WesternBlot实验详解(--)
WesternBlot详解（原理、分类、试剂、步骤及问题解答）
WesternBlot详解（原理、分类、试剂、步骤及问题解答）Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
Western Blot实验(蛋白质印迹法)
时间：2016-05-07
一：蛋白定量（实验前处理）
• 组织：到手的组织状态：冰袋快递：组织腐烂，蛋白含量减少 干冰快递：基本无影响 甲醛处理：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒 需用匀浆器，液氮等方法加入1*PBS充分研磨 裂解液量：组织（g）：裂解液（ml）=1:10 细胞：一般为细胞悬液实验前需确定细胞大概浓度 裂解液量： 107数量细胞加入1ml裂解液
五：封闭（过程）
• 丽春红染色漂洗完成后。 • 清洗干净的膜放入盛有5%BSA的容器中，室温 封闭60-90min，或者4度过夜。
• 5%BSA：秤取2gBSA
加40ml 1xPBS(或TBST)
六：一抗孵育（查询抗体）
决定二抗属性 条带大小
适用实验
一抗稀释比例
六：一抗孵育（过程）
• 封闭完成前，参照说明书将一抗用5%BSA稀释到足够实验 需求的量（无特殊要求，一抗稀释液用封闭液）。 • 封闭完成后，从膜上剪下宽度为1.5cm左右相应蛋白大小 条带，倒掉封闭液，加入稀释好的一抗溶液，摇床上平缓 摇动，室温孵育120min或4℃孵育过夜。 • 一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液（有回收要求的抗体，回 收一抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，第一次漂洗 主要漂洗BSA，冲刷后便可倒去，TBST可以加至膜漂浮在 液体中，每次10min。
• 分离胶
分离胶浓度 试剂 6% 分子量（kDa) 去离子水（ml） 30％丙烯酰胺（ml） 1.5MTris－HCl （PH8.8）（ml） 10％SDS（ml） 10％AP（ml） TEMED（ul） 总体积（ml） ≥94 5.3 2 2.5 0.1 0.1 0.008 8% 70-94 4.6 2.7 2.5 0.1 0.1 0.006 10% 55-70 4.0 3.3 2.5 0.1 0.1 0.004 12% 20-55 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 15% 10-20 2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.004 18% ≤10 1.3 6.0 2.5 0.1 0.1 0.004
western blot 详解
原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜 离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成 为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋 白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合 二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复 合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上 到下运动（负极到正极）， 分开
四 转膜
准备物品：转移槽 黑红夹子 NC膜 滤纸 海绵垫 转
膜缓冲液 （1） 转一张膜需准备6张滤纸和1张NC膜。 切滤纸 和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X 转模缓冲液浸湿。 • 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至 20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵 ①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。 ②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后 震荡。
灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余 空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板 流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满 浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气 泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。
冰箱过夜 待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草 纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放 于草纸上，包好。放入4℃冰箱过夜。
WesternBlot详解及问题分析
缓冲液PH
pH6.8TrisCl
pH8.8TrisCl
凝胶浓度
低，2-5%
高，根据蛋 白大小
电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
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灌制积层胶 插入梳子
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Staking gel Separating gel
原 • 膜没有因均匀浸湿
• 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿
• 膜或者缓冲液污染 • 封闭不充分
• 拿取膜与吸水纸时要戴手
对
套，更换新鲜转膜缓冲液
• 抗体与封闭剂出现交 策 • 检测一抗、二抗与封闭剂
叉反应
是否有交叉反应
• 抗体浓度过高
• 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
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杂交信号很弱
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入AP和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部
分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 ➢ 两块玻璃板底部要对齐
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SDS-PAGE电泳
条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提 取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白
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蛋白样品的定量
➢ 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford 法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂 法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据 具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说 明操作，测定样品浓度。
WesternBlot实验详解(--)
Western Blot 实验详解、实验材料Western Blot 相关试剂：甘氨酸，最后加入 200ml 甲醇。
4 C 保存。
文档收集自网络，仅用于个人学习30%储备胶：丙烯酰胺 Acr 29.0g 、亚甲双丙烯酰胺（Bis ） 1.0g ，混匀后加入去离子水37 C溶解，定容至100ml 。
4C 避光保存。
文档收集自网络，仅用于个人学习10%AP （过硫酸铵）：称取1gAP ，加入10ml 去离子水搅拌。
分装，-20C 保存。
Western BIot 相关仪器：电泳仪；转移仪；摇转仪。
二、实验原理经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体 以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
文档收集自网络，仅用于个人学习2X Sample Buffer : 1ml Glycerol （甘油）；0.5ml Beta mercaptoethanol （B -巯基乙醇）；3ml 10%SDS; 1。
25ml 4 X Upper buffer; 4.25ml dH 2O; Add bromop he nol blue （溴酚蓝）to color 。
文档收集自网络，仅用于个人学习10X 电泳缓冲液（pH 8.3 ）:在1L 大烧杯中加入800ml 去离子水，称取 Tris 30.2g 、甘氨酸 188g ，混匀，加入100ml 10%SDS ，定容至1L 。
（注：SDS 在68C 水浴中溶解）。
工作液：1 X 电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。
文档收集自网络，仅用于个人学习1.5M Tris-HCl （pH8.8） : Tris 181。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
Western Blot 实验步骤及注意事项
Western Blot 实验步骤及注意事项western blot的实验步骤及注意事项一、实验步骤1.缓冲液配制(1) Transfor Buffer: 2.9g Glycine, 5.8gTris, 0.37g SDS（可不加）, 200ml Methanol（临用前加）,ddH2O to 1L(2)10×TBS: 1 M Tris・HCl（pH 7.5）100 mL, 88 g NaCl, ddH2O to 1L (3)TBST: 1×TBS中加入1/1000的Tween (4)封闭液：脱脂奶粉5%(w/v),用TBST配制 2. SDS-PAGE电泳电压：积层胶电泳电压80V左右，分离胶电泳电压110V~120V 3.免疫印迹(1) SDS 聚丙烯酞胺凝胶电泳结束后，将胶放至转移缓冲液中浸泡15m in，切6张Whatman 3mm滤纸和1张PVDF膜，与凝胶大小相符合。
将PVDF膜事先用甲醇浸泡，再用转移缓冲液浸泡。
(2) 将凝胶及PVDF膜以“三明治”状(即3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸)逐层铺于转印仪上，凝胶一面连接阴极，100 V转移40 min（根据转移蛋白的分子量确定转移时间）。
(3) 将膜放入小盒中，加入5 mL封闭液，摇床上温育1 h。
(4) 以1/1000的比例，加入5 μL第一抗体，4 ℃温育过夜。
(5) TBST溶液洗膜10 min，轻倒，重复3次。
(6)加入 5 mL TBST溶液，以1/2000的比例，加入2.5 μL第二抗体，温育1 h。
(7) TBST溶液洗膜5min，轻倒，重复3次。
(8)加入2 mL显色底物温育3 min，将薄膜封入保鲜袋中，压平，尽可能不留空气，滤纸吸干显色底物。
放入夹板中。
(9)配制显影液和定影液。
暗室操作：将X光片放入夹板中，曝光5 s（根据荧光强度确定），然后放入显影液中，至出现明显的条带取出，水洗后放入定影液中，定影一段时间，取出用水冲洗干净。
生化实验九 Western_blot的原理、操作
实验九 Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。
(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)4)待胶凝集好后，上样，电泳。
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
Western blot 实验原理和实验步骤
3 Western blot 流程图
Western Blot一般流程
1
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 洗膜 二抗杂交 洗膜 底物显色
蛋白样品的制备
2
1、细胞的处理：1、细胞计数，取5*10^4/well，500g离心5min。加入200ul PBS混匀，500g离心5min。去掉废液加入15ul PBS 再加入5ul 5Xloading buffer， 100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。
第三步：是用自特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测 的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂 交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（知AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的 抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光 的条带来道显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
Western blot 实验原理和实验步骤
为什么要做蛋白质印迹实验？
研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。
目录
1
Western blot 基本原理
2
蛋白免疫印迹的组成
3
Western blot 一般流程
洗膜 用 TBST摇动洗三次，每次10min。 洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结 果背景的深浅。
二抗杂交
13
1、将PVDF膜放在密闭的自封袋或抗体盒中，加入稀释好的荧光二抗， 孵育 RT 0.5小时。（ 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例参照说明书） 注：二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。
Westernblot实验步骤详尽版
Westernblot实验步骤详尽版Western bolt 实验步骤详尽版蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳实验目的：分离目的蛋白实验仪器：移液枪，玻璃瓶，胶模，垂直板电泳槽，电泳仪，水浴锅，通风橱，染色和脱色用器皿实验材料：ddH2O，30%丙烯酰胺溶液（Acrylamide-Bisacrylamide 29：1），1.5M Tris-HCl，0.5M Tris-HCl，10%SDS，10%APS，TEMED，1*蛋白上样缓冲液，5*蛋白上样缓冲液，考马斯亮蓝R250，0.2M KCl溶液，欲染蛋白marker，1*SDS-PAGE电泳缓冲液实验步骤：1.安装制胶模具。
2.调制5ml 12%的分离胶，立即灌注至模具高度的70%（绿杠下缘）。
5ml 12%分离胶的配方：1.8ml ddH2O，2.0ml丙烯酰胺溶液，1.3ml 1.5M的Tris-HCl缓冲液，0.05ml 10%SDS，0.05ml 10%APS，0.002ml TEMED。
3.加一层ddH2O，约30分钟后聚合（胶凝固），胶层和水层可见折光界面。
4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。
5.调制1ml 5%浓缩胶，立即灌注，插入梳子。
静置。
1ml 5%浓缩胶配方：0.55mlddH2O，0.17ml丙烯酰胺溶液，0.26ml 0.5M的Tris-HCl缓冲液，0.01ml 10%SDS，0.01ml 10%APS，0.001mlTEMED。
6.胶凝后装配垂直板电泳槽，向电泳仪倒入1*SDS-PAGE电泳缓冲液，内槽倒满，外槽倒至一半高度。
7.取16μl蛋白样品与4μl的5*蛋白上样缓冲液混合，水浴锅内煮沸5分钟。
取6μl蛋白marker与6μl 1*蛋白上样缓冲液混合。
8.加样电泳，每孔加样12μl。
电泳参数为：70V 15分钟左右，150V 30分钟左右。
（时间可以调整，以欲染Marker各条带清晰为准）9.卸下玻板，剥离凝胶放在盛有转膜缓冲液的器皿内，切下目的蛋白所在区域的凝胶，注意保留欲染Marker，且最好保留多条欲染Marker条带（因此电泳时间也不要太长，让Marker紧凑一些）。
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
western blot实验内容
western blot实验内容Western Blot实验内容可以简单描述为一种生物化学分析技术，主要用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。
该实验通常包括以下步骤：1. 样品制备：首先，从细胞培养物或组织中提取蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来完成。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。
在SDS-PAGE中，样品中的蛋白质按照大小被分离成不同的带状条带。
3. 转印：将分离的蛋白质通过电泳转印技术转移到聚丙烯酰胺薄膜（或称为膜）上。
膜可以是尼龙膜或聚乙烯膜。
4. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白或脱脂奶粉）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将膜与特异性抗体（一抗）一起在某种缓冲液中孵育。
这些一抗可以结合到目标蛋白质上。
6. 洗涤：通过多次洗涤，去除与一抗非特异性结合的蛋白质。
7. 二抗孵育：膜与与一抗的物种不同的次级抗体（二抗）一起在缓冲液中孵育。
二抗与一抗结合，形成复合物。
8. 洗涤：去除与二抗非特异性结合的蛋白质。
9. 显色：将特定酶底物添加到膜上，使目标蛋白质变色。
例如，常用的酶底物是辣根过氧化物酶（HRP）和4-氨基乙基硅烷（DAB），可以生成棕色的色斑。
10. 图像获取和分析：使用相应的设备（如基于膜的成像系统）捕捉膜的图像，并使用分析软件定量分析蛋白质的表达水平。
通过Western Blot实验，研究人员能够检测和定量不同细胞组分中蛋白质的存在和表达水平，从而深入了解生物系统的功能和调控机制。
WesternBlot实验方法
WesternBlot实验⽅法⼀、溶液配制1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10 ml称取NaF 41.99mg，超纯⽔8ml溶解后定容⾄10ml2.30%聚丙烯酰胺凝胶液（交联度3%）：100ml丙烯酰胺29 gN,N'-甲叉双丙烯酰胺 1 g加去离⼦⽔⾄100 ml 混匀,棕⾊瓶中避光保存3.0.01mol/L ⼄酸钠NaOAc（pH 5.2）（MW=136.08）25ml136.08×0.01×25×10-3=34 mg，称取34 mg⼄酸钠，加⼊20ml蒸馏⽔，待其溶解后，⼄酸调pH值⾄5.2，再定容⾄25ml。
4.1M DTT 10 mlDTT(⼆硫苏糖醇) 1.545g0.01mol/L ⼄酸钠（pH 5.2）8ml溶解后定容⾄10ml，0.22µm滤膜抽滤。
5.4×SDS-PAGE Loading Buffer 10ml0.2M Tris-HCl(pH=6.8) 1M 4 ml8% SDS 10% 0.8 g0.4% 溴酚蓝40 mg40% Glycerol 4 ml三蒸⽔定容⾄10 ml0.4M DTT 临⽤前1M贮存液按400 µl/ ml⽐例加⼊上述溶液中。
6. 1.5M Tris(pH 8.8) 100 mlTris 18.171 g加⼊三蒸⽔80 ml，溶解后加⼊浓HCl调pH值⾄8.8，定容⾄100ml7.1M Tris(pH 6.8) 100 mlTris 12.114 g加⼊三蒸⽔80 ml，溶解后加⼊浓HCl调pH值⾄6.8，定容⾄100ml8.1×电泳缓冲液：1000 ml0.25M Tris 3 g0.19M Glycine 14.4 g0.1% SDS 1g三蒸⽔定容⾄1000 ml9.1×Transfer Buffer：1000 ml0.25M Tris 3 g0.19M Glycine 14.4 g三蒸⽔定容⾄900 ml使⽤前加⼊甲醇100ml10.PBS Buffer137 mM NaCl 8g2.7 mM KCl 0.2 g10 mM Na2HPO4 1.44 g2 mM KH2PO4 0.24 g三蒸⽔定容⾄1000 ml调节pH值⾄7.4，⾼压灭菌，4℃保存11.PBST Buffer500 ml PBS中加⼊250 µl Tween-20。
蛋白质免疫印迹实验(Western Blot
二试剂和器材
2．器材 电转移仪器 恒温摇床 硝酸纤维素薄膜 Whatman 3MM滤纸 电泳仪 裁纸刀 φ25cm培养皿
玻璃棒
三 操作步骤
1蛋白质电转移 戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的 硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
其定量关系符合以下公式： Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 39mM甘氨酸 4.8mM Tris碱 0.037% SDS 20% 甲醇 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲醇， 定容到1000ml. 封闭缓冲液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于PBS中
一 实验原理
western blot 详解
原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜 离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成 为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋 白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合 二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复 合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：
• 单体：丙烯酰胺（Acr）；
• 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；
• 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； • 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； • 产物：三维网状结构凝胶
聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)
的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
二 配制浓缩胶
准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶 液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温）
整个操作在1X转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两 边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
③将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面， 夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一 边放一块冰来降温。一般用100V转移1.5h。实际上 应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间
④不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换 用转膜装置，最好再摸个条件；
完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项蛋⽩质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)可以使⽤适当的裂解液。
收集完蛋⽩样品后，为确保每个蛋⽩样品的上样量⼀致，需要测定每个蛋⽩样品的蛋⽩浓度。
根据所使⽤的裂解液的不同，需要采⽤适当的蛋⽩浓度测定⽅法。
因为不同的蛋⽩浓度测定⽅法对于⼀些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很⼤。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋⽩样品中加⼊适量浓缩的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
使⽤5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液可以减⼩上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋⽩样品。
100℃或沸⽔浴加热3-5分钟，以充分变性蛋⽩（根据蛋⽩分⼦的⼤⼩，煮沸时间可适当变化，⼀般不低于5min。
煮沸只是变性蛋⽩，⽽不是分解，⼀般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋⽩质的⽴体⼆级结构,伸展为⼀维线性结构,所以⼀般来讲⼆聚体都会解体,才能完全按照分⼦量跑电泳,加的蛋⽩Marker才有指⽰分⼦量的意义。
蛋⽩样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋⽩呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离⼼5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另⼀管,4度可以放⼀周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：⼀只⼿扣紧玻璃板，另⼀只⼿蘸点洗⾐粉轻轻擦洗。
两⾯都擦洗过后⽤⾃来⽔冲，再⽤蒸馏⽔冲洗⼲净后⽴在筐⾥晾⼲。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧。
然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。
实验记录-Western-Blot之跑胶与转膜
Western blot之跑胶与转膜（一）跑胶：1.蛋白样品准备：取一些之前做蛋白提取定量后已知浓度的蛋白样品，将所有蛋白样品调至等浓度（我们一般加入适量的RIPA），充分混合后，将样品与5X的loading buffer按4：1比例混合，并置于沸水中煮5min使蛋白变性，冷却至室温后放冰上备用（上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品）；2.将胶连同玻璃板放置于电极架上，（梳子的一面朝里）固定好放入跑胶的缸子里，倒入一些running buffer；3.小心拔出梳子，避免破坏胶孔；4.上样：每块胶选1个孔加入5ul marker，加样一定要缓慢、稳，尽量选中间孔加入蛋白样本，尽量避免产生气泡，如果每个蛋白样本上样体积差异较大，可用1Xbuffer增加体积较少的孔，避免孔重差异导致相邻两蛋白条带的长短不一，上样完成后再加入一些1X的running buffer；5.电泳：连上电极，黑----黑，红----红，先开70v试跑，待样品进入分离胶后电压改为100v，（根据你蛋白样本分离情况调整时间），或当溴酚蓝接近或刚出胶底部时候可终止电泳；(二)转膜原理：转膜的原理是利用结合SDS的蛋白抗原带负电荷，在电场作用下从凝胶中转移至膜上。
方法是制作三明治夹板（海绵垫-滤纸-膜-凝胶-滤纸-海绵垫），放转膜槽中转膜，使蛋白质在电场力的作用下，从凝胶转移到膜上，膜可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
1、物品准备：转移缓冲液（Tris5.8g 甘氨酸2.9g SDS 0.37g 甲醇200ml V=1L）、转膜用的夹板、两块海绵垫、4-6张滤纸、一张PVDF膜。
2、剪切适合大小的膜，放在甲醇溶液中浸泡，滤纸和海绵垫提前放入transfer buffer中浸泡；3、三明治夹板：先在托盘中倒入适量transfer buffer,然后依次放入转膜夹子---海绵垫---滤纸---PVDF膜---胶---滤纸---海绵垫，三明治夹板制作过程中一定要避免产生气泡，一定要充分排出气泡，使夹板夹紧，保证对凝胶有一定压力。
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Western Blot实验详解
一、实验材料
Western Blot相关试剂：
2×Sample Buffer：1ml Glycerol（甘油）;0.5ml Beta mercaptoethanol（β-巯基乙醇）; 3ml 10%SDS; 1。
25ml 4×Upper buffer; 4.25ml dH2O; Add bromophenol blue （溴酚蓝）to color。
10×电泳缓冲液（pH 8.3）：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，称取Tris 30.2g、甘氨酸188g，混匀，加入100ml 10%SDS，定容至1L。
（注：SDS在68℃水浴中溶解）。
工作液：1×电泳缓冲液去离子水稀释室温保存。
1.5M Tris-HCl(pH8.8)：Tris 181。
7g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH8.8，定容至1L 室温保存。
1M Tris-HCl(pH6.8)：Tris 121.1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7.5，定容至1L 室温保存。
10×TS(洗膜液)：在800ml去离子水，加入Nacl 90g，1M Tris-HCl(pH7.5) 100ml，去离子水定容至1L。
工作液：1×TS 室温保存。
1M Tris-HCl(pH7.5)：Tris 121.1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7.5，定容至1L 室温保存。
10%SDS：称取十二烷基磺酸钠（SDS）10g，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解。
用10%HCl 调pH至7.2，定容至100ml。
1×Transfer Buffer：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，加入3.03g Trisgrams，14.43g 甘氨酸，最后加入200ml甲醇。
4℃保存。
30%储备胶：丙烯酰胺Acr 29.0g、亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加入去离子水37℃溶解，定容至100ml。
4℃避光保存。
10%AP（过硫酸铵）：称取1gAP，加入10ml去离子水搅拌。
分装，-20℃保存。
Western Blot相关仪器：
电泳仪；转移仪；摇转仪。
二、实验原理
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、操作程序与结果判定
操作程序：
（一）蛋白样制备
1.无双抗DMEM（10%血清）接皿，代细胞长至80%时，细胞转染，6h后换含双抗DMEM
（10%血清），再过22h后处理细胞。
2.吸出培养液，用PBS洗1-2次。
3.每个皿（60mm）加入200-300ul细胞裂解液，摇均匀，刮细胞。
(最好处理完一个样品
后再处理另外的样品，不要同时处理)
4。
用一次性1ml针筒吸出裂解的细胞液，注入1.5ml离心管中，用针筒吸打至清亮。
5。
取80ul 2×Sample Buffer混匀，37度30min，沸水10min，1200rpm 10min 取上清，冰浴，上样，剩余样品-20度储存。
（二）SDS-PAGE
1.制备分离胶5ml加入组装好的玻璃板中，立即水封。
（一般配10%分离胶）
2.待两液相出现折线，胶凝后将水倒出，加入制备的浓缩胶3ml插入梳子，待凝固。
3.胶凝后拔出梳子，将玻璃板转过来，加入电泳缓冲液。
4.用针筒吹净每个孔。
5.上样，通电电泳：浓缩胶电压90V（约30min）分离胶120V（约90min）。
（三）转膜（湿转）(100KD以上)，小的蛋白片段建议半干转膜。
1.海绵，滤纸在转膜液中浸泡，PVDF膜在甲醇中浸泡2min。
2.在玻璃板上铺海绵，五层滤纸，用玻璃棒赶走气泡，将电泳后的胶轻放在滤纸上，玻璃
棒赶走气泡，贴上PVDF膜，再铺上五层滤纸及海绵，玻璃棒赶走气泡。
将其整体转移到转膜夹上。
3.12V电压下转膜过夜，在其四周放上冰袋。
注意：方向应为：阴极-海绵-五层滤纸-胶-PVDF膜-五层滤纸-海绵-阳极
（四）封膜
1.配制封膜液，在20ml 1×TBST中加入1g脱脂奶粉（一块膜的用量），充分混匀倒入保
鲜盒中。
2.将膜用镊子夹出平铺在封闭液中，蛋白面朝下。
3.摇床上摇2h。
（五）一抗
把膜从封闭液中夹出剪去边缘，平铺入一抗溶液中，蛋白面朝下，摇床上摇4h。
（六）二抗
1.将一抗回收，放入-20度冰箱中。
2.在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。
3.倒掉冲洗液，加入二抗溶液（8ml），摇床2h。
（六）洗膜，显影，定影
1.将二抗回收，放入-20度冰箱中。
在保鲜盒内加入8ml 1×TBST摇床10min 3次。
2.将A、B液按1：1配制，在一试管中各加400ul的A液和B液。
注明：ECL A、B液最好选用Pierce公司的Super Signal West Pico，国产可选用碧云天的。
3.在工作台上铺好保鲜膜，在保鲜膜上滴一小滴ECL混合液，将洗好的膜放上，在膜上
滴ECL混合液，盖上保鲜膜，确定无气泡。
4.关灯，黑暗中拿出胶片，折起一角，放在膜上，压膜（压膜必须带手套，且不能有水，
否则会有非特异性黑斑，压膜时间越长，条带越浓）。
5.将压好的膜放入显影液中在红光下观察膜片上的条带。
6.用水冲洗，放入定影液中定影，用水冲洗，晾干。
结果判定
四、注意事项
1.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。
因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗
原量不至于太低，如果过低应该重新纯化和浓缩使用，或者建议做一次梯度稀释。
2.形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当，不仅可以决定凝胶聚合的速度,也
将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。
因此，建议要根据不同温度
下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合。
灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。
3.未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套口罩防护。
梳子插入浓缩胶时，应确
保没有气泡，可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生，梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔，如有加样孔上的凝胶歪斜可用针头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内。
4.加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。
5.为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
6.上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
7.样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月，但是反复冻融会使蛋白质降解。
8.为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应尽快转印。
9.取出凝胶后应注意分清上下，可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应
用同样的方法对PDVF膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。
10.转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,PDVF膜对应正极。