免疫沉淀试验
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第六章 免疫沉淀试验
教学目的
掌握:液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验原 理
熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉 淀现象。
（1）抗原抗体的比例
海德堡曲线
在抗体过量的反应体系中,抗原量的递 增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合 适时反应达峰值,而当抗原过量时,形成的 免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个 抛物曲线。
（2）抗体的质量
•抗体的特异性 •抗体的效价(>1:20) •抗体的亲和力 •R型和H型抗体（R型）
（3）抗原抗体反应的环境 最适PH为:6.5-8.5 离子强度大,IC形成快 离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液 （4）增浊剂 PEG(6000—8000) 浓度4%吐温-20
三、免疫电泳技术
三、免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点:
1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。
3.增加了分辨率。
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
•电泳（electrophoresis） :在外加电
场的作用下带电颗粒向着其电性相反 的电极移动,称为电泳。
电泳迁移率:
定义：同一电场条件下,各种带电粒子在 单位时间内移动的距离。M=cm2/VS
影响泳动的速度的因素: 本身净电荷量、颗粒大小、形状 电场强度 溶液pH值 溶液离子强度 电渗
电渗: 电场中液体相对于固体的运动
①载体的性质 ②缓冲液的离子强度 ③电泳时的电压
电渗方向与样品运动方向一致: 样品迁移率加快
伪浊度形成的原因
1.抗血清中有非特异性的交叉反应性杂 抗体成分
2.增浊剂浓度和反应时间掌握不当 3.样品本身的浊度处理不当 4.试剂污染变质 5.比色杯不够清洁
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中 扩散,形成浓度梯度，在抗原抗体相 遇并且浓度比例适当的位置形成肉 眼可见的沉淀线或沉淀环。
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀 环
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16-24h；T2为24-48h；T3为48h 以上,可见T3为直线,T1为反抛物线
t1 为 16-24h ； t2 为 24-48h ； t3 为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛 物线
待检蛋白质抗原须具备的条件
第二节 液体免疫沉淀试验
第二节 液体免疫沉淀试验
一、絮状免疫沉淀试验 絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应 抗体混合,在电解质存在的条件下， 抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状 沉淀物。
一、絮状免疫沉淀试验
抗原稀释法:抗原最适比例 抗体稀释法:抗体最适比例 方阵滴定法:抗原抗体最适比例
絮 状 沉 淀 示意图
各管抗原倍比稀释
Ag
加入抗血清
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
最适比方阵测定法
二、免疫浊度测定
原理: 当可溶性抗原与相应抗体特异结合,
二者比例合适时，在增浊剂中它们 快速形成一定大小的抗原抗体复合 物，使反应液体出现浊度。
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合,快速但不可见 免疫复合物。
二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定
免疫扩散试验 免疫电泳技术
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质:可溶性 4. 抗体的选择：2价
电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低,甚至倒退
电泳载体: 琼脂 琼脂糖凝胶
常用浓度：0.8%-1.0% 特点:杂质少、接近电中性,常温易凝固， 色泽透明、质地均匀、富有弹性。
蛋白质的两性解离性质:
--NH2 + H2O
--NH3Fra Baidu bibliotek + OH-
--COOH
--COO- +H+
两性离子 pH=pI 电中性,无电泳移动性 pH<pI 酸性溶液 带正离子，向阴极泳动 pH>pI 碱性溶液 带负离子，向阳极泳动
反应介质:凝胶 凝胶的特点： 1、固相的液体 2、多孔的网状结构 3、Ag-Ab复合物网络在凝胶
中
一、单向免疫扩散试验
定量试验
原理:抗体与待测的抗 原,在两者比例合适的 部位结合形成沉淀环。 环的大小与抗原的浓 度成正相关。
技术要点:
1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散 5.绘制标准曲线
一、单向免疫扩散试验
优 点:
稳定性好、简便快速,易于自动化 敏感度高 精确度高 无放射性核素污染
分 类:
1.根据反应的时间和反应结合的动力学分为 速率比浊法 终点比浊法 2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为 透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
透射比浊试验和散射比浊试验光路
IC
透射比浊试验
I
检测器A
I0
θ
当复合物＜3×106dal,
I≈Iθ;θ＜90°，散射光的
量代表IC的量。
Iθ 检测器B
散射比浊试验
补充:免疫浊度测定影响因素
（1）抗原抗体的比例:反应体系保持抗体过量 （2）抗体的质量 ：特异性强,效价高，亲和力强，
并使用R型抗体 （3）抗原抗体反应液的环境：最适PH为6.5-8.5 （4）增浊剂
技术要点: 1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散
二、双向免疫扩散试验
1.判断抗原或抗体的存在 2.分析抗原或抗体相
以及估计相对含量
对分子量
二、双向免疫扩散试验
3.分析抗原的性质
二、双向免疫扩散试验
4.滴定抗体的效价 5.鉴定抗原或抗体 纯度
应用
1.AFP检测的最早方法
2.血清中含量较高的酶类、细 菌病毒感染后血清中产生的抗 体的检测
仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清 已知含量的标准品 待测品含量在1.25g/ml以上
一、单向免疫扩散试验
单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清,下排右2为异常病理血清
应用
IgG、IgA、IgM、C3、C4、 转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白
等多种血浆蛋白的检测
二、双向免疫扩散试验
教学目的
掌握:液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验原 理
熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉 淀现象。
（1）抗原抗体的比例
海德堡曲线
在抗体过量的反应体系中,抗原量的递 增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合 适时反应达峰值,而当抗原过量时,形成的 免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个 抛物曲线。
（2）抗体的质量
•抗体的特异性 •抗体的效价(>1:20) •抗体的亲和力 •R型和H型抗体（R型）
（3）抗原抗体反应的环境 最适PH为:6.5-8.5 离子强度大,IC形成快 离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液 （4）增浊剂 PEG(6000—8000) 浓度4%吐温-20
三、免疫电泳技术
三、免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点:
1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。
3.增加了分辨率。
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
•电泳（electrophoresis） :在外加电
场的作用下带电颗粒向着其电性相反 的电极移动,称为电泳。
电泳迁移率:
定义：同一电场条件下,各种带电粒子在 单位时间内移动的距离。M=cm2/VS
影响泳动的速度的因素: 本身净电荷量、颗粒大小、形状 电场强度 溶液pH值 溶液离子强度 电渗
电渗: 电场中液体相对于固体的运动
①载体的性质 ②缓冲液的离子强度 ③电泳时的电压
电渗方向与样品运动方向一致: 样品迁移率加快
伪浊度形成的原因
1.抗血清中有非特异性的交叉反应性杂 抗体成分
2.增浊剂浓度和反应时间掌握不当 3.样品本身的浊度处理不当 4.试剂污染变质 5.比色杯不够清洁
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
第三节 凝胶内免疫沉淀试验
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中 扩散,形成浓度梯度，在抗原抗体相 遇并且浓度比例适当的位置形成肉 眼可见的沉淀线或沉淀环。
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀 环
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16-24h；T2为24-48h；T3为48h 以上,可见T3为直线,T1为反抛物线
t1 为 16-24h ； t2 为 24-48h ； t3 为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛 物线
待检蛋白质抗原须具备的条件
第二节 液体免疫沉淀试验
第二节 液体免疫沉淀试验
一、絮状免疫沉淀试验 絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应 抗体混合,在电解质存在的条件下， 抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状 沉淀物。
一、絮状免疫沉淀试验
抗原稀释法:抗原最适比例 抗体稀释法:抗体最适比例 方阵滴定法:抗原抗体最适比例
絮 状 沉 淀 示意图
各管抗原倍比稀释
Ag
加入抗血清
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
最适比方阵测定法
二、免疫浊度测定
原理: 当可溶性抗原与相应抗体特异结合,
二者比例合适时，在增浊剂中它们 快速形成一定大小的抗原抗体复合 物，使反应液体出现浊度。
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合,快速但不可见 免疫复合物。
二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定
免疫扩散试验 免疫电泳技术
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质:可溶性 4. 抗体的选择：2价
电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低,甚至倒退
电泳载体: 琼脂 琼脂糖凝胶
常用浓度：0.8%-1.0% 特点:杂质少、接近电中性,常温易凝固， 色泽透明、质地均匀、富有弹性。
蛋白质的两性解离性质:
--NH2 + H2O
--NH3Fra Baidu bibliotek + OH-
--COOH
--COO- +H+
两性离子 pH=pI 电中性,无电泳移动性 pH<pI 酸性溶液 带正离子，向阴极泳动 pH>pI 碱性溶液 带负离子，向阳极泳动
反应介质:凝胶 凝胶的特点： 1、固相的液体 2、多孔的网状结构 3、Ag-Ab复合物网络在凝胶
中
一、单向免疫扩散试验
定量试验
原理:抗体与待测的抗 原,在两者比例合适的 部位结合形成沉淀环。 环的大小与抗原的浓 度成正相关。
技术要点:
1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散 5.绘制标准曲线
一、单向免疫扩散试验
优 点:
稳定性好、简便快速,易于自动化 敏感度高 精确度高 无放射性核素污染
分 类:
1.根据反应的时间和反应结合的动力学分为 速率比浊法 终点比浊法 2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为 透射免疫比浊法 散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
透射比浊试验和散射比浊试验光路
IC
透射比浊试验
I
检测器A
I0
θ
当复合物＜3×106dal,
I≈Iθ;θ＜90°，散射光的
量代表IC的量。
Iθ 检测器B
散射比浊试验
补充:免疫浊度测定影响因素
（1）抗原抗体的比例:反应体系保持抗体过量 （2）抗体的质量 ：特异性强,效价高，亲和力强，
并使用R型抗体 （3）抗原抗体反应液的环境：最适PH为6.5-8.5 （4）增浊剂
技术要点: 1.制板 2.打孔 3.加样 4.扩散
二、双向免疫扩散试验
1.判断抗原或抗体的存在 2.分析抗原或抗体相
以及估计相对含量
对分子量
二、双向免疫扩散试验
3.分析抗原的性质
二、双向免疫扩散试验
4.滴定抗体的效价 5.鉴定抗原或抗体 纯度
应用
1.AFP检测的最早方法
2.血清中含量较高的酶类、细 菌病毒感染后血清中产生的抗 体的检测
仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清 已知含量的标准品 待测品含量在1.25g/ml以上
一、单向免疫扩散试验
单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清,下排右2为异常病理血清
应用
IgG、IgA、IgM、C3、C4、 转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白
等多种血浆蛋白的检测
二、双向免疫扩散试验