细胞表面分子的检测与分析

注意事项

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样本的采集、储存 样本的染色 全血样本的溶血效果 流式实验对照的设置
样本的采集
手术切除的新鲜标本取材 时，要避免出血或组织坏 死。深低温保存，以免组 织发生自溶，DNA降解， 造成检测结果的误差。 采集静脉血样本时，要避 免发生溶血。 收集培养的细胞时，要注 意选择消化的方法和试剂。

例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化
例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析
标本来源

外周血
全血溶血、PBMC
骨髓穿刺液
体液、灌洗液


实体组织
新鲜组织、石蜡包埋样本
培养的细胞
原代细胞 细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞
标本制备
一、新鲜实体组织样本的制备
酶消化法。 常用的酶类试剂：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原 蛋白酶等 机械法。1、剪碎法 2、网搓法 3、研磨法
标本制备
四、贴壁细胞单细胞悬液的制备
（1）将培养细胞用0.04％EDTA或0.25％胰酶消化3～7分钟，
至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化
液，加PBS； （2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中；
（3）离心，1000r/min，5min；
（4）加PBS洗两遍； （5）PBS重悬，将细胞吹打均匀； （6）荧光标记。
标本制备
三、外周血单个核细胞的制备
（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理盐水稀释成4ml，混匀； （2）沿试管壁缓缓加入4ml淋巴细胞分离液Ficoll，勿用力过大； （3）离心2000r/min，20min，离心后分层，上层为血浆层，中层 为分离液层，底层为红细胞层； （4）用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出，用生理盐水 洗两遍，PBS重悬； （5）荧光标记。
①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤由未免疫动物血清纯化而来
双色标记荧光补偿
口诀：横平竖直
荧光补偿对照
分析类型 管 1 2 1 双色分析 2 3 4 1 2 三色分析 3 功能 Isotype Sample1,2…… Isotype Compensation1 Compensation2 Sample1,2…… Isotype Compensation1 Compensation2 γ1-FITC A-FITC γ1-FITC A-FITC γ1-FITC A-FITC γ1-FITC A-FITC γ1-FITC γ2a-PE γ2a-PE B-PE B-PE γ2a-PE γ2a-PE B-PE γ1-PC5 γ1- PC5 γ1- PC5 加入的抗体
样本的储存
原则：时间越短越好

肝素抗凝的外周血和骨髓：室温 ≦72小时 EDTA抗凝的标本：室温 ≦ 24小时 ACD抗凝的外周血：室温 ≦ 72小时 ACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝 粒细胞、血小板功能检测：即刻检测 单核细胞表面抗原分析： ≦1小时，4℃ 嗜酸性粒细胞表面抗原分析： ≦24小时，4℃ 淋巴细胞免疫表型与DNA含量的分析： ≦72小时
γ1-FITC
A-FITC γ1-FITC γ1-FITC γ1-FITC A-FITC
γ2a-PE
γ2a-PE B-PE γ2a-PE γ2a-PE B-PE
γ1-ECD
γ1- ECD γ1- ECD C- ECD γ1- ECD C-ECD
γ1- PC5
γ1- PC5 γ1- PC5 γ1- PC5 D-PC5 D-PC5
标记方法

直接免疫荧光法
特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单。

间接免疫荧光法
特点：适用范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非 特异性染色，结果不易判断。（建议只用于单标检测）

直接、间接混合染色法
染色原则：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可先直 接标记。
对照设置

阴性对照
调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值。 常用的有：同型对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照
样本的染色

影响抗原抗体反应的因素
电解质、反应温度与时间 、PH值（7.2～7.4）

流式抗体的选择
根据流式细胞仪的类型选择抗体 抗体应用级别、滴度和使用量的选择 根据抗原表达量选择抗体
全血样本：溶血效果很重要
溶血，即裂解红细胞。它是流式细胞术分析白 细胞的先决条件。溶血不好，白细胞群不能很好分 开，溶血好坏直接影响检测结果。因此，必须对溶 血过程进行严格控制。 影响溶血的因素：采血过程 溶血剂的使用 实验操作过程

阳性对照
检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性。
空白对照
确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。
补偿对照
多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节。
同型对照（Isotype Control）


用于消除由于抗体非特异 性结合到细胞表面的Fc受 体而产生的背景染色 与染色的单克隆抗体
化学处理法。
常用试剂：0.2%EDTA 细胞活性。 0.25%胰酶+0.2%EDTA
注意：除消化过程外，其余步骤最好在4度环境下操作，提高
标本制备
二、全血标本的制备
“ABC”溶血（Beckman） 取肝素钠抗凝的外周血100ul，荧光标记完成后，依次 加入A液600ul，轻轻振荡15s；B液260ul, 轻轻振荡15s； C液100ul, 振荡10s，免洗上机检测。 “ACK”溶血（自配） 以1：3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混 匀，室温放置10min，离心去上清，再加入溶血剂溶血，反 复2～3次，至红细胞完全溶解。细胞重悬后，再进行荧光标 记。
细胞表面分子的检测与分析
医学结构生物学研究中心 柳卫凰
流式在细胞表面分子检测中的应用

免疫细胞及其亚群的检测与功能分析
血液系统细胞表面标志的研究 细胞群体及细胞表面标志变化的监测 细胞表面标志构成性质的分析
例如：T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞等
例如：急性白血病的初步诊断与检测、CD34+造血干细胞研究、 血小板分析辅助诊断相关疾病等
单色分析
4
5
Compensation3
Sample1,2……
γ1-FITC
A-FITC
γ2a-PE
B-PE
C-PC5
C-PC5
1
2 四色分析 3 4 5 6
Isotype
Compensation1 Compensation2 Compensation3 Compensation4 Sample1,2……