南京工业大学微生物实验自来水大肠菌群的检测
水中大肠菌群的测定准备实验
• （2）三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 • 按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分 装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL • （3）品红亚硫酸钠培养基（供平板分离用） • 蛋白胨 10g， 乳糖 10g，K2HPO4 3.5g，琼脂 15～20g，蒸馏水1000mL，无水亚硫酸钠 5g，5 ％的碱性品红乙醇溶液 20mL，pH 7.2~7.4。 • （4）伊红美蓝培养基（EMB培养基）（供发酵 法平板分离用） • 蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，琼脂20g， 蒸馏水1000mL，2％伊红（曙红）水溶液 20mL， 5％美蓝（亚甲蓝）水溶液13mL，pH 7.2~7.4。
• 3.将待用实验用品及器材入灭菌锅内， 121℃下灭菌15分钟。 • 4.灭菌完成后将物品放入烘箱干燥 • 5.将需要倒入培养皿中的试剂倒入培养皿 • 6.其他器材分组待用
时间分配
• 本次准备实验需要用时3至4个小时。
思考题
• 1.做空白对照的实验目的是什么？ • 2. 为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道 病原菌污染的指示菌？ • 3.为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能 证实？
准备过程
• 1.准备材料及实验器材：水样、普通乳糖蛋白胨 培养液、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液、品红亚硫 酸钠培养基（供平板分离用）、伊红美蓝培养基 （EMB培养基）（供发酵法平板分离用）、灭菌 移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰 氏染色液、灭菌培养皿 、显微镜、烧杯、天平、 高压蒸汽灭菌锅、称量纸、电炉 • 本实验4至6人一组，分为7至10组，故每组需要 水样若干，12支试管，革兰氏染色液一套，培养 皿6个，显微镜1台，烧杯2个，电炉1个，每班需 天平1台，灭菌锅1台，称量纸若干。
2.配制培养基：
• （1）普通乳糖蛋白胨培养液 • 蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化钠 5g，1.6％溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸馏水 1000mL，pH 7.2~7.4。 • 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶 解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4， 再加入1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分 混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每 管10mL，115℃灭菌20min。
(2023)微生物实验报告水中细菌总数和大肠菌群的检测(一)
(2023)微生物实验报告水中细菌总数和大肠菌群的检测(一)水中微生物实验报告实验概述•实验名称：水中微生物总数和大肠菌群的检测•实验时间：2023年•实验地点：实验室实验目的•检测水中微生物总数和大肠菌群的存在情况•评估水质卫生状况，指导水资源管理和人群健康实验方法1.采集不同来源的水样。
2.将水样制成不同浓度的稀释液。
3.取一定量的水样稀释液注入培养皿中。
4.加入适当培养基，进行菌落计数和形态特征观察。
5.通过酶促法检测大肠杆菌。
实验结果•来源于自来水厂的水样中，微生物总数为100CFU/mL，大肠菌群未检测到。
•来源于河流的水样中，微生物总数为1000CFU/mL，大肠菌群为20CFU/100mL。
•来源于地下水的水样中，微生物总数为10CFU/mL，大肠菌群未检测到。
结论•来源于自来水厂的水样水质较好，不存在大肠菌群的污染。
•来源于河流的水样水质较差，大肠菌群的检出说明存在污染，需进行水质治理。
•来源于地下水的水样水质较好，不存在大肠菌群的污染。
实验意义•检测水中微生物总数和大肠菌群的存在情况，有利于保障人类健康和水资源的可持续利用。
•提供科学依据和技术支持，指导水资源管理和水质卫生监测。
实验注意事项•实验过程需严格遵守无菌操作规范，防止样本污染。
•实验前需对实验设备、培养基等进行消毒处理，确保实验环境洁净。
•实验结束后，需妥善处理实验产生的废液、废料等。
实验展望•未来可进一步开展对水中其他微生物种类的检测，深入了解水生态系统的生物多样性。
•结合近年来人类活动和气候变化的影响，对水质卫生进行长期监测，及时掌握水质变化趋势。
•根据实验结果，制定针对性的水资源管理和水质卫生治理措施。
结语该实验通过检测水中微生物总数和大肠菌群，评估了水质的卫生状况。
实验结果表明，水质卫生状况与水源的来源密切相关。
希望通过类似的实验，加强对水质卫生状况的监测和管理，确保水资源的可持续利用，保障人们的用水安全和健康。
自来水中细菌菌落数和大肠菌群数的测定
实验五自来水中细菌菌落数和大肠菌群数的测定一、实验目的l．学习水样的采取方法、水样细菌总数测定的方法和平板菌落计数的原则。
2．学习水中大肠菌群数的测定方法。
二、实验原理细菌菌落总数是指水样经过处理，在一定条件培养后，所得1毫升检验样中所含细菌菌落的总数。
本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
大肠菌群是肠道中最普遍存在和数量最多的一群细菌，常将其作为人畜粪便污染的标志。
水被大肠菌群污染，就有可能存在病原菌污染，所以，大肠菌群是重要的水质卫生指标。
水中大肠菌群数是以液体稀释培养计数法测定，即100毫升检样中大肠菌群最可能数（most probable number，MPN）。
三、实验器材l．培养基（1）肉膏蛋白胨琼脂培养基蛋白胨1克，牛肉膏0.5克，氯化钠0.5克，琼脂1.5克，蒸馏水100mL，pH7.2～7.4。
121℃灭菌15min，备用。
（2）乳糖胆盐发酵培养液蛋白胨2克，猪胆盐0.5克，乳糖1克，0.5%中性红水溶液0.5mL，蒸馏水100mL，pH 7.4。
分装到三角瓶和试管中，并放入一倒置杜氏小管。
115℃灭菌15min，备用。
双料发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍，三倍料发酵管各组分用量增加至三倍。
2. 仪器或其他用具培养箱，试管，杜氏小管，三角烧瓶，带玻璃塞瓶，培养皿，吸管，等。
四、实验内容l．水样的采取(1) 取样瓶的灭菌准备好清洁的容量为100毫升的磨砂口带塞瓶，瓶的颈部和上部用牛皮纸覆盖，并用线捆好，然后160～170℃干热灭菌2h。
(2) 自来水的采取为了取得典型的水样，取自来水样时，至少应先放水5min，以冲去龙头口所带的微生物。
微生物学实验-水中大肠菌群的简易检测
3、另取一无菌培养皿，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基， 作为空白对照。
4、凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h后计数，取两皿 平均数作为1ml水样中的细菌总数。
化学与生 命科学学
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实验原理
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实验原理
我国1985年起实施的饮用水卫生标准（GB574985)规定：1毫升自来水中的细菌总数不得超过100 个，每升自来水中肠道菌群不得超过3个。
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实验内容
一、自来水中细菌总数的测定
1、采水样：开放水龙头使水流5min，以无菌三角瓶接取 水样，迅速测定。
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实验原理
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实验原理
伊红美兰琼脂平板含有伊红与美兰染料，大肠菌群 发酵乳糖造成酸性环境是，该两种种染料即可结合 成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽 的深紫色菌落。
滤膜法是将水样通过一定孔径的滤膜，然后将滤膜 放在适宜的培养基上进行培养计数。
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实验内容
注意事项：
•自来水取样时避免取样中造成污染。 •自来水中含有余氯，可能对细菌有杀灭和抑制作用，
会造成结果偏低或假阴性，可以加入少量硫代硫酸钠，
与氯发生反应。
•操作过程要迅速，避免杂菌污染。 •倾注培养基时温度应冷却至45℃，避免烫死细菌。
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Байду номын сангаас实验内容
二、池水中大肠菌群的简易检测
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测
水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（一)实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
（二)实验原理水是微生物广泛分布的天然环境。
各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。
水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。
水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。
这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
实验八 水中大肠杆菌的测定
（三）多管发酵法检测大肠菌群
1.取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每支分别 加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵 管，每支分别加入水样1mL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养 基的初发酵管，每支分别加入按1：10稀释的水样1mL，均 贴好标签。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
三、实验材料和用具
1、培养基 复红亚硫酸钠培养基、乳 糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白胨 培养液、3倍浓乳糖蛋白胨培养液、伊 红美兰培养基。
2、仪器及用具 微孔滤膜（0.45um）、 滤器（500mL）、抽气设备、镊子、 发酵用试管、杜氏小管、培养皿、刻 度吸管或移液管、接种环、酒精灯。
四、操作步骤
（一）水样的采集
1.自来水 将自来水龙头用火焰灼烧3min灭菌， 在拧开水龙头流水5min，以排除管道内积存的死 水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样。
2.池水、河水、或湖水 将无菌的带玻璃塞的小口 瓶侵入距水面10~15cm深的水层中，瓶口朝上， 除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取 出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超 过24h。
（二）滤膜法检测大肠菌群
1.无菌滤膜 无菌镊子 滤器膜承受器，过滤杯——滤膜承 受器，旋紧。真空泵——抽气口
2.水100mL滤杯，启动抽真空系统，使水从下端流出。 3.有细胞的滤膜 无菌镊子 平贴于复红亚硫酸钠固体培养
基上（紧贴，无气泡），37℃培养16~18h。挑选红色或紫 红色、带有或不带有金属光泽的菌落，或淡红色、中心颜 色较深的菌落进行涂片和革兰氏染色观察。 4.经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，接种到乳糖蛋白 胨半固体培养基上， 37℃培养6~8h后观察，产气者为阳 性（观察要及时，以免气泡消失） 5.结果计算
自来水中细菌的测定
自来水中细菌总数的测定【摘要】本实验应用平板菌落技术测定水中细菌总数。
以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌种数仅是一种近似值。
实验用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板，计数。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。
所谓细菌总数，指1毫升或1克检样中所含的细菌菌落的总数。
按菌落计数方法进行计数，得到如下结果：在显微镜下可观察到众多的菌落且种类繁多，取其平均值得到，菌落数为65/mL，自来水中细菌总数为65/mL，符合国家饮用水标准。
【关键词】自来水细菌总数平板菌落计数技术牛肉膏蛋白胨琼脂培养基自来水的微生物学检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
应用平板计数技术测定水中细菌总数是用微生物测水质的常用方法。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
通过此方法我们能够计算出水中的细菌总数，从而判断自来水是否符合国家标准，是否受到污染。
1材料与方法1.1 水样的采取先在自来水龙头周围放置酒精灯进行灭菌，再放开水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
1.2 固体培养基的制作牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 1.5g 蛋白胨 5.0g NaCl 2.5g水500mL pH 7.4～7.6将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后到入烧杯。
也可放在称量杯中，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
微生物实验报告水中细菌总数和大肠菌群的检测
实验六水中细菌总数和大肠菌群的检测摘要:本实验以测定公园河流水的细菌总数和大肠菌群的数量，来测定特定地点的水质情况.初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标，判定水体的质量。
对该实验点的水源作出了定性的评价，以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。
关键字：河流水；细菌总数测定；大肠菌群;EMB培养前言各种天然水中常含有一定数量的微生物。
水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关,因而是评价水质污染程度的重要指标之一。
细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g（mL)],可用稀释平板计数法检测.水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。
特征:G—无芽孢杆菌，兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。
多管发酵法初发酵:适当稀释样品,乳糖发酵培养，产酸产气;分离培养:伊红美蓝(EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落；复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。
材料和方法牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5.0 g，琼脂8g，蒸馏水1000ml; pH 7。
0乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵1×：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL（调pH值后加）、水1000mL、pH 7。
2－7。
4三倍浓缩液（3×）:除水以外,其余成分取三倍用量分装：1×的培养基分装9ml/管, 3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。
灭菌条件：115℃ ,15min。
EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定脱水培养基,按说明书操作，水用量为90％.水源：紫竹院河水仪器：高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。
试剂：牛肉膏,蛋白胨,NaCl,琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂具体实验步骤：1)，相关器械的灭菌操作，以及前往紫竹院取少量的样品水。
水-中-细-菌-总-数及大肠菌群的检测方案
水中细菌总数的检测及大肠菌群的测定一、实验的目的要求1、学习并掌握水的细菌学检测方法2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。
二、实验原理细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。
细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标。
我国现行的生活饮用水标准检验方法GB5750—85规定水样中细菌总数测定是1ml水样在普通营养琼脂培养基中37℃经24小时培养所生长的细菌菌落的总数。
所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。
因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
平板菌落计数法的优点：能测出样品中的活菌数。
此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。
缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
生活饮用水细菌卫生标准我国饮用水卫生标准：≤3个大肠菌群/1L饮水，≤100个细菌总数/1ml饮水三、实验仪器和材料(三)实验器材(1) 菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
(2)大肠菌群的测定；1)培养基：伊红美蓝琼脂培养基：蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP042g， 2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。
制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
南京工业大学微生物实验-自来水大肠菌群的检测
自来水大肠菌群的检测***1*（南京工业大学生物与制药工程学院南京 211800）【摘要】水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是赖以生存和发展的物质基础。
水与药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次产品。
另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分实验采用自来水作为样品，对样品进行接种，分离，纯化，培养得到具有不同特征的肠杆菌。
通过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。
【关键词】多管发酵，大肠杆菌，最大可能数(MPN)，发酵实验，革兰染色前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严格的常规监测。
但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培养条件苛刻，分离鉴定比较困难。
因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指标。
大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在，并且检测方法简单。
因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌，包括埃希菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterbactor）、克雷伯菌属（Klebsiella）。
大肠菌群数是指每升水之中含有的大肠菌群的近似值，根据水中大肠杆菌数的数目即可判断水源是否被污染，并推断水源受肠道病原菌污染的可能性。
本实验采用多管发酵法对水质微生物进行分析。
该方法适用于各种水样，包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。
初发酵试验室用无菌操作技术向一系列装有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中接种一定量水样，培养。
能产酸产气者说明水样中含有大肠杆菌群细菌。
再根据产酸产气（阳性）管数求出100ml待测水样中是否存在大肠杆菌群细菌，而且可以检测出待测水样中大肠杆菌群的最大可能数。
实验十水中大肠菌群含量测定
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复发酵实验结果----产酸、产气
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五、实验报告
（1）自来水 100ml水样的阳性管数是多少？ 10ml水样的阳性管数是多少？ 查表ⅪⅤ-2得每升水样中大肠菌群数是多少？ （2）池水、河水或湖水 阳性结果记“+”；阴性结果记“-”。 查表ⅪⅤ-3得每升水样中大肠菌群数是多少？ 查表ⅪⅤ-4得每升水样中大肠菌群数是多少？
2、仪器或其他用具 载玻片，灭菌带玻璃塞 空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。
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四、操作步骤
1．水样的采取 1)自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌， 再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接 取水样，以待分析。 2）池水、河水或湖水 应取距水面10～15cm的 深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸 入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入 瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。最 好立即检查，否则需放入冰箱充分冷却。
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六、思考题
（1）大肠菌群的定义是什么？ （2）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠 道病原菌污染的指示菌？ （3）EMB培养基含有哪几种主要成分？ 在检查大肠菌群时，各起什么作用？ （4）经检查，水样是否合乎饮用标准？
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（a）深紫黑色、有金属光泽。
（b）紫黑色、不带或略带金属光泽。
（c）淡紫红色、中心颜色较深。
（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰 氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分， 重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每 管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～3个， 37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实 有大肠菌群存在。
水中大肠菌群的测定
水中大肠菌群的测定水中大肠菌群的测定一、实验目的1、了解和学习大肠菌群落的测定原理和测定意义2、学习和掌握大肠菌群数量与饮水卫生质量的关系和检测方法二、实验原理大肠菌群是一群能在37℃培养、48h内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧格兰氏染色阴性无芽孢杆菌。
在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群等多种细菌，这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源。
一些水中的肠道病原菌如沙门氏菌，也存在于人的粪便中，它们的致病能力强，存活能力差，数量有限，而且培养的条件苛刻，分离和鉴别比较困难，样品监测即使为阴性，也不能保证没有病原微生物的存在。
而大肠菌群存活能力强，数量庞大，检测方法比较简易。
此外，大肠菌群细菌在水中的存活时间、对消毒剂和水体中不良因素的抵抗力与病原菌相似，可以作为人畜粪便污染的指示菌。
目前，国际上已经公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群落的检查。
《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）规定：生活饮用水总大肠菌群数规定为MPN/100mL或CFU/100mL不得检出。
MPN 为最大可能适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
MPN是水的标准分析法，适用于各种水样，包括初发酵、平板分离和复发酵三部分。
三、实验材料1、水样：400mL2、培养基：乳糖蛋白胨半固体培养基、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液、EMB培养基。
3、灭菌水：作阴性对照用。
4、接种大肠埃希菌的水样：做阳性对照用。
5、试剂和染色剂：草酸铵结晶紫染液，碘液，泛红染液，脱色液。
6、仪器设备：超净工作台，恒温培养箱，显微镜等。
7、其他：无菌移液管、无菌锥形瓶、发酵用试管、杜氏小管、培养皿、移液枪、酒精灯等。
四、操作步骤1、初发酵在3倍浓缩乳糖培养基中加入稀释度为10^-1、10^-2、10^-3的被检样品10mL，每个稀释度5个重复，混合均匀置于37℃培养24h。
2、平板分离培养24h后如果不产酸(乳糖发酵液变黄色)，产气（小指管底部有气泡）和不变浑浊者为阴性反应，产酸、产气或者仅产酸的乳糖发酵管为阳性反应，将阳性反应划线接种在伊红美兰平板上并且进行划线接种，37℃培养24h。
水中大肠菌群的检测
水中大肠菌群的检测法（多管发酵法）一、实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。
大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽泡杆菌，在37°C生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。
我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。
多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋口豚液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
本实验为精简实验，所以省略了平板分离和复发酵试验后两部分，直接通过第一部分初发酵试验的颜色变化进行判断是否存在大肠菌群。
初发酵试验水样接种于发酵管内，37°C下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
二、实验器材1•水样中心湖的湖水2.试剂三倍浓缩乳糖蛋口腺发酵管3.仪器及其它用品移液枪，16支试管（16支德汉氏小套管）三、实验步骤初发酵试验取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml 一倍的乳酸蛋口腺培养液，5支加入5ml三倍乳糖蛋白腺培养液，1支加入9ml自然水。
然后往16支试管各倒置一支汉氏小套管。
完成后包装好，于121°C高压灭菌锅中灭菌30min左右。
将取回来的中心湖水样稀释20倍。
待试管冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白腺培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白腺培养液的5支试管中加入lml水样，向装有一倍的乳酸蛋白豚培养液的另5支试管中加入lml IO"水样。
将各试管充分混均，置于37°C恒温箱中水样体积10mL lmL变黄数555产气数555培养24ho四、实验结果同时观察其他两组也是用中心湖水样的，其结果全都是显示为黄色。
实验大肠菌群的检验
预测模型构建
比较不同样品之间大肠菌群数量的差异，如独立样本t检验、配对t检验等。
分析大肠菌群数量与其他因素（如环境因素、水质指标等）之间的相关性。
利用已知数据建立预测模型，预测未知样品的大肠菌群数量。
05
实验结论和讨论
大肠菌群数量与污染程度正相关
温度对大肠菌群生长有较大影响
时间的延长有助于提高检出率
大肠菌群广泛分布于粪便、水源、食品等环境中，因此成为水质和环境监测的重要指标。
本实验主要采用多管发酵法和滤膜法进行大肠菌群检测。
大肠菌群是指一群革兰氏阴性杆菌，主要包括肠杆菌、枸橼酸杆菌、沙门菌等。
将待测水样接种到含有选择性培养基的发酵管中，培养后观察是否产气，以判定是否存在大肠菌群。通过比较不同稀释度的水样，可以得到水样中大肠菌群的近似数量。
根据检验结果，对大肠菌群的数量和分布进行分析，以便于评估食品的质量和安全性。
根据相关标准和规定，对检验结果进行判定，判断食品是否符合卫生标准和要求。
03
结果判定
02
01
04
实验数据分析和处理
原始数据的记录
在实验过程中，需要实时记录每个样品中大肠菌群的数量、颜色、大小等特征。
重复实验数据的记录
为了保证实验结果的可靠性，需要对每个样品进行多次实验，每次实验的数据都需要详细记录。
结果讨论
样品采集和处理方式的不同对大肠菌群检验结果产生一定影响。例如，采集的样品不均一、样品处理不当等可能会导致结果的不准确。
影响因素分析
实验条件如温度、湿度、pH值等的变化也会对大肠菌群的生长和检出率产生影响。因此，实验过程中需要严格控制这些条件，以保证结果的准确性。
不同的检测方法在检出率和准确性方面存在差异，因此选择适合的检测方法对大肠菌群检验结果也有影响。
水中总大肠菌群的测定
微生物综合实验：水中细菌总数和大肠菌群的测定一实验目的1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2、了解水源水的平板菌落计数的原则。
3、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。
二、实验原理水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~28h能发酵乳糖产酸与产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存活期相近，易于培养和观察等特点。
大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。
大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。
本实验采用多管发酵法，它被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。
我国规定：每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、实验材料和用具：1、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养基，三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美兰培养基（EMB培养基）。
2、试剂：无菌水、结晶紫染液、卢氏碘液、95%乙醇、番红染色液。
3、器皿：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，德汉氏小管，载玻片，无菌空瓶，移液管，接种环，酒精灯，注射器，显微镜等。
四、实验步骤第一周（2008-11-11）1、制备无菌水：取4支试管，向每支试管中加入9ml自来水。
2、配制：牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15~20g，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）乳糖蛋白胨培养基（蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，1．6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基（将上述乳糖蛋白胨培养基浓缩3倍配制）3、将以上配制的无菌水和培养基全部进行灭菌处理。
大肠菌群mpn检验法的流程
大肠菌群mpn检验法的流程大肠菌群MPN检验法是一种用于测定水样和食品中大肠菌群浓度的方法。
其原理基于数值分析法，通过对3杯平行称量水样的不同稀释液进行培养并观察其菌落形态和数量，从而计算出大肠菌群的数量。
以下是大肠菌群MPN检验的详细流程。
步骤一：准备试管、试剂和培养基1. 选择三个或更多的试管，标记上每个试管的编号。
2. 准备9 ml 0.1％碳酸钠液，并在每个试管中加入 10 ml。
3. 在每个试管中加入 1 ml 稀释液1。
4. 在每个试管中加入 1 ml 稀释液2。
5. 在每个试管中加入 1 ml 稀释液3。
6. 在每个试管中加入 9 ml 液体培养基。
可以使用多种不同的培养基，如McConkey 培养基和E.coli/coliforms双层营养琼脂板。
步骤二：制备稀释液1. 制备初次稀释液。
将被测水样取10 ml，加入90 ml稀释液1中，充分混合得到10-1（即1/10）的初次稀释液。
2. 制备第二次稀释液。
在稀释液1中各取1 ml，加入9 ml稀释液2中，充分混合得到10-2（即1/100）的第二次稀释液。
3. 制备第三次稀释液。
在稀释液2中各取1 ml，加入9 ml稀释液3中，充分混合得到10-3（即1/1000）的第三次稀释液。
步骤三：测定大肠菌群1. 从每个试管中取10 ml水样或者是不同浓度的稀释液，加入液体培养基中。
2. 在培养基中进行培养。
大肠菌在摄氏35-37度下，48小时内可以在大部分培养基上生长。
这非常重要因为不同的培养基其菌群生长的时间和数量可能会有所不同。
3. 观察培养结果。
如果在试管中形成了典型的大肠菌落，就说明这个营养基中含有大肠菌。
如没有形成典型菌落，可能需要重新试验。
4. 根据试管中出现大肠菌的情况，使用MPN表来计算每毫升水样中的大肠菌数量。
MPN表是一种标准表格，可以用来对菌落数量进行估算。
步骤四：分析结果MPN值是指每毫升水样中大肠菌群数量的估计值。
实验八 水中大肠杆菌的测定
三、实验材料和用具
1、培养基 复红亚硫酸钠培养基、乳 糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白胨 培养液、3倍浓乳糖蛋白胨培养液、伊 红美兰培养基。 2、仪器及用具 微孔滤膜（0.45um）、 滤器（500mL）、抽气设备、镊子、 发酵用试管、杜氏小管、培养皿、刻 度吸管或移液管、接种环、酒精灯。
四、操作步骤
（三）多管发酵法检测大肠菌群
1.取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每支分别 1.取 支装有3 加入水样10mL。另取5 加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵 管，每支分别加入水样1mL。再取5 管，每支分别加入水样1mL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养 基的初发酵管，每支分别加入按1 10稀释的水样1mL，均 基的初发酵管，每支分别加入按1：10稀释的水样1mL，均 贴好标签。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。 贴好标签。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。 2.取出培养后的发酵管，观察发酵液的颜色为黄色者记录为 2.取出培养后的发酵管，观察发酵液的颜色为黄色者记录为 产酸，杜氏小管内有气泡者记录为产气。将产酸产气和产 酸的两类发酵管分别划线接种于伊红美兰培养基上，在 37℃恒温箱中培养18~24h。挑选深紫黑色和紫黑色带有 37℃恒温箱中培养18~24h。挑选深紫黑色和紫黑色带有 或不带有金属光泽的菌落、或淡紫红色和中心色较深的距 离，将其一部分分别取样进行涂片和革兰氏染色观察
3.经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，者将它的另一 3.经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，者将它的另一 部分接种于装有倒置杜氏小管的乳糖蛋白胨培养 液的复发酵管中，每管接种菌落1~3个， 37℃ 液的复发酵管中，每管接种菌落1~3个， 37℃培 养24h，有产酸产气者为大肠菌群，记为阳性管。 24h，有产酸产气者为大肠菌群，记为阳性管。 4根据3个梯度（10mL、1mL、0.1mL）的5支中 根据3个梯度（10mL、1mL、0.1mL）的5 出现阳性管数，查表细菌最可能数，再乘以100 出现阳性管数，查表细菌最可能数，再乘以100 换算成1L水样中的大肠菌群数。 换算成1L水样中的大肠菌群数。
实验水中总大肠菌群的测定多管发酵法
出现阳性份数
每 100mL 95%可信限
出现阳性份数
每 100mL 水 95%可信限
水样中细
值
样中细菌
值
10mL 1 mL 管 0.1 菌数的最 下限 上 10mL 1 mL 0.1 数的最可 下 上限
管
mL 管 可能数
限管
管 mL 管
能数
限
0
0
0
<2
2
0
1
7
1 17
0
0
1
2
<0.5 7
2
1
0
7
1 17
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别加入 10mL 水样；于各装有 10mL 乳糖蛋白胨培养液的 5 个试管中（内有倒管）， 分别加入 1mL 水样；再于各装有 10mL 乳糖蛋白胨培养液的 5 个试管中（内有倒 管），分别加入 1mL 1∶10 稀释的水样。共计 15 管，三个稀释度。将各管充分混 匀，置于 37℃恒温箱内培养 24h。
5
1
350
120 1000
5
0
2
43
15 110 5
5
2
540
180 1400
5
1
0
33
11 93 5
5
3
920
300 3200
5
1
1
46
16 120 5
5
4
1600
640 5800
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南京工业大学微生物实验自来水大肠菌群的检
测
公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
自来水大肠菌群的检测
***1*
（南京工业大学生物与制药工程学院南京 211800）
【摘要】水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是赖以生存和发展的物质基础。
水与药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次
产品。
另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分实验采用自来水作为样品，对样品进行接种，分离，纯化，培养得到具有不同特征的肠杆菌。
通过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。
【关键词】多管发酵，大肠杆菌，最大可能数(MPN)，发酵实验，革兰染色
前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严
格的常规监测。
但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培
养条件苛刻，分离鉴定比较困难。
因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指
标。
大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在，
并且检测方法简单。
因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24-48h能发酵乳糖产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌，包括埃希菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterbactor）、克雷伯菌属（Klebsiella）。
大肠菌群数是指每升水之中含有的大肠菌群的近似值，根据水中大肠杆菌数的数目即可判断水源是否被污染，并推断水源受肠道病原菌污染的可能性。
本实验采用多管发酵法对水质微生物进行分析。
该方法适用于各种水样，包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。
初发酵试验室用无菌操作技术向一系列装有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中接种一定量水样，培养。
能产酸产气者说明水样中含有大肠杆菌群细菌。
再根据产酸产气（阳性）管数求出100ml待测水样中是否存在大肠杆菌群细菌，而且可以检测出待测水样中大肠杆菌群的最大可能数。
平板分离试验是对于发酵乳糖产酸产气的阳性管用接种环以无菌操作技术取一环其中的培养物，在伊红美蓝平板做划线接种，培养。
若菌落呈深紫红色，为典型的大肠菌落菌群；菌落为粉红色、粘液状、不透明，为非典型的大肠菌群菌落；否则其他特征菌落均为非大肠菌群菌落。
因此，通过平板分离试验可进一步确认水样中大肠菌群细菌的存在。
复发酵试验是取典型或非典型的菌落，进行革兰氏染色并镜检，若为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则再将其接种于乳糖蛋白胨培养基中，培养。
如果产酸产气则证实存在大肠菌群细菌。
1、材料与方法
材料
实验仪器：超净工作台、恒温培养箱、显微镜等。
培养基：乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨、乳糖、牛肉膏、氯化钠、%溴甲酚紫溶液、蒸馏水200ml、。
（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）
3倍浓度乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨、乳糖、牛肉膏、氯化钠、%溴甲酚紫溶液、蒸馏水25ml、。
（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）伊红—美蓝（EMB）培养基：伊红—美蓝（EMB）培养基粉末、200ml蒸馏水、。
染色剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥碘液、番红染色液。
水样：隔夜的自来水水样。
其他：取样器、灭菌移液管、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。
实验方法
初发酵实验：
（1）对15支试管进行标号；
取五支装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养基试管，标记水样名称和加水量10ml；（编号1—5）
取五支装有乳糖蛋白胨培养基试管，标记水样名称和加水量1ml；（编号6—10）
取五只装有乳糖蛋白胨培养基试管，标记水样名称和加水量；（编号11—15）（2）接种：
用移液枪分别取10ml水样加入1—5号试管中；分别取1ml水样加入6—10号试管中；分别取水样加入11—15号试管中，摇晃均匀。
（3）培养：
将以上接种后的所有试管放入37℃培养箱中培养48h。
（4）观察实验结果：
培养48h后观察记录各加水量产酸产气的管数，即阳性试管。
然后根据大肠菌群存在的管数查大肠菌群数得出每100ml水样中大肠菌群MPN，报告每升水样中大肠菌群数。
利用Thomas公式计算最大可能数。
MPN/100ml=阳性管数X100/√(阴性管中的水样体积X全部试管中的水样体积) 平板分离：
（1）将试验中产酸产气试管中培养物以无菌操作技术分别在EMB平板上进行划线接种（要求长出单菌落），于37℃培养24h。
（2）培养24h后观察菌落特征。
菌落特征类型有：
①菌落深紫色，有金属光泽——典型大肠杆菌群菌落；
②菌落深紫色，无金属光泽——典型大肠杆菌群菌落；
③菌落粉红色、粘液状、不透明——非典型大肠杆菌群菌落；
④其他特征。
（3）挑取呈①②③菌落特征的菌进行革兰染色、镜检，观察革兰染色反应结果和观察芽孢有无。
复发酵试验：
（1）用接种环分别挑取经确认为革兰阴性、无芽孢杆菌的菌落上的菌种接种于乳糖蛋白胨培养基上（编号1—7），于37℃培养24h。
（2）培养24h后，观察产酸产气情况。
凡是产酸产气者，即可最终确认为大肠杆菌群细菌。
（3）根据复发酵实验结果，再计算100ml水样中大肠杆菌MPN。
2、结果与分析：
初发酵结果：
15支试管全都产酸，但其中两支试管内的杜氏小管内无气泡，实验数据如下，阳性组合为5-5-3，查阅大肠菌群检数表可得每100ml水样中细菌MPN为920。
表1：初发酵实验结果
平板分离结果
阳性管培养物划线接种培养24 小时后，EMB 培养基中长出深紫色有金属光泽的单菌落，菌落较小，呈圆形，表面和边缘光滑，是典型大肠菌群菌落
镜检结果
从EMB培养基中挑取上述特征的菌进行革兰氏染色，观察得菌体呈粉红色，为革兰氏阴性菌，镜检照片如下：
复发酵结果：
经过24h培养后，两支试管皆产酸产气，可认定为大肠菌群细菌。
3.结果与讨论
经过一系列的实验表明，该水样中存在大肠菌群。
并且，大肠菌群存在的数量已经超出生活饮用水的卫生标准规定，但是由于该水样是过夜的水样，因而，实验数据不具有准确性，但是过夜的自来水样大肠菌群数严重超标，不宜饮用。
心得体会：这次实验验证了自来水中存在大肠菌群及其数量标准。
通过对整个实验的把握、计划及实验步骤的实施，可以看出，在实验当中我们还是缺少对整体实验的细致了解和计划。
对实验可能出现的结果不能提前预测分析，缺少对问题的深入理解。
这次实验同
时也体现了许多我们操作上的不规范，不能完全按照无菌接种计术来完成实验，导致误差变大，和轻微污染。
参考文献：[1]袁丽红、陆利霞、李霜，微生物实验[M]，化学工业出版社，2006.
[2]国家环境保护总局编，中华人民共和国环境保护行业试行标准[S]，中国环境科学出版社，2007.
[3]高瑞坤，汤琳等.水中粪大肠菌群快速检测方法—固定底物酶法与多管发酵
的比较.[J]中国环境检测.(4).40~41。