酶与蛋白质工程-第4章-基因表达与蛋白质分离纯化

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酶工程与蛋白质工程

酶工程与蛋白质工程酶工程与蛋白质工程是现代生物技术的重要领域，它们以分子水平为基础，通过基因工程技术来改造酶和蛋白质。

酶工程主要研究酶的结构与功能关系以及酶催化反应机理，以此来优化酶的性质和功能；而蛋白质工程则致力于蛋白质的高表达、纯化和改造，进而实现分子水平的控制和利用。

两者交叉融合，共同应用于工业、医药、环保和食品等各个领域，促进了生物技术的发展和推广。

一、酶工程简介酶是一种生物催化剂，具有极高的选择性和催化效率。

酶工程旨在通过对酶的分子结构和催化机理的研究，优化酶的性质和功能，使其在特定条件下能够更高效地催化反应。

比如，通过改变酶的氨基酸序列，可以实现酶催化活性和稳定性的提高。

再比如，通过引入新的催化中心或变异剂，可以改变酶的底物特异性和反应特性。

这些优化方法可以显著提高酶的效率和选择性，为实现工业生产和科学研究提供了有效手段。

酶工程的具体步骤如下：1. 酶的筛选和分离。

这个步骤是酶工程的基础，通常需要从自然界中分离出能够催化特定反应的酶。

现代酶工程技术一般采用高通量筛选法，通过分子筛、高速离心、色谱法等方法来分离出酶的纯品。

2. 酶的分子结构分析。

这个步骤是为了了解酶的分子结构和功能关系，找到优化方案的基础。

目前，常用的酶的分析方法有X射线晶体学和核磁共振法。

3. 酶的基因工程改造。

通过基因工程技术，改变酶的氨基酸序列和三维结构，使其获得更高的活性和稳定性。

常用的方法有扩展、交换和修饰等方法。

4. 酶的活性和特性检测。

通过活性酶测定、底物特异性、pH和温度对酶催化反应的影响等方法来检测酶的改造效果。

5. 酶的产量提高。

通过使用表达载体、调节生产菌株的生长条件等方法，使酶的产量达到最高。

二、蛋白质工程简介蛋白质工程是将目标蛋白基因从生物体内放大、纯化、定位和表达，以达到高效率和高纯度的目的。

主要应用于药物研发、工业化生产、分子诊断和分子工业等领域，对于制造可溶性蛋白、表达蛋白、纯化蛋白和修饰蛋白等方面都发挥着重要作用。

有关酶的参考书

有关酶的参考书1．《酶学》作者：郑穗平，郭勇，潘力编著出版社：科学出版社出版时间：2009-9-1 定价：49元目录：前言第一章绪论第一节酶的基本概念第二节酶的分类与命名一、蛋白类酶的分类与命名二、核酸类酶的分类第三节酶的活力测定第四节酶的催化特性一、酶催化作用的专一性二、酶催化作用的效率三、酶催化作用的条件第五节酶的分离纯化一、细胞破碎二、提取三、离心分离四、过滤与膜分离五、沉淀分离六、层析分离七、电泳分离八、萃取分离第二章酶的结构与功能第一节酶的化学组成一、蛋白类酶的基本组成单位一一氨基酸二、核酸类酶的基本组成单位——核苷酸三、酶的辅助因子第二节酶的化学结构一、酶蛋白的化学结构二、酶RNA的化学结构第三节酶的空间结构一、酶蛋白的空间结构二、酶RNA的空间结构第四节酶的活性中心一、酶活性中心上的残基二、接触残基附近的肽链一级结构第五节酶的结构与功能的关系一、酶的一级结构与催化功能的关系二、酶的二、三级结构与催化功能的关系三、酶的四级结构与催化功能的关系第六节酶分子修饰一、酶分子的主链修饰二、酶分子的侧链基团修饰三、酶分子的组成单位置换修饰四、金属离子置换修饰五、酶分子的物理修饰第三章酶的催化作用机制第一节趋近与定向效应第二节构象变化效应一、底物诱导酶分子的构象发生改变二、酶分子诱导底物分子的构象发生改变第三节微环境效应一、胰凝乳蛋白酶催化的微环境效应及其催化机制二、溶菌酶催化的微环境效应及其催化机制第四节酸碱催化机制一、酶蛋白中的酸碱催化基团二、共轭酸与共轭碱的催化通式三、核糖核酸酶的酸碱催化过程第五节共价催化机制一、亲核催化二、亲电催化第六节自我剪接机制一、Ⅰ型内含子剪接酶的剪接机制二、Ⅱ型内含子剪接酶的催化机制第七节自我剪切机制一、锤头形核酸类酶的自我剪切机制二、发夹形核酸类酶的自我剪切机制第八节酶作用机制的研究方法一、X射线衍射法二、中间产物检测法三、酶分子修饰法四、酶反应动力学方法第四章酶反应动力学第一节单底物反应动力学一、引言第五章酶的生物合成及调节机制第六章酶分子的定向进化主要参考文献2.《现代酶学》（第二版）作者：袁勤生主编出版社：华东理工大学出版社出版时间：2007-5-1 定价：58目录：1 酶与应用酶学1.1酶学研究概况1.2从分子水平研究酶的结构与功能1.2.1酶的分子结构1.2.2结构与功能的研究1.3用分子生物学方法改进酶的催化特性及设计新酶1.3.1酶结构与功能关系研究是关键1.3.2基因工程酶1.3.3酶的蛋白质工程构建1.4构建酶---核酶、抗体酶、模拟酶、分子印迹酶1.4.1核酶1.4.2抗体酶1.4.3模拟酶1.4.4分子印迹酶1.5酶工程中的若干应用热点2 酶的分类组成及结构特征3 酶作用动力学和酶的抑制作用4 酶活性的调节和酶的转换5 酶的作用机制6 同工酶7 酶化学修饰的定量处理及不可逆抑制动力学8 氧自由基与酶9 酶与细胞的信号转导10 非水介质中的酶催化反应11 酶的化学修饰12 核酶13 模拟酶14 抗体酶15 分子印迹酶16 组合生物催化17 酶的定向进化18 蛋白酶抑制剂设计与药物19 酶的固化技术20 酶的分离工程21 气体酶学22 酶的生产参考文献3.《酶学及其研究技术》作者：陈清西编著出版社：厦门大学出版社出版时间：2010-8-1 定价：38 目录：第一章概论第一节酶的概念和酶学研究的重要性一、酶是什么二、酶学研究的重要性三、酶学研究历史四、现代酶学概况第二节酶的组成及结构特点一、酶的化学本质二、酶蛋白亚基数的组成特点分类三、酶的组成分类四、酶的辅助因子第三节酶的分类与命名一、习惯命名法二、国际系统命名法三、国际系统分类法第四节酶作为催化剂的特点一、酶与一般催化剂比较的共性二、酶作为催化剂的显著特性第五节酶的专一性一、酶的专一性分类二、几种蛋白酶的专一性第二章酶的分离纯化第一节酶分离纯化的一般原则一、确立酶活力测定方法二、原材料的选择与处理三、酶的纯化方法四、酶的纯度鉴定第二节酶的提取一、生物材料的破碎二、酶的抽提第三节酶的纯化一、沉淀法二、离子交换柱层析技术三、凝胶过滤柱层析法四、亲和层析五、其他分离纯化方法六、酶纯化方法的选择与实验设计第三节酶活力的测定一、酶活力测定的一般原则二、初速度三、酶活力单位四、酶活力测定的主要方法第四节酶制剂的浓缩、干燥及保存一、浓缩的主要方法二、保存第五节酶纯度的鉴定技术一、酶纯度的评价二、电泳法三、其他方法第六节酶的分离纯化应用实例一、青蟹碱性磷酸酶二、南美白对虾N一乙酰J3一D一氨基葡萄糖苷酶第三章酶的理化性质研究第一节酶亚基数及分子量的测定一、酶蛋白亚基数及亚基分子量的测定原理与方法二、酶蛋白总分子量的测定原理与方法第二节酶的等电点测定一、等电点测定的原理二、等电聚焦电泳技术第三节酶的氨基酸组成一、氨基酸组成分析二、特殊氨基酸含量的测定三、酰胺含量的测定第四节糖基酶中糖的组成与连接方式的研究一、糖蛋白的分析二、糖蛋白中糖成分的分析三、糖基连接方式的研究第五节几种海洋动物酶的理化性质的研究实例一、锯缘青蟹碱性磷酸酶的理化性质研究二、南美白对虾N一乙酰一J3一D一氨基葡萄糖苷酶的理化性质研究第四章酶催化的动力学性质研究第一节酶促反应的基本动力学一、Michaelis—Menten方程的建立二、Briggs—Haldane修正的Michaelis—Menten方程三、关于Michaelis一Menten方程的讨论四、米氏常数Km的意义五、米氏常数Km和最大反应速度V m的图解法测定六、米氏方程的积分形式第二节King—Altman方法推导速度方程一、用稳态法推导动力学方程的基本步骤二、King—Altman图像法推导动力学方程三、wang和Hanes结构法则第三节酶浓度对反应速度的影响第四节产物浓度对酶促反应的影响一、产物对酶初速度的影响的动力学二、可逆反应的Haldane关系式第五节高底物浓度对酶活力的影响一、动力学模型建立二、动力学方程的推导第五章酶的抑制剂第一节酶抑制剂的类型一、酶抑制剂两大类型二、区别可逆抑制剂与不可逆抑制剂的实验设计与操作第二节不可逆的抑制剂一、非专一性的不可逆抑制剂二、专一性不可逆抑制剂第三节可逆抑制剂作用的动力学一、竞争性抑制作用的动力学二、非竞争性抑制作用的动力学三、反竞争性抑制作用的动力学四、混合型抑制作用的动力学第六章pH对酶活力的影响第一节pH对酶催化的效应一、酶促反应的最适pH二、酶的pH稳定性第二节pH对酶可逆作用的动力学一、酶活性中心可解离基团的解离常数二、pH影响酶活性中心解离基团的动力学模型的建立三、酶活性中心解离基团的解离常数的测定第三节有机溶剂对酶活性中心解离基团的微扰作用第四节pH对酶效应研究的实例一、pH对青蟹碱性磷酸酶（ALPase）催化pNPP水解反应的效应二、酶活性中心解离基团解离常数的测定第七章温度对酶活力的影响第一节温度对酶催化反应的影响一、酶促反应的最适温度二、酶的热稳定性第二节温度对酶催化反应速度常数的影响一、温度与速度常数二、酶促反应的热力学参数的测定第三节温度对酶催化反应速度常数的影响一、酶活性中心解离基团的标准热焓二、酶促反应的热力学常数测定实例三、酶活性中心解离基团的解离热焓测定实例第四节酶的热失活动力学一、经典的酶热失活研究方法二、酶失活过程中的底物反应动力学方法三、酶的热失活表观速度常数的测定四、酶热失活的微观速度常数的测定第八章酶的多底物动力学第一节术语一、多底物催化反应历程的Cleland表示法二、多底物反应的酶中间物三、多底物反应历程的分类四、多底物反应的动力学参数表示法五、多底物反应机理的图形表示法第二节OrderedBiBi机理一、反应模型的Clleland表示法二、动力学方程的推导（King—Altman推导法）三、反应速度方程用动力学常数表示的基本方法四、作图法求解动力学参数第三节RandomBiBi机理第四节PingPongBiBi机理第五节多底物反应机理的判断第六节产物的抑制作用机理的判断一、有序双双反应（OrderedBiBi）的产物抑制作用的判断二、乒乓双双反应（PingPongBiBi）的产物抑制作用的判断三、Cleland的产物抑制作用的判断规则第九章酶功能基团的化学修饰第一节化学修饰的原理一、影响酶的功能基团反应活性的主要因素二、修饰剂反应性的决定因素第二节采用非特异性试剂对酶功能基团进行修饰一、特殊氨基酸残基的化学修饰二、修饰剂和修饰反应条件的选择第三节亲和标记和差示标记一、亲和标记法的原理二、差示标记法的原理第四节酶活性中心必需基团数的测定一、酶修饰失活动力学二、酶修饰失活速度常数比较法判断必需基团数（Ray—Koshland方法）三、邹氏图解法求必需基团数第十章酶的分子结构基础及催化作用机理第十一章酶抑制剂的设计与应用第十二章酶分子构象的研究技术第十三章多酶体系及调节酶第十四章酶活性调控4．《酶工程原理》作者：由德林主编出版社：科学出版社出版时间：2011-7-1 定价：35目录：丛书序前言前言1 酶与酶工程1.1 酶工程的发展历程1.2 酶作为催化剂的特点1.2.1 酶的高效催化能力1.2.2 酶的专一性1.2.3 酶的作用条件温和1.2.4 酶的活性可调节1.3 酶的命名及分类1.4 酶催化功能的结构基础1.4.1 酶的高级结构是其发挥活性的基础1.4.2 酶的活性中心1.4.3 酶的活性部位模型假说1.5 酶催化反应的本质1.5.1 酶促反应的过渡态1.5.2 邻近效应和定向效应1.5.3 共价催化1.5.4 酸碱催化1.5.5 金属离子催化1.5.6 微环境影响1.6 酶动力学1.6.1 影响酶反应速率的因素1.6.2 单底物反应1.6.3 双底物反应动力学1.6.4 失活（稳定性）动力学1.7 酶的稳定性1.7.1 酶的失活模型1.7.2 酶蛋白不稳定的原因1.7.3 稳定酶的方法1.8 非水酶学1.8.1 非水介质中酶催化反应的特征1.8.2 非水介质中酶的催化基础1.8.3 底物特异性（思考题）（参考文献）2 酶的生产、分离纯化和制剂2.1 原料的选择2.2 产酶微生物发酵技术2.2.1 培养基2.2.2 发酵工艺控制2.3 工程菌的高密度发酵2.3.1 基因工程菌的构建2.3.2 基因工程菌的培养方式2.3.3 高密度发酵工艺2.4 提高酶产量的方法2.4.1 酶合成的调控机理2.4.2 通过条件控制提高酶产量2.4.3 通过基因突变提高酶产量2.4.4 通过体内基因重组提高酶产量2.4.5 通过体外基因重组提高酶产量2.4.6 定向进化提高酶产量2.5 酶分离纯化的原理与方法2.5.1 酶分离纯化的基本原则2.5.2 目标蛋白从生物机体内的释放2.5.3 粗分离2.5.4 根据相对分子质量不同的纯化方法2.5.5 根据分子电荷不同的纯化方法2.5.6 根据分子极性不同的纯化方法2.5.7 根据蛋白质亲和力不同的纯化方法2.6 酶的剂型与保存2.6.1 酶的剂型3 酶的固定化和酶反应器4 酶的分子改造5 酶的模拟6 酶与生物催化7 酶与生物降解8 酶与代谢工程索引5.《酶――在生活与工业中广为使用的超级分子催化剂》作者：（德）伦内贝格著，杨毅，张皖蓉，王健美译出版社：科学出版社出版时间：2009-3-1 定价：35目录：丛书序本册简介原版前言1 酶是具有高度特异性的高效生物催化剂2 溶菌酶：在微小分子水平上最早被了解其结构和功能的酶类3 辅助因子在复合酶类中的作用4 酶类的来源：动物、植物以及微生物5 胞外水解酶将生物高分子聚合物降解为小分子6 用于酿酒、烘焙以及退浆的淀粉酶7 用于增加蔬果汁产量的果胶酶8 生物清洁剂：应用最广泛的水解酶9 软化肉类与皮革的蛋白酶10 固定：酶类的重复使用11 葡萄糖异构酶与果糖糖浆：提高糖的甜度12 固态酶在人类与动物食品生产中的应用13酶膜反应器：辅助因子再生性的应用14固定细胞小测验参考文献与推荐读物相关网络链接6.《酶工程技术》作者：吴士筠，周岿，张凡主编出版社：华中师范大学出版社出版时间：2009-12-1 定价：16目录：第1章绪论1.1 酶工程研究现状1.1.1 国内外酶制剂的生产和应用现状1.1.2 工业酶制剂的来源及特点1.2 酶工程技术应用1.2.1 活性肽的开发研究1.2.2 酶工程在医药方面的应用1.2.3 酶在污染治理中的应用1.2.4 酶在农业中的应用1.2.5 酶在饲料生产方面的应用1.2.6 酶在轻化工领域中的应用1.3 国内外酶工程产业发展趋势第2章乙醇脱氢酶2.1 简介2.1.1 乙醇脱氢酶研究现状2.1.2 乙醇脱氢酶的应用2.1.3 乙醇脱氢酶的分离纯化2.2 乙醇脱氢酶酶学性质研究2.2.1 简介2.2.2 乙醇脱氢酶酶学性质阶段研究2.2.3 乙醇脱氢酶酶学性质研究关键技术2.2.4 乙醇脱氢酶酶学性质研究过程控制2.3 乙醇脱氢酶提取研究2.3.1 简介2.3.2 乙醇脱氢酶提取阶段研究2.3.3 乙醇脱氢酶提取关键技术2.3.4 乙醇脱氢酶提取过程控制2.4 乙醇脱氢酶分离纯化研究2.4.1 简介2.4.2 乙醇脱氢酶分离纯化阶段研究2.4.3 乙醇脱氢酶分离纯化关键技术2.4.4 乙醇脱氢酶分离纯化过程控制2.5 乙醇脱氢酶催化动力学研究2.5.1 简介第3章蛋白酶第4章a－淀粉酶第5章植酸酶第6章纤维素酶参考文献7.《酶工程》作者：陈宁主编出版社：中国轻工业出版社出版时间：2011-6-1 定价：36目录：第一章绪论第一节酶工程的定义第二节酶工程发展历史第三节酶工程的研究概况及发展前景一、新酶的研究与开发二、化学酶工程三、生物酶工程四、酶的优化生产五、酶的高效应用第四节我国酶制剂工业现状及发展对策一、我国酶制剂工业发展现状。

蛋白质与酶工程教学大纲

《蛋白质与酶工程》教学大纲课程名称：蛋白质与酶工程学分：2学时：32先修课程：生物化学适用专业：生物工程开课系部：生命科学学院一、课程性质、目的和培养目标课程性质：专业选修课课程目的：本课程是生物工程本科专业选修课，目的是让学生在学习了普通生化的基础上，进一步对蛋白质和酶工程进行深入系统的学习。

并对于酶在生产实践中的应用，也能有一些感性和理性的认识。

课程培养目标：采用多媒体课件和国内外最新的教学参考书、教案，灵活运用多种教学方法，因材施教，使学生在牢固掌握基础知识和基本概念的同时，得到科学研究、科学思维和科学方法的良好训练，为其他专业基础课和专业课的学习及日后的研究工作打下基础。

二、课程内容和建议学时分配第一章绪论2课时（一）教学基本要求掌握蛋白质工程和酶工程的定义，了解其发展史，以及应用前景。

（二）教学内容第一节蛋白质工程概论第二节蛋白质工程的应用第三节蛋白质工程展望第四节酶工程简介一酶工程二组成：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化；生物反应器。

三分类：化学酶工程；生物酶工程。

第五节酶与酶工程的发展简史一酶学研究简史二酶工程研究简史（三）教学重点和难点重点：蛋白质与酶工程定义; 难点：酶工程的组成分类第二章蛋白质的结构与功能 2课时（一）教学基本要求掌握蛋白质的基本结构组成及功能（二）教学内容第一节蛋白质的基本结构与功能一蛋白质的组成二蛋白质的一级结构三蛋白质一级结构与功能的关系第二节蛋白质的空间结构与功能一蛋白质的二级结构二超二级结构和结构域三蛋白质的三级结构四蛋白质空间结构与功能的关系五蛋白质-蛋白质相互作用（三）教学重点和难点重点：蛋白质的空间结构；难点：蛋白质间的相互作用；第三章蛋白质的修饰和表达 4课时（一）教学基本要求掌握蛋白质的化学修饰途经，了解蛋白质改造的一些途经等。

（二）教学内容第一节蛋白质修饰的化学途径一功能基团的特异性修饰1 多位点取代2 单一的或限制性取代3 次级取代二基于蛋白质片段的嵌合修饰第二节蛋白质改造的分子生物学途径一编码基因的专一性位点和区域性定向突变1 编码基因的专一性位点突变2 区域性定向突变二基因融合和基因剪接三 tRNA介导定点搀入非天然氨基酸第三节重组蛋白质的表达一目标蛋白质在大肠杆菌中的表达1 表达载体的一般特点2 与外源基因有效表达的相关因素3 改善表达水平及溶解性的方法二目标蛋白质在酵母细胞中的表达三重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达1161 选择哺乳动物细胞表达体系的优点2 两个主要的哺乳动物细胞表达系统四噬菌体显示（三）教学重点和难点重点：蛋白质的修饰和表达；难点：蛋白质间的修饰；第四章蛋白质的分离纯化及酶的分离工程8课时（一）教学基本要求了解蛋白质和酶分离的一般过程、生物材料的处理方法，掌握酶的分析方法和分离纯化的方法、技术。

基因工程及蛋白质工程

基因工程（gene engineering）:是对携带遗传信息的分子进行施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。

基因工程这个术语既可用来表示特定的基因施工项目，也可泛指它所涉及的技术体系，其核心是构建重组体DNA的技术，因此基因工程和重组体D 技术(DNA recombination)有时也就成为同义词。

蛋白质工程（protein engineering):是在基因工程基础上发展起来的。

是指通过对蛋白质已知结构与功能的认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的目的。

技术上的三大发现限制性内切酶和DNA连接酶的发（标志着DNA重组时代的开始）。

载体的使用。

逆转录酶的发现。

载体应具备的条件具有自主复制的能力携带易于筛选的选择标记含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入除保留必要序列外，载体应尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖使用安全三、表达载体表达载体(expression vector)是用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。

这类载体除具有克隆载体所具备的性质外，还带有表达构件-转录和翻译所必需的DNA序列。

表达载体包括原核细胞表达载体,哺乳动物细胞表达载体和植物表达载体三类。

基因克隆的基本程序包括五大步骤：①制备目的基因;②连接目的基因与裁体形成重组体;③将重组体转入宿主细胞；④重组体的筛选和鉴定；⑤重组体的扩增和表达．目的基因是指要克隆或表达的基因1．从基因文库中筛选：2．利用PCR合成：3．人工合成：4.CDNA文库三、重组DNA导入宿主细胞在基因克隆技术中，将质粒DNA及其重组体导入细菌称为转化(transformation)；将病毒及其重组体导入宿主细胞称为转染(transfection)；将噬菌体及其重组体才入宿主细胞称为转导(transduction)。

1.氯化钙法2. 2.电穿孔法3. 3. 脂质体转染法、4. 4.显微注射法5. 5.根瘤土壤杆菌法6. 6.基因枪法83 83四、重组体的筛选和鉴定由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。

高中生物基因工程与蛋白质工程知识点总结

基因工程与蛋白质工程知识点总结一、基因工程基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

(一)基因工程的基本工具：1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。

2.“分子缝合针”——DNA连接酶(1)两种DNA连接酶(E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别：E•coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

(2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。

DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

3.“分子运输车”——载体(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

(2)最常用的载体是--质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

(3)其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。

2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。

人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

3.PCR技术扩增目的基因(1)原理：DNA双链复制(2)过程：第一步：加热至90～95 ℃DNA解链;第二步：冷却到55～60 ℃，引物结合到互补DNA链;第三步：加热至70～75 ℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

基因工程与蛋白质工程

基因工程与蛋白质工程基因工程和蛋白质工程是现代生物技术领域中的两个重要分支。

通过对基因和蛋白质的研究和改造，它们在医学、农业和工业等领域发挥着重要作用。

本文将从定义、应用领域、技术原理和前景等方面对基因工程和蛋白质工程进行介绍，以展示它们在科学研究和实践中的突出地位。

一、基因工程基因工程是通过对DNA的重组和改造，用于创造新的生物体、改良现有生物体或产生有用的化合物或蛋白质的技术。

它广泛应用于生命科学、医学和工业生产等领域。

基因工程的主要步骤包括：基因克隆、载体构建、基因转化和表达等。

1.基因克隆基因克隆是指将目标基因从DNA中分离出来，并将其复制并插入到另一个载体DNA中，形成重组DNA的过程。

该过程通常包括DNA 提取、酶切、连接和转化等步骤。

目前，基因克隆技术已成为基因工程研究中最常用和重要的技术手段之一。

2.载体构建载体是用于携带外源DNA的DNA分子。

在基因工程中，科学家们通常使用质粒作为载体，通过将目标基因插入质粒DNA中，构建出重组载体。

重组载体能够被转化到宿主细胞中，并在细胞内进行复制和表达。

3.基因转化和表达基因转化是指将重组载体导入宿主细胞的过程。

在基因工程中，常用的基因转化方法包括细菌转化、植物转化和动物转化等。

一旦基因成功转化到宿主细胞中，它们可以通过细胞的遗传机制进行复制和表达，从而产生目标蛋白质或其他有用产物。

二、蛋白质工程蛋白质工程是指通过对蛋白质的结构和功能的改造，以创造新的蛋白质或改良现有蛋白质的技术。

蛋白质工程在制药、食品科学和农业等领域具有广泛的应用前景。

1.蛋白质改造蛋白质改造是通过对蛋白质的氨基酸序列进行改变，以改变其结构和功能的过程。

常见的蛋白质改造方法包括点突变、插入、删除和重组等。

通过这些改造手段，科学家们可以创造出具有特定功能或改良性能的蛋白质。

2.蛋白质表达蛋白质表达是指将改良后的蛋白质基因导入宿主细胞，并在细胞内进行合成和积累的过程。

常用的蛋白质表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物等。

第四章蛋白质的稳定性和稳定化

蛋白质的稳定性: 蛋白质抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力. 蛋白质的特定功能是由其特定的空间结构决定的,要保持其生物活理解蛋白质力,必须保持其空间结构,稳定蛋白稳定性的概念? 质空间结构的因素是什么?
维持蛋白结构稳定的主要因素:
① 金属离子、底物、辅因子和其他相对低分子质量配体的结合作用 ② 蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用 ③ 盐桥和氢键 ④ 二硫键 ⑤ 对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低 ⑥ 氨基酸残基的坚实装配 ⑦ 疏水相互作用(思考题)
熔化温度Tm;蛋白质伸展一半时的
变性剂浓度蛋白质自由能; 最大稳定性温度(Ts); 在特定温度下蛋白质功能活性维持时间.
思考
熔化温度Tm和蛋白质伸展50%
时的变性剂浓度是预测酶稳定性的最有用参数;
Tm: 蛋白质受热伸展过渡中点时的
温度; 变性剂浓度: 蛋白质加变性剂伸展过程中使蛋白质伸展一半时所需要的变性剂浓度;
思考
三．极端pH: 活性中心氨基酸必需基团电离. pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个过程原则上是可逆的,但这些变化常能导致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活. 四．氧化作用: 各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。分子氧、 H2O2和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。五．表面活性剂和去污剂表面活性剂在很低浓度下能使蛋白质发生强烈的相互作用,导致蛋白质不可逆变性.其中阴离子去污剂的作用比阳离子和非离子去污剂强烈.
疏水性标尺
疏水性氨基酸越多越稳定?
疏水性与蛋白质稳定性的关系小结
疏水性大小与稳定性没有必然的联系非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排列是稳定性的原因之一增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:降低蛋白质表面的疏水性,增加蛋白质内部的疏水性

蛋白质工程

College of Food Science and Technology
Henan University of Technology
Food Biotechnology
17
31
141 低活性 Cys 141 高活性 Cys 108 U/mg 106 U/mg
Cys Cys 17 Ser 31 Cys
College of Food Science and Technology
Henan University of Technology
Food Biotechnology
• 牛胰岛素的一级结构
S S A链 I I Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn 5 I 10 15 I 21 S S I S S B链 I I Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala 5 10 15 20 25 30
（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。
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二、蛋白质的结构与功能
（一）蛋白质结构蛋白质具有独特的基本结构和高级结构：一级结构、二级结构、三级结构、四级结构。
FБайду номын сангаасod Biotechnology

蛋白质的研究方法与原理

蛋白质的免疫检测
总结词
免疫检测是利用抗体与抗原的特异性结合来检测蛋白质的技术。它具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点。
详细描述
免疫检测的基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合，通过检测抗体与抗原的结合情况来判断蛋白质的存在。常用的免疫检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹等。这些方法能够检测出低浓度的蛋白质，并且可以对蛋白质进行定量和定性分析，
因此在生物医学研究中广泛应用。
04
蛋白质的表达与调控
基因工程技术表达蛋白质
基因工程技术是研究蛋白质表达的重要手段，通过基因工程技术可以高效地在大肠杆菌、酵母、哺乳动物
细胞等宿主细胞中表达蛋白质。
基因工程技术表达蛋白质的原理是将目的基因插入到宿主细胞的基因组中，通过转录和翻译过程合成蛋白
质。
基因工程技术表达蛋白质的优点是可以在短时间内大量生产蛋白质，并且可以方便地改变蛋白质的序列和
05
蛋白质的结构与功能研究
X-射线晶体学研究蛋白质结构
总结词
X-射线晶体学是一种通过X-射线分析晶体结构的方法，广泛应用于蛋白质结构的研究。
详细描述
X-射线晶体学通过分析X-射线在晶体中的衍射，可以确定蛋白质分子的三维结构。研究人员将蛋白质结晶后，利用X-射线照射晶体，衍射的X-射线通过分析波长和强度，可以推断出蛋白质分子的空间排列和构象。
蛋白质的表达水平在不同个体之间存在差异，通过对个体蛋白质表达谱的分析，可以为个体化治疗提供依据，实现精准医疗。
蛋白质在生物工程领域的应用
生物制药
酶工程
蛋白质是生物药物的主要成分，通过基因工程技术生产重组蛋白药物，可用于治疗多种疾病。
酶是蛋白质的一种，通过酶工程技术和蛋白质工程手段对酶进行改造和优化，可以提高酶的催化效率和稳定性。

蛋白质与酶工程

蛋白质与酶工程重点1.蛋白质工程：以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。

2.酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。

3.酶工程研究的主要内容：1）化学酶工程2）生物酶工程3）固定化酶与细胞4）酶反应器与传感器5）酶的非水相催化4.蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。

5.蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。

6.蛋白质晶体学：利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。

8.定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。

10.酶工程的研究范围：1）各类自然酶的开发和生产；2）酶的分离纯化和鉴定技术；3）固定化技术；4）利用其他的生物技术领域交叉渗透；5）多酶反应器的研制和应用。

11.酶的稳定性和稳定化：（一）引起酶失活的原因：1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）；2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合；3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）；4）多肽链的断裂（很强烈）；（二）酶的稳定化：1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）；2）添加盐类（高浓度(NH4)2SO4）；3）添加底物辅酶等配体；4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）；5）结晶化。

12.微生物作为酶源的优越性：1）容易获得酶需要的酶类；2）容易获得高产菌株；3）生产周期短；4）生产成本低；5）生产易管理；6）提高微生物产酶的途径比较多。

第四章酶工程

利用酶具有的特异催化功能，对酶结构进行修饰改造，并借助于生物反应器和工艺优化过程，有效地发挥酶的催化特性来生产人类所需产品的技术。它包括酶的提取与分离纯化技术、酶固定化技术、酶非水相催化技术、酶的蛋白质工程和酶反应器设计等。

化学酶工程
也称初级酶工程，指自然酶、化学修饰酶、固定化酶以及人工合成酶的研究和应用。（1）自然酶：由生物材料中分离出来的酶制成的酶制剂。价格低，生产方式简单；应用方便，不需辅因子参加；产品种类少，应用范围窄。（2）化学修饰酶：通过酶分子的化学修饰达到改性变构的目的。主要用于酶学研究和疾病治疗。

化学结合法
（1）共价结合法：将载体有关基团活化、与酶分子上的功能团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法；与载体结合的酶功能团有α或ε-NH2，α、β 或γ-羧基，巯基，咪唑基，酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性的非必需基团，否则可能会导致固定后酶活力完全丧失；
（ 2 ）共价交联法：通过双功能或多功能试剂（交联剂），在酶分子之间或酶分子与微生物细胞之间形成共价键的连接方法；常用的交联剂有戊二醛、异氰酸酯、顺丁烯二酸酐和乙烯共聚物等；

等电点沉淀法
利用蛋白质在等电点时溶解度最低，以及不同的蛋白质具有不同的等电点这一特性，对酶进行分离纯化的方法。经常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀等方法一起使用，使其沉淀完全。

有机溶剂沉淀法
利用酶在有机溶剂中溶解度不同而使其分离。常用有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙酮等。
（二）根据酶分子大小和形状不同的方法
酶反应器是完成酶促反应的装臵，研究内容包括酶反应器的类型、特性；酶反应器的设计、制造及选择等。
二、酶的生产与分离纯化技术

酶与蛋白质工程原理及概况

酶与蛋白质工程原理及概况摘要：酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。

概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。

酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。

当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。

关键词：酶工程蛋白质工程一、酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。

它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。

分为：化学酶工程与生物酶工程。

1、酶工程原理和基本过程：菌种→扩大培养→发酵→发酵酶液→酶的提取→酶成品↓原料→前处理→杀菌→酶反应器←酶的固定化↓反应液→产品提取→产品2、酶工程研究热点：新酶或已有酶的新功能的开发；根据已有底物开发新的酶反应；利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能；利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂；利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系；体内或体外合成的多酶体系；克服底物和产物抑制；精细化工品或医药合成技术的放大；辅因子再生；生物催化剂的修饰；生物催化剂的固定化二、蛋白质工程：1、定义：以蛋白质结构和功能的研究为基础，运用基因工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。

2、原理：天然的正常构象是蛋白质的最佳状态，它既能高效地发挥功能，又便于机体的正常调控，因而极易失活而中止作用。

但在生物体外，特别是工业化的粗放生产条件下，这种可被灵敏调节的特性就表现为酶分子性质的极不稳定性，导致难以持续发挥应有的功能，成为限制其推广应用的主要原因。

如温度、压力、机械力、重金属、有机溶剂、氧化剂以及极端pH值等蛋白质工程技术针对这一现状，对天然蛋白质进行改造改良或全新设计模拟，使目的蛋白质具有特殊的结构和性质，能够抵御外界的不良环境，即使在极端恶劣条件下也能继续发挥作用，因而蛋白质工程具有广阔的应用前景。

《食品生物技术》课程笔记

《食品生物技术》课程笔记第一章：绪论一、食品生物技术的基本概念1. 定义：食品生物技术是指应用生物学、分子生物学、生物化学、微生物学、遗传学等生命科学的基本原理，结合工程学、信息学等学科的方法，对食品原料、生产过程、产品进行科学研究和工程技术改造的技术领域。

2. 范围：食品生物技术的研究和应用范围广泛，主要包括以下几个方面：- 基因工程：通过基因克隆、基因转移等技术，对食品生物的遗传特性进行改造。

- 细胞工程：利用细胞培养、细胞融合等技术，进行细胞水平的操作和改造。

- 蛋白质工程：设计和改造蛋白质，提高其功能性和稳定性。

- 酶工程：研究和应用酶在食品加工中的作用，提高酶的效率和稳定性。

- 发酵工程：利用微生物发酵生产食品和食品添加剂。

3. 特点：- 科学性：基于严谨的科学原理和方法。

- 创新性：不断推动食品产业的技术创新。

- 安全性：关注食品安全，确保生物技术产品的安全性。

- 环保性：减少污染，提高资源利用效率。

二、传统食品生物技术与现代食品生物技术1. 传统食品生物技术：传统食品生物技术主要包括自然发酵、选种育种、食品加工等基于经验的技术。

这些技术历史悠久，但通常生产效率较低，产品品质不稳定。

2. 现代食品生物技术：现代食品生物技术以分子生物学为基础，采用基因工程、细胞工程、蛋白质工程等高新技术，具有以下特点：- 高效性：能够大幅度提高食品生产效率。

- 精确性：能够精确改造生物体的特定性状。

- 可控性：能够实现对生产过程的精确控制。

3. 差异与发展：- 技术层面：传统技术依赖于经验和直觉，现代技术依赖于科学原理和精确操作。

- 效率层面：现代技术能够实现规模化、自动化生产，提高产量和效率。

- 品质层面：现代技术有助于提高食品的品质和营养价值。

三、食品生物技术研究的内容1. 食品原料改良：- 基因工程：通过转基因技术，培育抗病、抗虫、高产的新品种。

- 细胞工程：通过细胞培养和筛选，获得优质的食品原料。

第3章基因工程第4节蛋白质工程的原理和应用

【答案】C
第3章基因工程
【解析】蛋白质工程是根据人们的需要首先要预期蛋白质的相应功能，然后设计预期的蛋白质结构，推测其应有的氨基酸序列，根据相应的氨基酸序列推导出基因中的脱氧核苷酸序列，再合成相应的目的基因，C正确。
第3章基因工程
蛋白质工程的应用 1．医药工业方面 (1)速效胰岛素类似物的研发：通过改造__胰__岛__素__基__因____实现了对相应氨基酸序列的改造，使B28位脯氨酸替换为__天__冬__氨__酸____或者将它与 B29位的__赖__氨__酸____交换位置，从而抑制胰岛素的聚合。
第3章基因工程
2．蛋白质工程崛起的缘由 (1)基因工程的实质及不足： ①实质：将一种生物的___基__因___转移到另一种生物体内，使后者可以产生它本不能产生的___蛋__白__质__，进而表现出____新__的__性__状______。 ②不足：基因工程在原则上只能生产自然界已存在的__蛋__白__质___。 (2)蛋白质工程崛起的缘由：天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的___结__构__和__功__能____符合__特__定__物__种___生存的需要，却不一定完全符合人类__生__产__和__生__活____的需要。若不能直接满足人类需要，就必须人为对其进行改造，蛋白质工程从而崛起。
第3章基因工程
【规律总结】蛋白质改造的三种类型的“改” 第一类为“大改”，即制造出自然界中不存在的全新蛋白质。第二类为“中改”，即在蛋白质分子中替代一个肽段或一个特定的结构域。第三类为“小改”，即改造蛋白质分子中的几个氨基酸的残基。素养达成：本重难点通过对蛋白质工程的概念分析和原理分析，培养“生命观念”“科学思维”素养。
【解析】蛋白质工程中了解蛋白质分子的结构是非常关键的工作，如蛋白质的空间结构、氨基酸的排列顺序等，这对于合成或改造基因至关重要，A正确；蛋白质工程的进行离不开基因工程，因为对蛋白质的改造要通过对基因的改造来完成，B错误；图中a、b过程分别表示转录、翻译，C正确；通过蛋白质工程可对现有蛋白质进行改造，也可制造出一种新的蛋白质，D正确。

蛋白质工程的原理和应用课件-高二生物人教版(2019)选择性必修3

A
酪氨酸酪氨酸
终止终止组氨酸组氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺天冬酰胺天冬酰胺赖氨酸赖氨酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸谷氨酸
G
半胱氨酸

半胱氨酸
C
终止、硒代半胱氨酸
A
色氨酸
G
精氨酸
U
精氨酸
C
精氨酸
A
精氨酸
G
丝氨酸
U
丝氨酸
C
精氨酸
A
精氨酸
G
甘氨酸
U
甘氨酸
C
甘氨酸
A
甘氨酸
G
基因定点诱变技术的示意图
第4节蛋白质工程的原理和应用
最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了各种颜色的荧光蛋白。
科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？
一蛋白质工程崛起的缘由
1.基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
2.基因工程的不足：基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质
(4)研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0,并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因,请你设计完成获得 SCID模型鼠的实验步骤: ①杂交亲本: F0×野生鼠 ,杂交得F1; ②F1雌、雄鼠随机交配得F2; ③提取F2每只小鼠的基因组DNA,采用分子生物学方法,利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选,
三蛋白质工程的应用
1.研发速效胰岛素类似物定点突变
天然蛋白质易形成预期降低胰岛素二聚体或六聚体功能的聚合作用
多肽链
翻译
转录
mRNA
新胰岛素基因

酶工程-重点整理总结

第一章绪论1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。

答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。

（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。

（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。

2、酶有哪些显著的催化特性？答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（107~1013倍）；（3）酶催化作用条件温和。

3、简述影响酶催化作用的主要因素。

答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。

酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。

（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。

（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。

一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。

（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。

（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。

（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。

如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。

第二章微生物发酵产酶1、试述酶生物合成的基本过程。

答：（1）RNA的生物合成—转录：转录的起始、RNA链的延伸、RNA链合成的终止、RNA前体的加工；（2）蛋白质的生物合成—翻译：氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止、蛋白质前体的加工。