微生物限度检查法
微生物限度检验
微生物限度检验1概述：微生物限度检查方法包括直接接种法和薄膜过滤法。
饮用水，纯化水，注射用水、及其他完全溶解并能通过滤膜的样品，采用薄膜过滤法进行检查；精制卡介菌多糖核酸等其他不完全溶解或无法通过滤膜的样品，采用直接接种法进行检查。
2设备、仪器及用具2.1 设备净化工作台、生物安全柜、恒温培养箱(30～35℃)、霉菌培养箱(23～28℃)，恒温水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱(180℃～300℃)、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、365nm紫外灯、显微镜、集菌仪、薄膜过滤装置等。
2.2 用具2.2.1 玻璃器皿用前应洗涤干净,无残留抗菌物质。
于180℃干热灭菌2小时以上或250℃干热灭菌30分钟以上（仅适用于玻璃器皿或不锈钢用具），或高压蒸汽121℃湿热灭菌30min,50～60℃烘干备用。
2.2.3 无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套,用牛皮纸包严）、移液管、试管、接种环、孔径0.45UM且直径50的微孔滤膜灭菌,备用。
也可用一次性无菌口罩、手套。
2.2.3 酒精灯、乙醇棉球、打火机、实验记录纸等。
2.2.4经灭菌处理的用具存放时间不超过48小时，否则需重新灭菌后方可使用。
3稀释液 PH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液。
4培养基及试液4.1 细菌检查用酪蛋白大豆营养琼脂培养基。
4.2 霉菌、酵母菌检查用沙氏培养基、（玫魂红钠琼脂培养基）、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）。
4.3 大肠埃希菌检查用胆盐乳糖(BL)培养基、MUG培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基、靛基质试液、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、枸橼酸盐培养基。
4.4 大肠菌群检查用乳糖胆盐发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基。
4.5稀释液 0.9%氯化钠溶液或PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液4.6 培养基制备应注意:4.6.1 配制的培养基应测定PH值，确保灭菌后培养基的PH值符合相关培养基的要求。
微生物限度检查法标准操作规程3篇
微生物限度检查法标准操作规程第一篇：微生物限度检查法标准操作规程概述1.引言微生物限度检查法（Microbial Limit Test, MLT）是药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品产品质量控制检验的重要手段之一。
它的意义在于保证制品中微生物污染的可控性，保障产品的安全有效性。
本篇文章将围绕微生物限度检查法的标准操作规程，对其概述进行介绍。
2.主要内容2.1 微生物限度检查法的定义微生物限度检查法（Microbial Limit Test, MLT）是指对药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品产品中细菌和真菌等微生物数量进行检查的方法和标准。
它是评价产品质量与卫生安全性的重要方法。
2.2 微生物限度检查法的目的微生物限度检查法的目的在于评价药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品产品中的微生物数量是否在规定的限度范围内，以保证产品的安全性和有效性。
同时，微生物限度检查法也可为制品的生产、质量控制和质量管理提供有效依据。
2.3 微生物限度检查法的适用范围微生物限度检查法适用于药品、医疗器械、食品和化妆品等生物制品的质量控制检验。
其中，针对药品类，在我国《药典》中有详细规定。
3. 微生物限度检查法的标准操作规程3.1 样品处理样品处理过程应密闭、无菌且保持无菌状态。
洗手、穿戴无菌工作服及手套等工艺应符合规定，以避免二次污染。
3.2 检验方法微生物限度检查法主要分为计数法和筛选法，具体方法可根据制品的特性进行选择使用，并符合规定的国家标准。
对于细菌，常用的检验方法包括菌落计数法、薄膜过滤法等；对于真菌，常用的检验方法包括直接涂片法、薄膜过滤法等。
3.3 限度对于不同的制品，在药品中通常采用菌落计数法，在制品中微生物的限度规定一般标准分别为：细菌总数不超过10^3CFU/g或/mL，霉菌和酵母菌总数不超过10^2CFU/g或/mL。
3.4 结果判定若检测出的微生物数目符合规定限度，则判定结论为合格；若其中一个指标不符合规定，则判定为不合格。
微 生 物 限 度 检 查 法
微生物限度检验方法的发展情况
1．1980年我国药品微生物限度检验工作正式发行《药品卫生检 验方法》。 2．1984年出版第二版《药品卫生检验方法》。 3．1990.12年中检所出版第三版，主要对原《方法》中各地反 映意见较多的问题进行了改写；增加了部分检验方法和供试液 的制备方法；为了同国内外检验方法相协调，对某些内容作了 相应的更改，此外，还参照国家标准的编写格式作了编排。
恒温培养箱 霉菌培养箱 恒温水浴箱 净化工作台 30～35℃ 25～28℃ 45±1℃ 生物显微镜 1500X 36±1℃
体视显微镜或放大镜
电热干燥箱 250～300℃
电冰箱
高压蒸汽消毒器 电子天平或药物天平 匀浆仪或研钵 锥形瓶 100ml，250ml，500ml，1000ml 感量0.1g
直形吸管 量杯 试管
康氏振荡器 紫外灯 365nm
（带盖）
大、小橡皮乳头
乙醇棉球或碘伏棉球 灭菌剪刀、镊子、钢锥 灭菌称样纸 灭菌不锈钢药匙
火柴、记号笔（玻璃铅笔）
白瓷盘、洗手盆 实验记录纸
细菌、霉菌与酵母菌的检查方法
（平皿菌落计数法）
（一）供试品的抽样、保存及检验量 1． 供试品应随机抽样。一般抽样量（2个以上最小包装单位） 为检验量的3倍量。 2．对异常的供试品应针对性的抽样。抽样时，凡发现有异常或 可疑的样品， 应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的 包装不得作为样品。 凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）、外观看出长螨、发 霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需在抽样检验。 不能以外观有上述情况而检查内容物合格，来判断该药品合格。 3．供试品收检后应及时检验，若有困难，应存放在该品种规定 的储存条件下（一般为阴凉干燥处），勿冷藏或冷冻，以防供试 品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。
微生物限度检查法名词解释
微生物限度检查法名词解释
微生物限度检查法是一种用于检测和分析微生物在一定条件下的生长、繁殖和分布的检查方法。
该方法通常用于检测和分析生物制品、药品、食品、水源和其他领域中存在的微生物污染情况。
微生物限度检查法的主要目的是确保生产和处理过程中没有引入过多的微生物，从而避免在产品、溶液或环境中形成微生物种群，导致产品质量下降、产品变质、环境污染等问题。
微生物限度检查法也是药品生产和质量管理中的重要组成部分，以确保药品的质量和安全性。
在微生物限度检查法中，通常需要对样品进行预处理，然后在一定条件下培养，计数并评估微生物的生长情况。
根据计数的结果，可以确定样品中微生物的数量是否超过了规定的限度，从而判断样品是否被污染。
微生物限度检查法可以广泛应用于许多领域，例如医疗卫生、食品工业、化妆品工业、水处理等。
微生物限度检查法是一个重要的质量管理工具，它可以帮助生产和管理人员及时发现和解决问题，确保产品质量和安全。
微生物限度检查法
微生物限度检查法1 X围本标准适用于非规定灭菌制剂及其原料、辅料检查项目包括细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌检查及活螨的检查。
2 依据标准《中华人民XX国药典》《药品微生物学检验手册》YBB00132002药品包装用复合膜、袋通则3 人员资质及培训3.1 从事药品微生物检验工作的负责人应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。
3.2 检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认可以承担某一试验前，不能独立从事该项微生物试验。
应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别实验人员的继续教育计划。
3.3 检验人员必须熟悉相关检验方法、程序、检测目的和结果评价。
3.4 实验室应通过参加内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法客观评价检验人员的能力，必要时对其进行再培训并重新评估。
当使用一种非经常使用的方法或技术时，有必要在检测前确认微生物检测人员的操作技能。
4 培养基4.1 培养基的制备培养基可按处方配制。
也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。
在制备培养基时，应选择质量符合要求的脱水培养基或单独配方组分进行配制。
脱水培养基应附有处方和使用说明，配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求，不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。
脱水培养基或单独配方组分应在适当的条件下贮藏，如低温、干燥和避光，所有的容器应密闭，尤其是盛放脱水培养基的容器。
商品化的成品培养基除了应附有处方和使用说明外，还应注明有效期、贮藏条件、适用性检查试验的质控菌和用途。
为保证培养基质量的稳定可靠，各脱水培养基或各配方组分应准确称量，并要求有一定的精确度。
配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下，可能需要去离子水和蒸馏水。
应记录各称量物的重量和水的使用量。
配制培养基所用容器和配套器具应洁净，可用纯化水冲洗玻璃器皿以消除清洁剂和外来物质的残留。
微生物限度检查法
转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液
约2ml，加稀释剂至原规定量。 离心量、控制转速和时间 用途
中和法
凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜
的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加
在所用的稀释剂或培养基中。 适用性（浓度）和无毒性确认。 用途：
中和剂 硫酸氢盐 稀释剂 稀释剂、甘氨酸、硫代硫酸盐 卵磷脂、吐温
培养基及稀释剂的灭菌
培养基及稀释剂配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。 培养基稀释剂配制后应尽快灭菌，避免微生物的繁殖。 一般采用湿热灭菌法，灭菌程序均应验证后方可采用。以防止采 用不适当的加热和灭菌条件导致灭菌不彻底或培养基颜色及PH 的变化、透明度及琼脂凝固力的降低等变化，导致培养基及稀释 剂不符合质量要求。
若出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等 异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。
平皿法菌数报告规则-3
当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的
平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的 平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以 “＜1× 乘以最低稀释倍数” 的值个报告菌数。
平皿法菌数报告规则-1
宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌
平均菌落数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告
（取两位有效数字）的依据。
当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平
均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
平皿法菌数报告规则-2
当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值而定。 若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数。 若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告 菌数。
微生物限度检查法
中华人民共和国药典2000版二部微生物限度检查法附录Ⅺ J 微生物限度检查法微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法,包括染菌量及控制菌的检查。
供试品应随机抽样。
一般抽样量为检验用量(2个以上最小包装单位)的3倍量。
检查的全过程,均应严格遵守无菌操作,严防再污染。
除另有规定外,本检查法中细菌培养温度为30~35℃,霉菌、酵母菌培养温度为25 ~28℃,控制菌培养温度为36℃±1℃。
检验结果的报告以1g、1ml或10cm<2>为单位。
培养基及其制备方法除另有规定外,培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。
1.营养琼脂培养基与营养肉汤培养基见无菌检查法(附录Ⅺ H)2.玫瑰红钠琼脂培养基胨 5g 玫瑰红钠 0.0133g葡萄糖 10g 琼脂 15~20g磷酸二氢钾 1g 水 1000ml硫酸镁 0.5g除葡萄糖、玫瑰红钠外,取上述成分,混合,加热溶化后,滤过,加入葡萄糖、玫瑰红钠,分装,灭菌。
3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)胨 10g 琼脂 15~20g酵母浸出粉 5g 水 1000ml葡萄糖 20g除葡萄糖外,取上述成分,混合,加热溶化后,滤过,加入葡萄糖,分装,灭菌。
4.胆盐乳糖培养基(BL)胨 20g 磷酸二氢钾 1.3g乳糖 5g 牛胆盐 1.3g氯化钠 5g (或去氧胆酸钠0.5g)磷酸氢二钾 4.0g 水 1000ml除乳糖、牛胆盐外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2, 煮沸,滤清,加入乳糖、牛胆盐,分装,灭菌。
5.曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)营养琼脂培养基 100ml 曙红钠指示液 2ml20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液 1.3~1.6ml 取营养琼脂培养基,加热溶化后,冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液, 摇匀,倾注平皿。
6.麦康凯琼脂培养基(MacC)胨 20g 1%中性红指示液 3ml乳糖 10g 琼脂 15~20g牛胆盐 5g 水 1000ml氯化钠 5g除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外,取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.2±0.2,加入琼脂,加热溶化后,再加入其余各成分,摇匀,分装,灭菌,冷至60℃,倾注平皿。
微生物限度检查法
•
时间 12药1 12药2 14周周一1-2节 上课 14周周二3-4节，上课 上课，小组 5-6节 讨论 14周周三1-2节 上课，小组 讨论 14周周五1-2节，实训（染色、 实训（染色、 5-6节 镜检） 镜检）
时间 12药1 15周周一1-2节， 周二5-6节
12药2 第一组综合 实训 第二组复习
稀释度
用1ml无菌吸管精确吸取1ml样品悬液放 入10-1的试管中，换另一支吸管将管内 悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹 时离开水面，使其混合均匀，然后自 10-1试管吸1ml放入10-2试管中，换另一 支吸管吸吹三次，……其余依次类推。 （可参考P163-P165）
2、
每个稀释度用2-3个平皿， 每个平皿加入1ml稀释液 加入15ml已熔 化的琼脂培养基
微生物限度检查法（P184）
微生物限度检查的概念
微生物限度检查法系检查非规定灭 菌制剂及其原料、辅料受微生物污染 程度的方法。 “允许含有一定量的菌”
微生物限度检查的意义 (l) 保证药品质量
(2) 反映药品生产工艺的科学性、 合理性及质量管理水平
微生物限度检查的项目 染菌数量的限制 染菌种类的限制 1. 染菌量检查 包括细菌数、霉菌数 及酵母菌数计数，以检查这几类微生物 对药品的污染程度。
摇匀、待冷凝倒置培养 30－35℃ 48h
点数平板上菌落，得出平均菌落
注意同时要做空白对照！
• 菌数测定空白对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置2-3 个无菌平皿中，分别注入细菌、霉菌 计数用的琼脂培养基制备成平板，经 培养、检查，不得长菌。
3、菌数报告方式 稀释度的选择（P163） 报告的方式：cfu/ml或cfu/g
12药1
12药2 操作练习
中国药典微生物限度检查法
中国药典微生物限度检查法
中国药典是中华人民共和国国家药品监督管理局编制的用于药品质量标准和规范的权威性文献。
其中，微生物限度检查是对药物产品中的微生物污染进行评估和控制的重要环节。
中国药典中的微生物限度检查法主要包括以下几个方面：
1.检测项目：微生物限度检查主要关注细菌、真菌和酵母菌
的存在与数量。
通常会检测大肠杆菌、铜绿假单胞菌、霉
菌和酵母菌等常见微生物。
2.样品准备：样品准备过程中，要根据具体要求制备适当稀
释的样品溶液。
根据不同产品的特点和要求，可能需要使
用适当的培养基进行预处理。
3.检测方法：中国药典中提供了一系列的微生物限度检测方
法，包括涂片法、水洗法、滤膜法等。
这些方法可以根据
不同的样品类型和特性选择适合的检测方法。
4.培养和观察：按照检测方法的要求，将样品接种在适当的
培养基上，进行培养并观察一定时间。
观察期间，需要注
意各种细菌、真菌和酵母菌的生长情况。
5.计数和判定：根据培养结果，进行微生物数量的计数，并
与规定的限度标准进行比较。
根据比较结果，判定样品是
否符合微生物限度标准。
通过微生物限度检查，可以评估药物产品中的微生物污染状况，并确保其在接受者使用时的安全性。
中国药典中的微生物限度
检查法为药品质量控制提供了重要的指导和标准。
药典微生物限度检查法
微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方式。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及操纵菌检查。
微生物限度检查应在环境干净度10000 级下的局部干净度100 级的单向流空气区域内进行。
查验全进程必需严格遵守无菌操作，避免再污染，避免污染的方法不得阻碍供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应按期按《医药工业干净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方式》的现行国家标准进行干净度验证。
供试品检查时．若是利用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除还有规定外，本检查法中细菌及操纵菌培育温度为30～35 ℃ ；霉菌、酵母菌培育温度为23～28 ℃ 。
查验结果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm2为单位报告，特殊品种能够最小包装单位报告。
查验量查验量即一次实验所用的供试品量（g 、ml 或cm2）。
除还有规定外，一样供试品的查验量为10g 或10ml；膜剂为100 cm2；珍贵药品、微量包装药品的查验量能够酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其查验量应增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于阳性对如实验）。
查验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4 片。
一样应随机抽取很多于查验用星（两个以上最小包装单位）的3 倍量供试品。
供试液的制备依照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方式制备供试液。
供试液制备假设需加温时，应均匀加热，且温度不该超过45℃ 。
供试液从制备至加入查验用培育基，不得超过1 小时。
除还有规定外，经常使用的供试液制备方式如下。
1.液体供试品取供试品10ml ，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，混匀，作为l:10 的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g ，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至1OOml ，用匀浆仪或其他适宜的方式，混匀，作为1:10 的供试液。
微生物限度检查法
目的：规范药品微生物限度标准。
适用范围：药品微生物限度的检查。
责任者：操作员、化验员。
中成药、化学药品、生化药品的非灭菌制剂及药用原料、辅料，除另有规定外，皆按本法进行检验，并按中华人民共和国药典2000年版附录XIJ《微生物限度检查法》的规定判定检验结果。
检验方法总则1、抽样1.1 供试品采用随机抽样方法，按批号抽样。
1.2 抽样量一般应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
1.3 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应抽选有疑问的样品，但因机械损伤明显破裂的包装不得作为样品。
1.4 凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀以及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。
2、供试品保存2.1 供试品在检验前，应保存在阴凉干燥处（勿冷藏或冷冻），以防供试品中的污染菌因保藏条件引起致死、损伤或繁殖。
2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。
包装已开启的样品不得作为供试品。
3、检验3.1 供试品检验项目按中国药典2000年版二部附录XIJ 《微生物限度检查法》确定。
3.2 检验的全过程必须符合无菌操作要求，严防再污染。
3.3 除另有规定外，供试品制备成供试液后，应在均匀状态取样。
3.4 供试品制成供试液后，应在1小时内注皿操作完毕。
4、检验量4.1 所有剂型的检验均需取自2个以上包装单位。
4.2 化学药品、生化药品的胶囊剂、片剂、颗粒剂等检验量为10g。
5、供试液的制备5.1 一般固体供试品称取10g，置研钵中，以100ml稀释剂（0.1mol/L磷酸盐缓冲液或生理盐水），分次加入研磨均匀，并转移至 250ml锥形瓶中，使成1:10供试液。
或者将供试品和稀释剂同置匀浆仪中，以转速3000~5000转／分，开机1~2分钟。
对吸水膨胀或粘度大的供试品，可制成1:20供试液。
5.2 胶囊剂供试液制备方法称取供试品10g置锥形瓶中，加入稀释剂100ml，于45℃水浴中振摇至溶，即为1:10供试液。
微生物限度检查法
微生物限度检查操作法一．检查项目：细菌数 霉菌数 大肠杆菌数 二．实验前的准备MUG （4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基）的配制 9‰氯化钠的配制 鲜肉汤的配制BL （胆盐乳糖）溶液的配制 虎红琼脂的配制 营养琼脂的配制 靛基质的配制三．操作方法 1．细菌数 霉菌数取样品适量，用开孔面积为20㎝2的消毒过金属模板压在样品的内层面上，将无菌棉签用9‰氯化钠沾湿。
在板孔的范围内檫抹5次，换1支棉签再檫抹5次。
每个位置用2支棉签共檫抹10次，共檫抹5个位置100㎝2。
每支棉签抹完后立即剪断，投入盛有30ml 氯化钠注射液的锥形瓶中，迅速摇晃一分钟，即得供试品。
1:10稀释级制备：用移液管取上述供试品液1ml ，注入含有9ml 氯化钠溶液的试管中，摇晃均匀。
1:100稀释级制备：用移液管取上述1:10稀释级1ml ，注入含有9ml 氯化钠溶液的试管中，摇晃均匀。
1:1000稀释级制备：用移液管取上述1:100稀释级1ml ，注入含有9ml 氯化钠溶液的试管中，摇晃均匀。
细菌培养：从上述3支不同稀释级的试管内分别取1ml 放入培养皿中，浇上配制好的营养琼脂摇晃均匀。
放置于温度36℃左右的生化培养箱内培养48小时。
霉菌培养：从上述3支不同稀释级的试管内分别取1ml 放入培养皿中，浇上配制好的虎红琼脂摇晃均匀。
放置于温度25℃左右的生化培养箱内培养72小时。
2．大肠杆菌数(1)在无菌室内菌种的接种用接种棒在酒精灯前转移一点到有5ml 配制好的鲜肉汤的试管中，使之研磨溶液，并振荡均匀。
将此接种好的鲜肉汤在36℃生化培养箱中放置24小时。
接种棒在使用前要在酒精前烧红，转移时呈S 形转移菌种。
用移液管取1ml 上述鲜肉汤菌种，注入有9ml 氯化钠溶液的试管中摇晃均匀。
得到10-1级，然后取此稀释级1ml ，注入有9ml 氯化钠溶液的试管中摇晃均匀，得到10-2级，依次进行上述操作，分别得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7级。
微生物限度检查法
非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及原、辅料等符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适应于活菌制剂的检查。
微生物计数实验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止在污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试品制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法。
MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是最适合的方法。
供试品检查时应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
计数培养基适用性检査和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
微生物限度检查方法
微生物限度检查方法
微生物限度检查方法是检验食品或药品中微生物水平的一种方法。
根据国家卫生部《食品微生物学检验规程》的标准要求，目前常用的微生物限度检查方法包括以下几种：
1.总菌落数测定法：通过菌落计数法，检测某一样品能够培养出的所有微生物数量。
2.大肠菌群检测法：通过检测样品中大肠菌群的数量，来判断食品卫生安全问题。
3.霉菌和酵母菌检测法：通过培养样品中的霉菌和酵母菌，来检测食品是否存在霉变。
4.致病菌检测法：通过检测样品中致病菌的存在与数量，来判断食品是否受到污染。
5.细菌耐热菌数量检测法：通过检测样品中细菌耐热菌的数量，来判断食品加热杀菌处理的有效性。
综上所述，微生物限度检查方法是对食品或药品中微生物水平的一种常规检测方法，其结果对保障公共卫生安全具有重要作用。
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微生物限度检查法细菌及控制菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃。
检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g 或10ml用于阳性对照试验)。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
常用的供试液制备方法如下。
1．液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2．固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。
必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
阴性（-）对照试验取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。
阳性（+）对照试验阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌（检测的控制菌）的加菌量为10～100cfu（加对应控制菌制成的溶液1ml）。
阳性对照试验应检出相应的控制菌。
培养和计数除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。
在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。
然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。
（30-300cfu）薄膜过滤法取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。
若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级（10-1）的供试液1ml进行试验。
用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液（蛋白胨缓冲液）冲洗滤膜。
冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。
每种培养基至少制备一张滤膜。
细菌、霉菌及酵母菌检验：需8个培养皿，共两个稀释级别：10-1的培养皿，细菌、霉菌各两个，共四个。
10-2的培养皿，细菌、霉菌各两个，共四个。
10-1级：各取供试品液1ml，分别加入4个培养皿中。
细菌培养皿加入营养琼脂培养基，并加入TTC（加入比例，100ml营养琼脂培养基加入0.1ml TTC）指示剂，使细菌显红色，然后放入培养箱培养3天。
霉菌及酵母菌培养皿加入玫瑰红钠琼脂培养基，然后放入培养箱培养5天。
最后计数，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2,供试品中所含的菌数。
10-2级：取供试品液1ml，加9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液混合为10ml溶液，从上述10ml混合液中各取1ml，分别加入4个培养皿中。
细菌培养皿加入营养琼脂培养基，并加入TTC（加入比例，100ml营养琼脂培养基加入0.1ml TTC）指示剂，使细菌显红色，然后放入培养箱培养3天。
霉菌及酵母菌培养皿加入玫瑰红钠琼脂培养基，然后放入培养箱培养5天。
最后计数，以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2,供试品中所含的菌数。
控制菌检查控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
菌种对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。
大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44 102〕金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC (B) 50 094〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruglnosa)〔CMCC(B) 10 104〕生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕（第四代接种菌里未涉及）白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕接种：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上。
培养24～48小时。
接种白色念珠菌（真菌）的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48小时。
接种黑曲霉（真菌）的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5～7天，加入3～5ml含0.05％(ml／ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％(ml／ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
计数：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个乎皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数；取白色念珠菌50～100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液，其配置方法一般：大肠埃希菌：取0.1ml大肠埃希菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-3级溶液；取0.1ml10-3级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-6级溶液；取6ml10-6级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-7级溶液，即得最终需要的溶液。
金黄色葡萄球菌：取0.1ml金黄色葡萄球菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-3级溶液；取0.1ml10-3级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-6级溶液；取8ml10-6级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-7级溶液，即得最终需要的溶液。
乙型副伤寒沙门菌：取0.1ml乙型副伤寒沙门菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-3级溶液；取0.1ml10-3级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-6级溶液；取5ml10-6级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-7级溶液，即得最终需要的溶液。
铜绿假单胞菌：取0.1ml铜绿假单胞菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-3级溶液；取0.1ml10-3级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-6级溶液；取4ml10-6级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-7级溶液，即得最终需要的溶液。
白色念珠菌：取0.1ml白色念珠菌接种培养液，放入100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-3级溶液；取1ml10-3级溶液于100ml0.9％无菌氯化钠溶液中，形成10-5级溶液，即得最终需要的溶液。
大肠菌群的检验：取含适量(不少于10ml)的乳糖胆盐发酵培养基试管3支。
分别加入1：10（10g或10ml供试品溶于100ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）的供试液1ml(含供试品0.18或0.1ml)、1：100（1ml上述1：10的溶液加9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)、1：1000（1ml上述1：10的溶液加9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）的供试液0.1ml(含供试品0.001g或0.001ml)，另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液（pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）1ml作为阴性对照管。
培养18～24小时。
结论：若产酸产气，判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。
大肠埃希菌的检验：取（用10g或10ml供试品与pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成的100ml溶液）供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)，直接或处理后接种（加入）至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基锥形瓶中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。
取上述培养物0.2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。
若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。
观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液（2-3滴），液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。
本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
若平板上无菌落生长或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。
若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。
表3 大肠埃希菌菌落形态特征乙型副伤寒沙门菌的检验：直接取供试品10g或10ml，直接或处理后接种（加入）至适量(不少于200m1)的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18～24小时。