蛋白质 分离纯化主要方法
蛋白质分离纯化的方法
蛋白质分离纯化的方法分离纯化蛋白质的四种关键性方法分离蛋白质的方法有许多种，应根据原材料和生产条件来选择具体的分离纯化方法。
例[5][6]如:李凤英等用盐溶法提取葡萄籽的蛋白质。
李喜红等用酶法从脱脂米糠中提取蛋白质。
[7]郭荣荣等碱法与酶法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特性比较研究得出结论是碱法提取的大米蛋白持水性、吸油性和起泡性优于酶法提取的大米蛋白，而酶法提取的大米蛋白的溶[8]解性、乳化稳定性和泡沫稳定性优于碱法提取的大米蛋白。
王桃云等就是运用这种方法配[9]合使用加热法提取葎草叶蛋白。
陈申如等用酸法提取了鲢鱼鱼肉蛋白质，提取的蛋白质无腥味，色泽洁白，蛋白质产率高，可达90%左右。
以下介绍四种分离纯化蛋白质的方法。
1区带离心法区带离心法是分离蛋白质的有效而且常用的方法。
该法的第一步是在离心管中形成一个密度梯度(常用蔗糖梯度)，然后将待分离的蛋白质混合液放在密度梯度顶端。
超速离心时，蛋白质即通过密度梯度移动，并根据其沉降系数而被分开，最后各种蛋自质在离心管内被分离成各户独立的区带，可以在管底刺一小孔逐滴放出，分部收集。
2 层析法最常用的层析法是凝胶过滤和离子交换柱层析。
[10-12]2.1 凝胶过滤(GFC)凝胶过滤也叫凝胶色谱和分子筛层析，是利用凝胶的网状结构根据分子的大小和形状进行分离的方法。
凝胶过滤是一种快速而简便的分离分析技术，可用于蛋白质的脱盐、分离、提纯、分析等等。
柱中的填充料是水合程度高而不溶的碳水化合物高聚物，最常用的是葡聚糖凝胶〔其他有聚丙烯酞胺凝胶和琼脂糖凝胶等)。
仙聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，不同型号的葡聚糖凝胶其“网眼”大小不同，可以用来分离纯化不同分子大小的物质。
当蛋白质混合物通过层析柱时，比“网眼”大的蛋自质分子不能进入凝胶颗粒内部，不能沿着颗粒间隙流动，流程短，流速快，最先流出柱外;比“网眼”小的分子则进入凝胶颗粒内部，沿着孔道移动，从一个颗粒流出，又进入另一颗粒，所以下移速度慢，随后被洗脱下来。
蛋白质的分离与纯化
（1）凝胶的选择：
。
（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀
后，配成
。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
① 固定：将色谱柱处置固定在支架上
② 装填：将
一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，
使凝胶填装均匀。
③ 洗涤平衡: 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用
3、具体过程：
相对分子质量 较小的蛋白质
（1）
（2） （3） （4）
（5）
相对分子质量 较大的蛋白质
A B
A
的蛋白质由于
作用进入凝胶颗粒内部而被滞
留；
的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间
迅速通过。
B（1）
混合物上柱；
（2）洗脱开始，
的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；
的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；
（3）
子
以及分子本身 、
的不同使带电分子产
生不同的
，从而实现样品中各种分子的分离。
3、分类： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳。
测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶
电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的
大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入
(4) 透析
2. 凝胶色谱制作
1）凝胶色谱柱的制作
① 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
② 底塞的制作：打孔 挖出凹穴
安装移液管头部 覆
盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5ml的 头部切
三种常见大豆蛋白质分离纯化提取方法是什么
三种常见大豆蛋白质分离纯化提取方法是什么大豆蛋白质分离纯化提取方法介绍
1、起泡法
起泡特种浓缩分离处理工艺是一项新的提纯技术，主要依据表面活性的差异，来分离和纯化物质的技术，大豆蛋白质的分离在一连续操作的泡沫精馏塔中完成，氮气由塔底通入池液，原料液由泡沫界面入进入塔内，泡沫由塔顶导出并被破碎成泡沫液，泡沫液即为分离出的大豆蛋白质。
该技术也被广泛应用于环境保护、生物工程、冶金工业及医药工业等许多途径，该技术也是分离和浓缩蛋白质及酶的一条有效途径。
2、双极膜电解法
这种方法是在电渗析的基础上发展而来，阴离子交换膜和阳离子交换膜以及阴阳离子交换膜中间的亲水层，达到大豆蛋白质的等电点而使蛋白质沉淀。
特种浓缩分离设备过程过程中不需要加入酸或碱调整蛋白质溶
液的pH值，避免分离得到的大豆蛋白质中混入盐离子，并且可保护大豆蛋白质的功能性。
3、膜分离技术
蛋白质分离纯化设备选用膜分离提取技术可大大提高蛋白质的提取率，一般都可高达90%以上。
将浸提液进行循环超滤分离，截留液的浓度可达15%左右。
与传统蛋白质提取工艺比较，具有能源消耗小、产品品质好、提取物的产量高、废水回收利用率可高达90%以上，而且处理后的废水可达到国家排放标准，不仅解决了环境污染等问题还提高了水资源的利用率。
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蛋白质分离纯化
2. 3 等电聚焦
依据：在pH梯度中的平衡位置。
用两性电解质，多乙烯多胺与丙烯酸的同系多异构体 混合物。在电场作用下，形成连续平滑的pH梯度， 而酶样品在其中也形成相同的等电点pH梯度。 分辩率高，pI相差0.01 pH的酶与蛋白质可分离 。
注意：在pI附近蛋白质容易沉淀，影响分离的数量和 质量。
1 蛋白质的分离方法
（1）以大小或质量为依据： 离心（300000g)、凝胶过滤（Sephadex交联葡聚糖、
Bio-Gel交联聚丙烯酰胺）、透析、超过滤
（2）以电荷为依据： 离子交换色谱（低离子强度、适当pH） DEAE-
Sephadex、 CM- Sephadex、 DEAE-纤维素、CM-纤维 素；电泳（电荷、分子大小、分子形状）、纤维素粉末、 淀粉、聚丙烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置）
（3）以溶解度变化为依据
3.1 盐析--改变pH(等电点沉淀法) 3.2 盐析--改变离子强度 3.3 PEG沉淀法
3.1 改变pH (等电点沉淀法)
调整pH至酶的等电点。
原理： 溶解度随分子引力加大而减小，其他条
件相同，当pH在等电点附近时,分子引力最大， 蛋白质就沉淀。
一般不单独使用，配合其他方法使用。
3.2 改变离子强度
• 盐溶现象：加入离子有助于分散大分子上 所带的电荷而使溶解度提高。
• 盐析：离子强度提高到超过某一数值，带 电分子将会沉淀下来。
1. 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质 的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐 析。 2. 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 3. 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 4. 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
生物化学实验-蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化
离子交换层析
蛋白质分离纯化
离子交换层析
蛋白质分离纯化
离子交换层析
蛋白质分离纯化
小
结
粗分级一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级 等方法；
细分级一般采用层析法，包括凝胶层析、离子交换 层析、吸附层析、亲和层析等方法。必要时，还可 采用电泳法，包括等电聚焦等作为蛋白质的提纯步 骤。
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分离大蛋白质、小蛋白质，除盐
琼脂糖凝胶（瑞典Sepharose、美国Bio-GelA）
孔径大，用于分离大分子物质
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
蛋白质分离纯化
凝胶层析
原理：
1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗 脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子 物质迁移速度快；
注意事项：1、时间相对长对分离有利； 2、也可用来测定蛋白质的等电点。
蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化
等电聚焦（ Isoelectric focusing）
蛋白质分离纯化
离子交换层析
可分为阳离子交换---与阴离子交换---。 1、树脂类：分离氨基酸，孔径小；
蛋白质分子量的测定
最小分子量测定法 如Mb含Fe为0.335%，则
M=55.8/0.335%=16700。这就是最小分子量。
其实，真实分子量是最小分子量的n倍，n指Fe 的数目，Mb的n=1，所以M=16700；而Hb用其他方法 测得分子量为68000，则说Hb含4个Fe原子。
对蛋白质分离纯化的方法
对蛋白质分离纯化的方法
1. 离心法: 根据蛋白质在离心过程中的分子大小和密度差异来分离纯化。
2. 比重梯度离心法: 根据蛋白质在不同比重梯度溶液中的沉降速度差异来分离纯化。
3. 柱层析法: 根据不同蛋白质在柱层析时对填充物的亲和性来分离纯化。
4. 电泳法: 根据蛋白质在电场中的电荷、竞争离子浓度和分子大小等因素来分离纯化。
5. 凝胶过滤法: 根据蛋白质分子大小来分离纯化。
6. 亲和层析法: 根据蛋白质与特定配体之间的亲和性来分离纯化。
7. 免疫沉淀法: 根据蛋白质与抗体之间的特异性作用来分离纯化。
8. 磷酸盐析法: 根据蛋白质在不同磷酸盐浓度下的溶解度差异来分离纯化。
蛋白质分离纯化
蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
是当代生物产业当中的核心技术。
该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。
常用技术有：１、沉淀，２、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。
根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
３、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
４、层析：a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定ＰＨ时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。
如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b.分子筛，又称凝胶过滤。
小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
５、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
编辑本段蛋白质分离纯化技术蛋白质的分离纯化一、沉淀法沉淀法也称溶解度法。
其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。
1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。
2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。
3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。
4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。
5、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。
试述蛋白质分离纯化的主要步骤及方法
试述蛋白质分离纯化的主要步骤及方法下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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蛋白质的分离纯化
度最大,向上逐渐减小
常用的密度梯度有 蔗糖梯度(图) 聚蔗糖梯度 其他合成材料的密度梯度 蔗糖便宜，纯度高，浓溶液（60％，w/w）密度可达1.28g/cm3。 聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1- 氯-2,3-环氧丙烷合成的 高聚物，Mr 约400000。
需要高密度和低渗透压的梯度时，可用Ficoll代替蔗糖。
脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。
2、粗分级分离
盐析 方法 等电点沉淀 有机溶剂分级分离 蛋白质提取液体积较大，则可采用 超过滤 凝胶过滤 冷冻真空干燥 或其他方法（如聚乙二醇浓缩法） 特点 简便 处理量大 既能除去大量杂质（包 括脱盐），又能浓缩蛋 白质溶液
3、细分级分离
凝胶过滤 一般使用层析法 包括
第三节 蛋白质的分离纯化
一、蛋白质分离纯化的一般原则：
蛋白质纯化的总目标 增加制品的纯度或比活 (1)前处理：把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态
蛋 释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生 白 质 物活性。 的 分 (2)粗分级分离：将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。 离 纯 (3)细分级分离：样品的进一步纯化。 化 步 (4)结晶：是蛋白质分离纯化的最后步骤。 骤
盐析法的一般操作是：
选择一定浓度范围的盐溶液（如0-25%饱和度硫酸铵），使部
分杂质呈“盐析”（沉淀）状态，有效成分呈“盐溶”（溶解
）状态。经离心分离后得到上清液，再选择一定浓度范围的盐 溶液（如25%-60%饱和度的盐溶液），使有效成分等物质呈盐 析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物 即为初步纯化的有效成分物质。
过硫酸铵
丙烯酰胺、Bis和TEMED的水溶液
激活 TEMED 通过Bis交联 ②光聚合: 活化 聚合
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。
蛋白质的分离纯化-湛涛
凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒 的层析柱。当在柱顶加上分子大小不同 的混合物并用洗脱液洗脱时，自由通透 的小分子可以进入胶粒内部，而受排阻 的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗 脱过程中走过的路程差别较大，大分子 只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所 经路程短，最先流出。而渗入胶粒内部 的小分子受迷宫效应影响，要经过层层 扩散向下流动，所经路程长，最后流出 。通透性居中的分子则后于大分子而先 于小分子流出。从而按由大到小的顺序 实现大小分子分离。
样品制备中注意的原则
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包 括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 （如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保 证待研究蛋白的可检测性。 保证蛋白质原有的天然状态，不丢失活性物质。
分子电荷不同
离子交换层析、电泳
分子极性不同
等电点沉淀、PH值调节、有 机溶剂法、反相色谱法 亲和层析
亲和力不同
基于蛋白质分离的复杂性，至今还 没的单独或一套现成的方法能够把任 何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中 提取出来，因此往往根据蛋白质分子 的性质选用特定的分离方法，也经常 将几种方法联合使用来达到更好的效 果。 蛋白质的分离纯化技术还在不但探 索和发展中…… 索和发展中……
谢
谢 ！
★
离子交换层析
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相， 液体为流动相的系统中进行的。离子交换 剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物 的反应主要以离子交换方式进行，或借助 离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离 子化合物的吸附作用进行。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离.根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐.由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢，截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α—淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3］。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度（区带）离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白，得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等［6］通过比较不同密度梯度介质的分离效果，利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白.凝胶过滤也称凝胶渗透层析，是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之，比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外.目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
蛋白质分离纯化主要方法
离子互换树脂 、纤维素、
葡聚糖
带配基旳sepharose
或sephadex
多缓冲互换剂（与带有多种电
荷基团旳配体相偶联旳
sepharose 6B）
15
吸附层析（absorption chromatography）
原理： 以吸附剂作为固定相，选择合适旳溶剂作流
动相。因为多种物质旳极性不同，被吸附剂吸附 旳程度和在流动相中旳溶解度不同。层析时，当 流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度 地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再 吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。
液），这些基质能与待分离旳化合物进行可逆
旳吸附，溶解，互换等作用。它对层析旳效果
起着关键旳作用。
12/1/2023
10
2.流动相： 在层析过程中，推动固定相上待分离旳
物质朝着一种方向移动旳液体、气体或超 临界体等，都称为流动相。柱层析中一般 称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它 也是层析分离中旳主要影响原因之一。
12/1/2023
2
沉淀法
盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐
沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热 变性沉淀法
分
离子互换层析 吸附层析
离
层析法
凝胶过滤（分子筛）
纯
亲和层析
化
等电汇集层析
措
电学法
电泳法
施
等电聚焦
离心法
透析
膜分离技术 超滤
12/1/2023
3
纯度鉴定 分子量测定
层析法：凝胶过滤; 高效液相色谱法(HPLC) 电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等 免疫化学法：专一旳沉淀线
12/1/2023
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蛋白质的分离纯化技术
蛋白质的分离纯化技术1、根据蛋白质带电性质不同的分离技术1.1离子交换层析以离子交换剂作为柱填充物，在中性条件下，根据由于蛋白质和多肽的带电性不同而引起的离子交换亲和力的不同而得到分离。
其可分为阳离子柱和阴离子柱两大类, 还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂等。
离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。
当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强。
随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质按吸附能力从小到大的顺序先后洗脱下来。
1.2电泳法电泳为带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离。
现在常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以因不同蛋白质所带电荷的差异和大小差异高分辨率地分离或分析蛋白质。
在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS）,可以消除蛋白质所带电荷的差异，构成的SDS-PAGE系统是测定蛋白质的相对分子质量最常用的方法。
2、根据蛋白质溶解度不同的分离技术2.1蛋白质的盐析蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。
2.2有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。
近年来的研究认为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生变化，致使一些原来包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。
利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。
蛋白质分离纯化主要方法
蛋白质分离纯化主要方法
一、抽提
1、抽提冷冻干燥法
抽提冷冻干燥法是抽提当中常用的一种方法，能将活性蛋白以及未发生水解的蛋白从膜结构层中抽提出来，这种方法是一种简单、快捷、方便的抽提方法，可以较为有效的分离纯化未发生水解的蛋白，其原理是，将膜结构或者蛋白质复合物冷冻干燥，冷冻干燥后的蛋白质复合物会在温度迅速升高的情况下发生水解，蛋白质以抽提的形式分离出来，进而得到纯的蛋白质。
2、抽提凝胶凝集法
抽提凝胶凝集法是将蛋白质和抗体通过凝胶结合产生凝集反应，分离纯化蛋白质的一种方法。
这种方法可以将蛋白质从活性溶液和抗性溶液中分离出来，凝胶凝集反应主要是利用结合反应，将蛋白质物质结合到凝胶表面上，然后用浓盐溶液洗去不结合的物质。
蛋白质分离纯化的步骤
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
（―）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法
蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法文章出处：朱敏蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。
有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。
常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。
用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。
分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。
操作时的pH 值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。
有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。
一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol 左右, 过多不仅耗费有机溶剂, 而且可能导致沉淀不好. 沉淀的条件一经确定, 就必须严格控制, 才能得到重复性结果. 有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示. 故操作条件比盐析法严格。
许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。
其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。
某些第3组分的存在可以改变两相的比例和组成。
有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。
在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。
根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。
因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。
分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。
疏水层析是近年发展的新方法。
它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。
洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。
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原始缓 冲溶液 的反离 子
5.再生阶段： 用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用
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样品溶液
梯度浓度
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应用
制备、纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分
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基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、
sepharose、sephadex
应用 分离纯化酶、 抗原、抗体
分离纯化核酸 研究酶的结构与功能
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聚焦层析（Chromatofocusing） 原理
该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其 分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行 为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过 程叫做聚焦效应。
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（三）按支持介质形状不同 1.薄层电泳 ； 2.板电泳 ； 3.柱电泳。 （四）按用途不同可分为： 1.分析电泳； 2.制备电泳； 3.定量免疫电泳；
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（五）按所用电压不同可分为： 1.低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适
于分离蛋白质等生物大分子。 2.高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有
电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。
4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯
度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集
成很窄的区带。
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（二）按支持介质的不同可分为： 1.纸电泳 2.醋酸纤维薄膜电泳 3.琼脂凝胶电泳 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳 5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。
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分配层析(p148)
原理：
分配层析是利用混合物(样品)在二种或二种 以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离 的方法
分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸 层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机 溶剂为流动相（展开剂）。
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样品在层析时的移动速度可用迁移率Rf值表示：
样品原点到斑点中心的距离
Rf= ——————————————
样品原点到溶剂前沿的距离
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(二) 层析相关概念
1.固定相：
固定相是层析的一个基质。它可以是固体物
质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可
以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶
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亲和层析（affiuity chromatography）
原理
欲分离的大分产物质S和相对应的专一物质L(配体) 以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L—S。其 中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形 成M—L—S复合物。根据L—S之间能可逆地结合与解 离的原理发展起来的层桥方法称为亲和层析法。
SDS- PAGE电泳法：测定亚基数 超速离心：成分均一 其它：如, 结晶法……
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一透 析
定义：利用半透膜把大小分子分开的方法。
操作
蛋白质溶液置半透膜袋中，置流动溶剂 （如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、 单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于 袋中而得到分离。
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分类： 根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，
阳离子交换剂; 阴离子交换剂； 按其解离度的大小， 分为强、中强、弱三种：
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阳
离 子 交 换
离 子 交 换 剂
强酸型 中等酸型 弱酸型
结合磺酸基团（ SO3H） 磷酸基团（ PO3H2）和亚磷酸基团（ PO2H） 结合酚羟基（ OH ）或羧基（ COOH）
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电泳的一般原理
电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电 极移动的现象 。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少 取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各 组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性 质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用 下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组 分的目的。
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1、pH梯度的形成 2、蛋白质行为 3、聚焦效应
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流速
移动速率
蛋白质1（pI=7）
蛋白质2（pI=8）
pH梯度溶液的形成示意图
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层析时的聚焦效应示意图
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几种主要层析方法比较
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二 、 电泳技术
电泳的一般原理 电泳技术的分类 电泳的影响因素 常用电泳技术
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原理p303
凝胶层析是依据分子大小这一物理性质
进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性
的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体
网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子
大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个
组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散
程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
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3、琼脂糖电泳
4、毛细管电泳
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聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
凝胶聚合反应及催化系统 不连续PAGE 可产生的三种效应：
电荷效应、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis PAGE ），是以聚丙烯酰胺凝 胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙 烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉 双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚 合过程需要有自由基催化完成。
各类层析的原理和载体
类别
分离原理
吸附层析
化学、物理吸附
分配层析
两溶剂相中的溶解效应
凝胶层析
分子筛效应的排阻效应
离子交换层析 离子基团的交换反应
亲和层析 聚焦层析
分离物与配体之间有 特殊亲和力 等电点和离子交换作用
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基质或载体
硅胶、氧化铝 、羟基磷酸
纤维素、硅藻土 、硅胶
sepharose 、sephadex
物质在纸上移动的速度可以用Rf表示： 色斑中心至原点中心的距离
Rf = ────────────── 溶剂前缘至原点中心的距离
载体 ： 纤维素 硅藻土 硅胶
应用：各种生化物质的分离鉴定
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凝胶层析（gel filtration）
又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、 凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。
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透析工作图
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半透膜原理
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二 层析技术（chromatography） p148
一、层析技术一般原理
二、层析技术分类及应用
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（一）、层析技术原理
层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析，其系统通 常由互不相溶的两个相组成：一是固定相（固体或吸附在固体 上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合 物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性 、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布 在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度 移动而最终被分离。
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沉淀法
盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐
沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热 变性沉淀法
分
离子交换层析 吸附层析
离
层析法
凝胶过滤（分子筛）
纯
亲和层析
化
等电聚集层析
方
电学法
电泳法
法
等电聚焦
离心法
透析
膜分离技术 超滤
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纯度鉴定 分子量测定
层析法：凝胶过滤; 高效液相色谱法(HPLC) 电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等 免疫化学法：专一的沉淀线
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电泳分类
• （一）按原理分四种
• 1.区带电泳：是当前应用最为广泛的电泳技术。
2.自由界面电泳： 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家
Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无
支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。
3.等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各
层 阴 强碱型
季胺基团（ N(CH3)3），
析 分
离 子
中等碱型叔胺（
N(CH3)2）、仲胺（
NHCH3）、伯胺（-N
类 交 弱碱型
二乙基氨基乙基（DEAE）
换
剂
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交换过程
1
2
3
4
5
1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合
2.吸附阶段：样品与反离子进行交换
液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆
的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果
起着关键的作用。
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