结合a. 弃去孔中的样本，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次，每次洗涤时间为1-2分钟。
b. 加入酶标记的二抗到每一个孔中，每一个孔加入适量的二抗，通常为100-200 ng/mL。
c. 在室温下孵育1小时。
4. 底物反应a. 弃去孔中的二抗，并用洗涤缓冲液洗涤孔3次。
b. 加入适量的底物到每一个孔中，通常为100-200 μL。
c. 在室温下孵育适当的时间，观察颜色的发展。
5. 反应终止a. 加入适量的住手液到每一个孔中，通常为50-100 μL。
b. 轻轻摇晃板，确保住手液均匀混合。
ELISA原理方法操作及注意事项
ELISA原理方法操作及注意事项酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测特定物质的存在和浓度。
ELISA基本原理是利用抗体和抗原之间的特异性结合来检测目标分子，通过酶的催化作用产生可定量的信号，从而实现对目标分子的检测。
ELISA方法操作简单、灵敏度高，广泛应用于医学、生物化学、环境监测等领域。
ELISA方法的基本原理是：首先，在试验板上涂覆抗原或抗体，在特定条件下，待分析的样品中的靶分子与已固定在板上的抗原或抗体发生特异性结合；接着加入配制好的检测抗体，检测抗体中含有特定酶，与靶分子结合形成抗原-抗体-酶复合物；加入底物，酶作用产生信号物质以定量检测目标物质的浓度。
1.准备试验板：将试验板中的孔涂覆抗原或抗体，然后将孔洗涤去除未结合的抗原或抗体。
2.加样：加入待检样品，待靶分子与抗原或抗体结合后，洗涤去除未结合的物质。
3.加检测抗体：加入检测抗体，与已结合的靶分子形成特异性结合，洗涤去除未结合的抗体。
4.加底物：加入底物，酶催化底物形成产物，产物的量与目标物质的浓度成正比。
5.停止反应：加入停止液终止酶的催化作用。
6.读板测定：用酶标仪测定产生的信号物质的光密度，根据标准曲线计算出目标物质的浓度。
1.实验前要认真准备实验物品和试剂，保证试验仪器和试剂的良好状态。
2.试验过程中要注意严格按照操作规程进行，避免污染和交叉污染。
3.操作过程中要注意操作手法轻柔，避免样品的损伤或渗漏。
4.样品处理要小心，确保样品完整性和纯度，避免因样品质量引起误差。
5.洗板操作要彻底，确保去除未结合的物质，避免干扰信号的产生。
6.实验过程中要注意仪器的准确校准，避免因仪器误差导致结果不准确。
7.实验结束后要及时清洗、消毒实验器具和废弃化学品，避免环境污染和安全事故发生。
总之，ELISA方法是一种简单、灵敏和可靠的生物化学分析方法，广泛应用于科研和生物医学领域。
在进行ELISA实验时，要严格按照操作规程进行，注意操作的细节和注意事项，保证实验的准确性和可靠性。
ELISA检验方法-试验步骤
【检验方法】1.试验前准备（1）缓冲液使用前用蒸馏水或去离子水5倍稀释每瓶样本浓缩缓冲液，最终稀释体积为100ml。
冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。
（2）洗液使用前用蒸馏水或去离子水50倍稀释每瓶洗板浓缩缓冲液，最终稀释体积为1000ml。
冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。
（3）样本检测前，将所有病人的样本用样本缓冲液1:100稀释。
因此在聚苯乙烯板上应混有10μl的样品和990μl的样品缓冲液。
质控品不需要稀释。
2.试验步骤（1）按需要准备好足够微孔反应板条。
（2）用100μl移液器把质控品和稀释后的病人样本加入到微孔中。
（3）在室温（20-28℃）温育30分钟。
（4）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。
（5）吸取100μl每份酶结合物分加到微孔中。
（6）在室温下温育15分钟。
（7）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。
（8）吸取100μl TMB底物溶液加入到微孔当中。
（9）在室温下温育15分钟。
（10）在每个微孔中加入100μl终止液，在室温下温育5分钟。
（如果酶标仪为读数之前震荡方式可不经5分钟温育后直接进行读数）（11）在450nm波长读取光密度读数并计算结果，如果采用双波长测定，参考波长为600-690nm。
3.程序注意事项（1）试剂的组分应在有效期内使用。
（2）试剂盒各组分不能互换。
（3）所有的实验材料应在室温（20-28℃）下操作。
（4）为了得到稳定和连续性的结果，在测试之前要准备好所有的检测样本，一旦测试开始就不要中断。
（5）严格按标准检测顺序进行检测分析。
（6）使用刚稀释的新鲜样本。
（7）所有的试剂和样本都要加入到微孔底部。
（8）不同样品和不同试剂之间要更换枪头以避免污染。
（9）彻底清洗微孔、除去最后的洗涤缓冲液对得到一个良好结果是非常重要的。
（10）所有的温育过程必须精确计时。
（11）质控品要定期进行检测以保证试剂和检测结果的可信性。
ELISA的操作
ELISA的操作与注意事项一、阻断ELISA1、液相阻断ELISA（代表试剂盒：口蹄疫O型、ASIAⅠ型、A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒：兰州兽医研究所生产）1.1原理：①兔抗口蹄疫血清+病毒抗原（被检血清与病毒抗原反应后病毒抗原剩余）+豚鼠抗口蹄疫血清+兔抗豚鼠酶标结合物+底物显色+终止液+读数（OD值，颜色越深OD值越大）。
颜色的深浅与病毒抗原剩余量成正比，病毒抗原剩余多，则与之反应的被检血清的抗体效价低，反之，病毒抗原剩余少，则与之反应的被检血清的抗体效价高。
因此，随着被检血清的递倍稀释，血清效价逐渐降低，与被检血清反应的病毒抗原剩余逐渐增多，颜色也逐渐加深。
②兔抗口蹄疫血清+被检血清（被检血清与病毒抗原反应后被检血清剩余），则反应终止，以后加入的试剂随着洗板被清洗，最终无颜色反应，则说明被检血清抗体效价高。
因此，反应颜色越浅则抗体效价最高，颜色的深浅也抗体的效价成反比。
1.2 操作过程1.2.1提前一天准备工作：①稀释血清：使用血清稀释板（U型96孔板），常用稀释布局如下图：按图示加入相应量的PBST,吸取12.5ul被检血清和50ul阴、阳性血清于相应孔中，将待检血清和阴、阳性血清做2倍连续稀释，然后再加入50ul的病毒抗原对照，病毒抗原对照孔加入100ul病毒抗原对照，这时，除去空白孔，所有孔均为100ul体系。
用包被缓冲液稀释口蹄疫兔抗血清至工作浓度，将稀释后的口蹄疫兔抗血清加入ELISA板中，每孔加50ul,震荡后使包被液布满整个孔底，封板，在室温条件下过夜。
1.2.2 第二天工作（严格按说明书操作）洗ELISA板→转移血清稀释板上的病毒抗原与血清反应液（按照稀释血清布局图的格式相应的转移至ELISA板上）→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的豚鼠抗血清→孵育60分钟→洗ELISA板→加入稀释好的兔抗豚鼠酶结合物→孵育60分钟→洗ELISA板→加入底物（现加入相应量的H2O2）→孵育15分钟→加终止液→读数→结果判定。
酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附（ELISA）实验具体步骤及详细说明酶联免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
（2）研究抗酶抗体的合成。
（3）显现微量的免疫沉淀反应。
（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。
本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。
因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。
我们用在霍乱肠毒素的测定。
HbSAg及HbS的测定。
具体步骤一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。
二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。
四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。
六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。
八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。
九、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。
注意事项1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。
elisa操作步骤及注意事项
elisa操作步骤及注意事项以elisa操作步骤及注意事项为题，本文将为大家介绍elisa（酶联免疫吸附测定法）的操作步骤和注意事项。
一、操作步骤1. 准备工作在进行elisa实验前，需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶标板、试剂盒、洗涤缓冲液、底物溶液、阻断缓冲液等。
同时，需要对实验室台面和仪器进行消毒，并佩戴好实验手套和口罩，以确保实验的准确性和安全性。
2. 样品处理将待测样品（如血清、尿液、细胞培养上清液等）和对照样品放置在室温下静置，使其达到室温后，进行稀释处理。
通常情况下，待测样品需要按照一定比例进行稀释，以确保其浓度处于检测范围之内。
3. 酶标板涂覆将酶标板中的亲和素或抗体溶液加入到孔板中，然后将其在4℃下静置过夜，使亲和素或抗体能够均匀地吸附在酶标板上。
4. 标准曲线制备将标准品按照一定比例稀释，以制备出一系列浓度递增的标准品溶液。
然后将这些标准品溶液依次加入已涂覆的酶标板孔中，孔位之间要保持一定的距离。
5. 样品孔加样将样品溶液加入到酶标板的样品孔中，注意每个孔的加样量要保持一致。
为了保证实验的准确性，通常会设置阳性对照孔和阴性对照孔，以验证实验的可靠性。
6. 孔板洗涤使用洗涤缓冲液对酶标板进行洗涤，去除未结合的物质和杂质。
洗涤时要注意洗涤液的温度和洗涤次数，以确保洗涤的充分彻底。
7. 酶标记物加入将酶标记的二抗或酶标记的亲和素加入到酶标板的孔中，使其与靶分子结合。
然后，将酶标板置于恒温摇床上，进行孵育反应，使酶标记物与靶分子发生特异性结合。
8. 反应终止通过加入反应终止溶液，使酶标记物的酶活性停止，并终止酶标记物与靶分子的结合。
终止溶液的选择要根据实验所使用的底物和酶标记物来确定。
9. 读板测定使用酶标仪或多功能酶标仪对酶标板进行测量，测定底物的反应产物的吸光度。
根据吸光度值，可以计算出样品中靶分子的浓度。
二、注意事项1. 严格控制实验条件在进行elisa实验时，需要严格控制实验条件，包括温度、湿度、时间等。
elisa检测流程
elisa检测流程Elisa检测流程Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验室检测方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度。
它具有高灵敏度和特异性，被广泛应用于医学、生物学、生物技术等领域。
本文将介绍Elisa检测流程的详细步骤和注意事项。
一、实验前准备在进行Elisa实验之前，需要准备试剂、标准样品和实验器材等。
试剂包括抗体、抗原、辅助试剂（如酶标底物、底物缓冲液等）等。
标准样品是已知浓度的抗体或抗原，用于建立标准曲线。
实验器材包括酶标板、离心管、试管、移液器等。
二、酶标板上样1. 将酶标板中的每个孔分别加入待检测样品、标准样品和阴性对照，每个样品重复3次，以确保结果的准确性。
2. 将加入样品的酶标板在室温下孵育一段时间，使样品中的抗体或抗原与酶标板中的特异性抗体或抗原结合。
三、洗涤1. 轻轻倾斜酶标板，将孔内的液体倒出。
2. 用洗涤缓冲液洗涤酶标板中的每个孔，洗涤次数根据实验要求而定，一般为3-5次。
3. 每次洗涤后，用吸球吸干酶标板中的液体，避免孔内残留的液体影响后续步骤的准确性。
四、添加检测抗体1. 加入特异性检测抗体，使其与已经固定在酶标板上的抗体或抗原结合。
2. 孵育一段时间，使检测抗体与酶标板上的复合物形成。
五、洗涤重复第三步骤，将酶标板中的非特异性结合物洗去，保留特异性结合物。
六、添加底物1. 加入底物缓冲液和酶标底物，使其与酶标板上的复合物发生反应。
2. 孵育一段时间，使底物转化为可检测的产物。
七、终止反应加入终止液，停止底物的反应。
终止液的选择根据酶标底物的性质而定。
八、测量结果使用酶标仪或光度计测量酶标板中每个孔的吸光度值。
根据吸光度值可以计算出样品中抗体或抗原的浓度。
九、结果分析根据标准曲线和吸光度值，可以确定样品中抗体或抗原的浓度。
同时，还可以根据阳性对照和阴性对照的结果，判断样品是否阳性或阴性。
十、实验注意事项1. 严格按照实验操作规范进行操作，避免污染和误差。
2. 注意试剂的保存条件和有效期，避免使用过期或变质的试剂。
ELISA实验原理方法仪器流程图和注意事项分析
ELISA实验原理方法仪器流程图和注意事项分析ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），即酶联免疫吸附法，是一种常用的免疫学检测方法。
该方法通过检测抗原与抗体间的特异结合反应来确定样品中特定抗原或抗体的存在与数量。
ELISA技术广泛应用于生物医学和生物化学领域，如病原微生物检测、药物筛选、分子生物学等。
一、ELISA实验的原理方法：1.抗原或抗体的固定：在试验板上的孔中固定特定的抗原或抗体。
这样，待测样品中的特定抗体或抗原与固定的分子结合，形成复合物。
2.特异性抗体或抗原的添加：将待测样品加入试验孔中，特异性的酶标记抗体或抗原与复合物结合形成特异结合。
3.酶标记抗体或抗原的添加：在第二步形成的特异结合物上加入酶标记抗体或抗原，使其与特异结合物再次发生反应。
4.酶标记分子的检测：添加底物，通过底物的转化反应，观察酶标记物的生成并测定其中的酶活性。
底物催化生成的产物含有染色体，可以用光谱仪检测反应的光密度。
5.检测结果的判定：根据光密度的变化来判断待测样品中特定抗体或抗原的含量，常用的方法包括比色法、荧光法和化学发光法等。
二、ELISA实验的仪器：1.酶标仪或光谱仪：用于测定酶标物产生的光密度或荧光信号。
2.孵育箱：提供恒定的温度和湿度条件，进行酶反应过程。
3.洗板机：用于洗涤试验板以去除非特异性结合部分。
4.加液器：用于添加试剂和样品。
5.显微镜：用于观察试验结果。
三、ELISA实验的流程图：1.将特定抗原或抗体固定在试验板上的孔中。
2.加入待测样品，并与固定的抗原或抗体反应。
3.洗涤试验板，去除非特异性结合的物质。
4.加入酶标记抗体或抗原，形成特异结合。
5.洗涤试验板。
6.加入底物，观察酶标物的生成并测定其酶活性。
7.根据底物转化产物的光密度变化，判定待测样品中特定抗体或抗原的含量。
四、ELISA实验的注意事项：1.使用纯净的试剂和无菌的操作条件，以避免实验结果的偏差。
ELISA质量控制
ELISA质量控制质量控制是ELISA实验的重要环节，通过对质量控制的严格监测，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文档将详细介绍ELISA实验的质量控制步骤和注意事项。
⒈质量控制的目的和意义⑴目的质量控制的目的是评估实验的准确性和可靠性，确保实验结果的稳定性，并及时发现和解决潜在的问题。
⑵意义质量控制可以提高实验数据的可比性和可靠性，减少批次间的变异性，同时也可以帮助实验人员发现实验中存在的系统性误差并进行纠正。
⒉质量控制步骤⑴样本质控⒉⑴阳性质控选择已知含有目标物质的阳性样本，将其作为质控样本，在每次实验中进行测试，用于评估实验的准确性。
⒉⑵阴性质控选择不含有目标物质的阴性样本，将其作为质控样本，用于排除假阳性结果的可能性，评估实验的特异性和背景噪音等因素。
⑵标准曲线质控使用已知浓度的标准物质（多点标准曲线）来绘制标准曲线，在每次实验中进行测试，用于评估实验的灵敏度和线性范围。
⑶反应质控每次实验中应加入反应质控组，包括已知值的阳性和阴性质控样本，用于评估实验的准确性和稳定性。
⒊质量控制的注意事项⑴实验环境的控制确保实验室环境的温度、湿度和洁净度符合要求，避免外界因素对质控结果产生干扰。
⑵质控样本的管理正确储存质控样本，避免重复冻融导致样本质量的变化，严禁使用过期或异常的质控样本。
⑶标准物质和试剂的选择和储存选择质量稳定、纯度高的标准物质和试剂，并按照要求正确储存，避免质量变化对结果的影响。
⑷实验仪器的维护和校准定期对实验仪器进行维护和校准，确保其正常运行和测量准确性。
附件：⒈质量控制样本记录表⒉实验室环境监测记录表⒊标准物质和试剂管理记录表法律名词及注释：⒈标准物质：一般指用于测定、校准和质量控制的物质，具有一定的准确度和可追溯性。
⒉线性范围：指实验方法在一定浓度范围内的线性关系，用于评估实验方法的测量范围和灵敏度。
⒊潜在问题：指在实验过程中可能出现的但尚未被察觉的问题，可能对实验结果产生潜在影响。
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1.蛋白包板：选择合适的蛋白包被浓度梯度，计算上样体积并用包被液稀释（50 μl/孔）。
2. 4 ℃过夜或者37 ℃孵育2 h。
3.用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
4.封闭：
（1）新配1～2% BSA或5% 脱脂奶粉（都用PBS配制）
（2）上样量100μl/孔
（3）37 ℃孵育1～2 h
（4）作用：封闭未被蛋白结合上的位点，防止待测抗体与板上空白位点的结合，减少非特异性反应。
5．用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
6. 封闭期间完成一抗的浓度梯度选择和稀释:
（1）用新配1% BSA 对一抗进行稀释（BSA可以中和一抗中可能存在的抗BSA的抗体，降低非特异性反应），计算所需稀释液体积后配制。
（2）上样量50μl/孔
（3）空白对照和阴性对照孔加等体积PBS
（4）37 ℃孵育1 h
7．用PBST洗涤3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
8. 一抗孵育期间配制酶标二抗稀释液
（1）用新配1% BSA进行稀释，计算所需稀释液体积后配制（一般1:5000）
（2）上样量50μl/孔
（3）阴性对照孔也加等体积二抗稀释液
（4）37 ℃孵育45min～1 h(同一批次二抗孵育时间必须固定，如1h)
9. 用PBST洗涤3～4次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
10.显色：
（1）A液和B液等体积混合，在使用前需在室温下放置30 min。
（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板（A：B= 5ml: 5ml）
（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积显色液
（4）显色液上样速度一定要快速并保持匀速
（5）37 ℃孵育10 min或者室温避光15 min(从加完第一块板即开始计时)
11.终止：
（1）2M H2SO4作为终止液
（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板
（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积终止液
（4）终止液上样速度一定要快速并保持匀速
12.读数，分析数据
于酶标仪测得各孔OD值（终止后10min内），分析处理数据
(一)注意事项
1.加样
在ELISA中除了包被外，一般需进行4－5次加样。
在定量测定中加样量应力求准确，标本和结合物的稀释液应按规定配制。
加样时不可太快，应将液体加在孔底，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。
加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性；
加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附；溅出会对邻近孔产生污染；出现气泡则反应液界面有差异。
2.保温
在ELISA中一般有二次蛋白抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。
各ELISA板不应叠在一起。
为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。
湿盒应该是金属的，传热容易。
如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。
加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。
如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。
3.洗涤
洗涤在ELISA过程中，有时是决定实验成败的关键。
洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相蛋白或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。
因此在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。
洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。
另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。
ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；
③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。
洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。