第五章病毒的遗传分析

第五章病毒的遗传分析（3h）教学目的：掌握噬菌体的突变类型以及λ噬菌体的基因组；明确噬菌体的噬菌体的重组；了解噬菌体的互补测验。

教学重点：噬菌体的重组。

教学难点：噬菌体的互补测验。

第一节噬菌体的繁殖和突变型一、噬菌体的繁殖二、噬菌体突变型第二节噬菌体突变型的互补测验一、φX174条件致死突变型的互补测验二、T4突变型的互补测验第三节噬菌体突变的重组实验一、T2突变型的两点测交二、T4突变型的三点测交第四节λ噬菌体基因组与λ原噬菌体一、λ噬菌体的基因组二、原噬菌体的插入与切除第五节环状排列与末端重复（自学）一、线状DNA具有环状遗传图二、环状排列与末端重复的形成第五章病毒的遗传分析（3h）第一节噬菌体的繁殖和突变型一、噬菌体的繁殖感染周期：是指噬菌体从吸附细菌到子代噬菌体从宿主细菌细胞中放出来的过程。

1、烈性噬菌体的感染周期：烈性噬菌体T4，其宿主是大肠杆菌，故称之为大肠杆菌T4－噬菌体。

T4－噬菌体对大肠杆菌的侵染过程，就是我们在前面讲过的噬菌体感染周期。

大肠杆菌T4－噬菌体：头、尾两部分组成，外为蛋白质外壳＋内部DNA分子。

侵染过程：侵染时T4噬菌体的尾部吸附在大肠杆菌的细胞壁上，放出溶菌酶将细胞壁溶成一小孔，借助于尾鞘的收缩，将自己的DNA（T4－DNA）通过小孔注入大肠杆菌细胞内，T4－噬菌体的基因e立即有顺序地进行表达。

T4－噬菌体DNA上约有160个基因，已定位的有70多个基因，装配成完整的噬菌体的全部信息也都在此DNA上。

T4－噬菌体的基因的表达：早前期基因表达—多为调节基因。

其作用是启动自身基因表达。

而抑制宿主大肠杆菌细胞的DNA合成。

晚前期基因表达—是与DNA复制有关的基因。

其产物是：核酸酶：降解大肠杆菌的DNA，为自己DNA 合成提供游离的核苷酸；DNA复制有关的酶：大量合成新T4－DNA。

晚期基因表达—是控制形态发生过程的基因；编码噬菌体结构蛋白的基因。

其产物是大部分直接参与外壳的建成和少数具有酶的作用。

包装完成后，由噬菌体裂解基因表达，产生裂解酶。

消化宿主细胞壁。

大肠杆菌细胞裂解，放出大量的子代T4－噬菌体。

2、温和噬菌体的感染周期－噬菌体：其宿主是大肠杆菌。

感染宿主。

原噬菌体：整合到宿主染色体中的噬菌体基因组，称为原－噬菌体。

溶源性细菌：带有原噬菌体的细菌叫溶源性细菌。

以上过程称为溶源周期。

λ－噬菌体基因的表达：先是早期基因和部分晚期基因的表达。

产物——阻遏蛋白。

作用——调节或抑制自身其它基因的表达。

噬菌体的整个基因组整合到宿主染色体的特定区域，λ噬菌体的大部分基因处于失活状态，随宿主染色体一起复制。

溶源性细菌具有2个重要特性：免疫性：由于大肠杆菌含原噬菌体而产生一种阻遏蛋白（I ）。

这种阻遏蛋白不但可抑制原噬菌体DNA复制。

也可抑制再度感染的同类噬菌体DNA的复制。

故能抵抗同类噬菌体的超感染。

可诱导性：原噬菌体的自发诱导，每一代可能有1/10000溶源性细菌被裂解，释放出大量λ噬菌体（裂解周期）。

裂解周期：用紫外线或化学物质（丝裂霉素C）诱导，90％溶源细菌进入裂解周期。

λ噬菌体的基因有顺序地表达，λ－phage的DNA独立复制，形成蛋白质外壳，从而组装成完整的噬菌体释放出来。

温和噬菌体：象这种在感染周期中具有裂解和溶源两种途经的噬菌体称为温和噬菌体。

二、噬菌体的突变型1.噬菌斑形态突变型——快速溶菌突变型野生型噬菌体：形成嗜菌斑小、边缘模糊、中心清晰。

这是因为野生型噬菌体裂解细菌细胞，速度缓慢，当噬菌斑中心的细胞裂解形成清亮的小洞后，它的边缘还有许多未裂解的细菌，故呈现出模糊的晕环。

快速溶菌突变型：形成的嗜菌斑大、边缘清晰、中心清晰。

这是由于突变体裂解细菌细胞的速度快，只要突变体在增殖细菌便一直在裂解，产生的噬菌体就在且边缘清晰。

2.寄主范围突变体在细菌和噬菌体生存竞争过程中，两者都在发生突变。

大肠杆菌抗噬菌体突变型：细胞壁上由于没有野生型噬菌体赖以附着的接受点而表现出抗性，但野生型噬菌体也能突变成寄主范围突变体。

寄主范围突变体：其吸附器和野生型的有某些精细的差别，所以又能吸附在抗—噬菌体细菌的细胞壁上，侵染并使它们裂解，经自然选择，细菌中又产生抗寄主范围突变体的抗性品系，而噬菌体同样会产生侵染这种新品系的突变体。

可谓“道高一尺，魔高一丈”。

自然界中，细菌和噬菌体靠这种突变的微妙平衡，而使对立双方不致于同归于尽而完全灭绝。

3.条件致死突变型噬菌体大部分基因的功能是复制和产生子代噬菌体所必需的，这些基因的突变是致死的，不能形成噬菌斑，有些致死突变型在限制条件下是致死的，而在许可条件，可形成噬菌斑，这种突变称为条件致死突变。

它在遗传学研究最具有重要意义，通过这种突变已鉴定出大部分噬菌体基因。

Benzer所用的T4的rⅡ突变就是遗传学研究中所用第一个条件致死突变型。

第二节噬菌体的互补测验一、φX174条件致死突变型的互补测验φX174条件致死突变型的互补测验含一环状单链DNA，称为（+）链。

φX174突变型有许多条件致死突变型：将突变型成对地进行互补测验以确定不同来源的两种条件致死突变型影响的是不同的遗传功能还是相同的遗传功能。

如两种突变能互补的，则属于不同的顺反子；不能互补的则属于同一顺反子。

由此推出φX174基因组中的顺反子数，根据互补测验结果，φX174的39种条件致死突变分属于8个顺反子互补测验的原理：遗传学研究的基础首先必须有突变型，然后就是分析这些突变型之间的关系。

互补测验是确定突变的功能关系。

如T4的rⅡ区中有3000多个突变型，它们有相同的表现型，这是由于所有的rⅡ突变都导致丧失合成一种或几种蛋白质的能力，这种蛋白质是大肠杆菌k（γ）发育所必须的。

，因此这些突变型对大肠杆菌k（γ）细胞是致死的，但可在大肠杆菌B菌株的细胞中增殖。

既然它们有相同的表现型，那么是否它们都影响同一种遗传功能呢？即rⅡ中这3000多个突变型是属于一个基因还是属于几个基因？为了划分这种功能单位界线，必须进行互补测验，就是用不同的rⅡ突变型成对组合去感染大肠杆菌k（γ）菌株。

如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌斑（也有少量重组型的噬菌斑），那么就必然是一个突变型补偿了一个突变型所不具有的功能，这两个突变型就称为彼此互补。

如果双重感染的细菌不产生子代噬菌体，则这两种突变型一定有一个相同功能受到损伤。

互补测验的方法：具体进行互补测验常用斑点测试法（spot test）。

用一种rⅡ突变型以0.1的感染比（噬菌体1/细菌10）去感染大肠杆菌k（γ）菌株。

噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在营养平板上，琼脂凝固后，在平板上所划出的一定位置上再加一滴含有另一种rⅡ突变型的培养基，在这一滴培养基的范围内，一些细菌就会被两种噬菌体所感染。

如在这范围内形成噬菌斑，就证明这两种突变型互补，反之就不能互补。

在一个培养皿平板上可做6~8个斑点试验。

互补测验的结果：互补测验的结果发现：除了一些缺失突变型外，rⅡ突变型可分成rⅡA和rⅡB 两个互补群。

所有rⅡA突变型的突变位点都rⅡ区的一头，是一个独立的功能单位；所有rⅡB突变型突变型的突变位点都在rⅡ区的另一头，也是一个独立的功能单位。

凡是属于rⅡA互补群的突变不能互补，同理属于rⅡB互补群的突变也不能互补，只有rⅡA的突变和rⅡB的突变可以互补，即双重感染大肠杆菌k（γ）菌株后可产生子代。

说明rⅡA和rⅡB是两个独立的功能单位，分别具有不同的功能，但它们又是互补的，要在大肠杆菌k（γ）中增殖，这两种功能缺一不可。

由此可见，rⅡ是因为这两种功能丧失而形成的。

二、T4突变型的互补测验是R.S.Edgar和R.H.Epstein于1960年首次从T4中分离出条件致死突变型。

第三节噬菌体突变的重组实验一、T2突变型的两点测交r＋型：生长缓慢，噬菌斑小，边缘模糊。

r－型：快速生长，噬菌斑大，边缘清晰。

h＋型：只能感染Ttos （对T2－phage敏感的野生型大肠杆菌），不能感染Ttor（对T2噬菌体具抗性的突变型大肠杆菌）。

h －型：能感染Ttos，也能感染TtorTtos简称品系1，Ttor简称品系2噬菌体的混合感染噬菌体的重组h-r+ × h+r-中出现的4种噬菌斑四种嗜菌斑重组率的计算T2的连锁图（只注明4个基因）1965年，用重组分析法鉴定出T4－phage的60个不同的基因，它们在环状遗传图上的排列。

二、T4突变型的三点测交突变型品系：小嗜菌斑（m）、快速溶菌（r）、浑浊溶菌斑（tu）野生型品系：野生型（+++）T4的mrtu +++三点测交结果三个基因的染色体图第四节λ噬菌体基因组与λ原噬菌体一、λ噬菌体的基因组基因：一是形成嗜菌斑所必须的基因（用大写字母表示）；另一类是嗜菌斑形成非必须基因（用小写字母/希腊字母表示）。

基因组：含49 000bp，线状DNA。

基因组特点：许多功能相关的基因聚集在一起。

结构基因及其编码蛋白质所作用的部位也处在邻接的区域（如int和xis位于att旁边）。

从中分离出的DNA是双链线状的，具有由12个核苷酸组成的互补的单链粘性末端。

侵入宿主后，“粘性末端”退火形成的环状分子上的单链“缺口”，在细胞DNA连接酶作用下形成共价键而被封闭。

二、原噬菌体的插入与切除λ噬菌体是插入大肠杆菌DNA的gal和bio基因之间。

λ噬菌体又是如何插入？用图片来说明。