双荧光报告系统
dual-luciferase
双荧光素酶报告系统作者：windyrain 2008-05-29 21:54:33标签：杂谈双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。
系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。
介绍有内参照双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。
使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。
但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势, 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7一、本文概述本文旨在利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和双荧光素酶报告基因技术（Dual-Luciferase Reporter Assay）来验证过氧化物酶体增殖物激活受体2（PPAR2）是否直接靶向调控肌球蛋白重链7（MYH7）基因。
PPAR2作为一种核受体，在多种生物学过程中发挥着关键作用，包括脂肪代谢、炎症反应和细胞分化等。
MYH7，作为肌球蛋白家族的一员，主要参与肌肉收缩和细胞骨架组成，其表达调控对于肌肉发育和功能至关重要。
因此，探究PPAR2是否通过直接结合MYH7基因启动子区域来调控其表达，对于理解PPAR2在肌肉生物学中的作用具有重要意义。
本文首先利用ChIP-seq技术，通过高通量的方法寻找PPAR2在体内结合的DNA序列，从而确定MYH7基因是否为其潜在的靶向基因。
在此基础上，通过构建包含MYH7基因启动子区域的双荧光素酶报告基因质粒，利用荧光素酶活性的变化来反映PPAR2对MYH7启动子的转录激活作用。
这种方法结合了染色质免疫沉淀的高特异性和荧光素酶报告基因技术的高灵敏度，为验证PPAR2对MYH7的靶向调控提供了强有力的实验手段。
通过本文的研究，我们期望能够明确PPAR2是否直接调控MYH7基因的表达，揭示这一调控过程的具体分子机制，并为进一步理解PPAR2在肌肉生物学中的功能提供新的线索。
二、材料与方法1 细胞系：使用人源细胞系，例如HEK293T细胞，用于后续的ChIP-seq和双荧光素酶报告基因实验。
2 ChIP-seq试剂：染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒、蛋白酶抑制剂、DNA纯化试剂盒、DNA片段化酶、测序引物等。
3 双荧光素酶报告基因系统：包含PPAR2反应元件（PPRE）的荧光素酶报告质粒，以及用于转染细胞的荧光素酶底物。
4 PPAR2特异性抗体：用于ChIP实验的PPAR2转录因子特异性抗体。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明一、测定原理：双荧光素酶报告基因检测试剂盒的原理基于双荧光素酶系统。
该系统由两个互补性的荧光素酶组成：荧光素酶1（Fluc）和荧光素酶2（Rluc）。
荧光素酶1通过氧化反应使荧光素发出蓝色荧光，而荧光素酶2通过氧化反应使荧光素发出绿色荧光。
同时，两个荧光素酶都能够自催化反应，从而有效降低假阳性结果的发生。
二、实验步骤：1.取适量细胞或组织，使用含有测试物的培养基或缓冲液进行处理。
2.将细胞或组织溶解，并离心收集上清液。
3.加入测试试剂盒提供的荧光素底物混合液，共孵育一段时间。
4.使用荧光分析仪测量反应混合物中蓝色和绿色荧光的强度。
5.根据荧光信号的强度计算得出相应的基因表达水平。
三、注意事项：1.本试剂盒需要严格按照说明书操作，避免操作失误导致结果错误。
2.在每一步操作前，请先将试剂保持在合适的温度下，以确保试剂的活性。
3.细胞或组织样本的采集、溶解和上清液的收集需要严格按照操作规范进行，避免样本的损失和污染。
4.在孵育过程中，避免剧烈振荡或震动，以免影响荧光素酶反应的进行。
5.在测量荧光强度时，确保荧光分析仪的参数设置正确，并注意避光操作，以免干扰荧光信号的测量。
四、结果解读：根据测量得到的蓝色和绿色荧光强度，可以计算得到相应的基因表达水平。
一般来说，荧光素酶1的荧光强度与被检测基因的表达水平成正比，而荧光素酶2的荧光强度则用作内参对照。
通过计算荧光素酶1与荧光素酶2的比值，可以更准确地反映被检测基因的表达水平。
结果解读时需要注意的是，双荧光素酶报告基因检测试剂盒只能提供相对量化的结果，无法给出绝对的基因表达水平。
因此，在结果解读时需要结合其他实验数据和相关文献进行综合分析。
总结：双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种常用的基因表达水平检测工具，该试剂盒通过双荧光素酶系统实现对基因表达水平的测定。
在使用时需严格按照说明书操作，注意操作规范和注意事项。
结果解读时应综合考虑其他实验数据和相关文献，以得到准确可靠的结论。
Dual-Luciferase 双荧光素酶报告基因检测系统
Dual-Luciferase®双荧光素酶报告基因检测系统产品包装目录号价格Dual-Luciferase® Reporter Assay System 100 次检测E19101000次检测E1960Dual-Luciferase® Reporter Assay System10-pack1000次检测E1980Dual-Luciferase® Reporter 1,000 AssaySystemPassive Lysis 5× Buffer 30ml E1941描述：普洛麦格公司的双荧光素酶报告基因(DLR™)检测系统为双报告基因检测提供有效手段。
在DLR™ 检测中，萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶和海肾(Renilla reniformis)荧光素酶可在单个样品中连续测量。
测量过程是：加入荧光素酶检测试剂II (LARII)产生萤火虫荧光信号，信号持续至少1 分钟，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。
定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop & Glo®试剂，将上述反应猝灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量。
如果使用带有试剂自动注射器的荧光发光计，两个检测可在4秒内完成。
在DLR™检测系统中，两个报告基因产生的线性检测范围均在小于10-18摩尔的灵敏度范围内，两个报告基因在实验宿主细胞内均无内源活性。
另外，此系统中一体化形式的双荧光素酶检测既可快速定量检测转染细胞，也可用于快速定量检测无细胞转录/翻译反应体系中的两个报告基因。
普洛麦格公司的合成海肾基因phRL系列：普洛麦格公司曾为双荧光素酶报告基因（DLR™）检测系统设计了萤火虫荧光素酶报告基因载体和野生型海肾报告基因载体pRL系列。
phRL和pRL系列载体均提供海肾荧光素酶的组成性表达，可与任何实验用萤火虫荧光素酶载体组合，共同转染哺乳动物细胞。
双荧光素酶报告数据分析(3篇)
第1篇摘要：双荧光素酶报告系统（Dual Luciferase Reporter Assays, DLRA）是一种广泛应用于生物科学研究中的细胞功能检测技术。
通过分析荧光素酶的活性，可以评估细胞内信号通路的激活情况，从而研究基因表达调控、细胞增殖、细胞凋亡等多种生物学过程。
本文将对双荧光素酶报告数据分析的方法、注意事项以及结果解读进行详细阐述。
一、引言双荧光素酶报告系统是一种基于荧光素酶活性的细胞功能检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
荧光素酶是一种在细胞内自然存在的酶，能够将荧光素底物催化生成荧光物质。
在双荧光素酶报告系统中，通常使用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FL）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, RL）。
FL的荧光强度通常作为报告基因的活性，而RL的荧光强度则作为内参基因，用于校正实验误差和细胞活力。
二、实验原理双荧光素酶报告系统的基本原理是：将目的基因与荧光素酶基因（FL或RL）的启动子连接，构建报告基因质粒。
将报告基因质粒转染到细胞中，细胞内荧光素酶的活性与目的基因的表达水平成正比。
通过检测细胞内两种荧光素酶的荧光强度，可以评估目的基因的表达水平。
三、实验方法1. 构建报告基因质粒（1）设计荧光素酶基因（FL或RL）的启动子序列，并与目的基因序列连接。
（2）将连接好的基因序列克隆到载体质粒中，构建报告基因质粒。
2. 细胞培养与转染（1）培养细胞至对数生长期。
（2）用脂质体或电穿孔等方法将报告基因质粒转染到细胞中。
3. 荧光素酶活性检测（1）收集转染后的细胞，用荧光素酶底物进行孵育。
（2）使用荧光光度计检测细胞内FL和RL的荧光强度。
4. 数据分析（1）计算FL和RL的相对荧光强度（RFU）。
（2）计算目的基因的表达水平（FL/Rlu）。
四、数据分析方法1. 相对荧光强度（RFU）计算RFU = 荧光强度 / 标准曲线斜率2. 目的基因表达水平计算目的基因表达水平 = FL/Rlu其中，FL为FL的相对荧光强度，Rlu为RL的相对荧光强度。
双萤光素酶报告基因的应用，常见载体及案例简介
双萤光素酶报告基因的应⽤，常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase ReporterAssay）通常以萤⽕⾍萤光素酶(Firefly luciferase)为报告基因，以海肾萤光素酶(Renillaluciferase)为内参基因。
所构成的报告系统具有灵敏度⾼、动态范围⼴、应⽤灵活等优势，⼴泛⽤于基因调控、⾮编码RNA靶向互作等研究领域。
Fireflyluciferase（简称F-Luc）以萤光素(luciferin)为底物，在Mg2+、ATP和氧分⼦存在条件下，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在此过程中发出最强波长在560nm左右的⽣物萤光(bioluminescence)。
F-Luc表达框的上游启动⼦区域插不同功能序列，可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。
在F-Luc的3’UTR区域插⼊待验证的靶序列，通过其翻译抑制或mRNA稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。
Renillaluciferase（简称R-Luc）以腔肠素（coelenterazine）为底物，在氧分⼦存在的条件下催化coelenterazine氧化⽣成coelenteramide，此过程中发出最强波长在465nm左右的⽣物萤光。
R-Luc通常由固定组成型启动⼦驱动，在报告系统中作为校正input误差的内参信号。
X⽣物萤光产⽣反应式⼀、应⽤⽅向1.验证microRNA同mRNA靶向互作。
将待测mRNA的3’UTR序列插⼊报告基因载体，再共转⼊该microRNA，如果萤光素酶活性下降，则提⽰为其靶序列。
2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。
将候选的lncRNA序列插⼊报告基因载体中F-Luc的3’。
双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体
双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。
2.有哪些海肾荧光素酶载体海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。
这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体：A pRL-SV40载体??? pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。
pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。
B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。
a pRL-TK载体pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。
b pRL-null载体pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。
3.用双报告基因有何优点一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。
将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。
海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。
在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。
4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点用双荧光素酶报告基因测试（DLR）有几个优点：•快速•DLR测试不需保温或对样品作预处理。
双荧光素酶报告基因检测系统的开发
Dual-luciferase reporter assay kit(1) Promega公司双荧光素酶报告基因(DLR TM)检测系统试剂盒组分：Promega的DLR TM检测试剂盒专利给出了Luciferase assay bufferII和Stop & Glo® buffer的相关组分和浓度范围，没有具体的数值。
我在专利和文献中也没有找到针对DLR TM检测试剂盒中的passive lysis buffer的成分。
Assay protocol：(2) 文献中用到的几种非商业性双荧光素报告基因检测系统细胞裂解液（cell lysis buffer）配方：(a)源自promega公司的单荧光素酶报告试剂盒：T ris-phosphate（PH7.8）25mMEGTA or EDTA2mMDTT2mMBSA1mg/mlTriton X-1001%Glycerol10%(b) Make the following stock solutions.1M HEPES pH 8 (室温RT)1M DTT (4℃)100mM MgCl2 (RT)裂解液第二种配方（100ml体系）：来自/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=250710ml 1M HEPES PH80.5ml 1M DTT2ml 100mM MgCl22ml Triton X10085ml distilled water反应缓冲液：Firefly Luciferase Assay；Renilla Luciferase Assay Reagent。
a>“A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis”文献作者给出了2种荧光素酶活性检测的反应试剂配方，并与promega公司试剂盒进行了效果比较，检测效率和灵敏度都很高，不逊于promega产品。
双荧光素酶报告基因系统验证miRNA的靶基因笔记
双荧光素酶报告基因系统验证miRNA的靶基因笔记(⼀)什么是双荧光素酶？答：双荧光素酶通常是指萤⽕⾍荧光素酶和海肾荧光素。
其中荧⽕⾍荧光素是从甲⾍（Photinus pyralis）中分离得到，分⼦量为61kDa；⽽海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分⼦量为36kDa。
这两种酶的区别之⼀是他们的底物和辅因⼦不同：萤⽕⾍荧光素酶需要荧光素、氧⽓、ATP和镁离⼦同时存在才能发光；⽽海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧⽓。
萤⽕⾍荧光素酶和海肾荧光素酶的区别之⼆是发光的颜⾊不同：萤⽕⾍荧光素酶产⽣的光颜⾊呈现黄绿⾊，波长550-570nm；⽽海肾荧光素酶产⽣蓝光，波长480nm。
正是由于这两种酶的底物和发光颜⾊不同，所以在双报告实验中得到⼴泛应⽤，它们的发光原理如下所⽰：(⼆)为什么要采⽤双荧光素酶报告系统？答：单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，⽽双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供⼀基准线，从⽽可以在最⼤程度上减⼩细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。
(三)双荧光素酶在miRNA验证其靶基因⽅⾯的原理是什么？答：答：双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤⽕⾍萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故⽽没有交叉⼲扰。
得益于超强的光信号和超⾼的信噪⽐，本系统被⼴泛⽤于 miRNA 靶基因验证。
miRNA 主要通过作⽤于靶基因的 3’UTR 起作⽤，可以将⽬的基因 3’UTR 区域构建⾄载体中报告基因 luciferase 的后⾯，通过⽐较过表达或者⼲扰miRNA 后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映 miRNA 对⽬的基因的抑制作⽤，也即⽤荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合。
(四)在利⽤双荧光素酶验证miRNA的靶基因⽅⾯，插⼊的3’UTR长度应该是多少？答：靶基因的3’UTR长度不⼀，将全长都插⼊载体中不切实际，通常只插⼊包括miRNA结合位点前后200bp左右的序列，⼤概就是400bp[1]，但也有⽂献插⼊的是80个bp[2]，有⽂献选择了200多个bp[3]，但严格来讲，应该选择400bp，以结合位点为中⼼，上游200bp，下游200bp。
promega 双荧光素酶报告基因检测系统 快速Protocol
•••••••••••••••••••ORDERING /TECHNICAL INFORMATION:Reagent Preparation1.1X P L B :Add 1 volume of 55X P a s s i v e L y s i s B u f f e r (P P L B ) to 4 volumes of distilled water. Mix well. Store at 4°C (≤1 month).2.L A R I I : Resuspend the lyophilized LL u c i f e r a s e A s s a y S u b s t r a t e in L L u c i f e r a s e A s s a y B u f f e r I I (10ml for Cat.# E1910, E1960; 105ml for Cat.# E1980). Store at –20°C (≤1 month) or –70°C (≤1 year).3.S t o p & G l o ®R e a g e n t :a.Add 2.1ml of 50X SS t o p & G l o ®S u b s t r a t e to 105ml of S S t o p & G l o ®B u f f e r in the amber S S t o p & G l o ® R e a g e n t bottle provided. Vortex 10 seconds. Store at –20°C for 15 days.b.For a smaller amount of 11X S t o p & G l o ® R e a g e n t :To the required amount of S S t o p & G l o ®B u f f e r , add 50X S t o p & G l o ®S u b s t r a t e to a final 1X concentration. (For example, add 0.2ml of 50X SS t o p & G l o ®S u b s t r a t e to 10ml of SS t o p & G l o ®B u f f e r to make a 1X solution of S S t o p & G l o ® R e a g e n t .)Cell Lysis1.Remove growth media from cultured cells.2.Rinse cultured cells in 1X PBS. Remove all rinse solution.3.Dispense the recommended volume (below) of 11X P L B into each culture vessel.Volumes of 1X PLB to Use in Step 3.Passive Lysis Active Lysis Plate Size 1X PLB Dish/Plate Size 1X PLB 6-well 500µl 100 × 200mm 1ml 12-well 250µl 60 × 15mm 400µl 24-well 100µl 35 × 12mm 200µl 48-well 65µl 6-well 250µl 96-well 20µl 12-well 100µl 4.Passive Lysis :Gently rock/shake the culture vessel for 15 minutes at room temperature. Transfer lysate to a tube or vial.**For automated applications, the DLR™ Assay is performed directly in the multiwell plate.Additional protocol information is available in Technical Manual #TM040 or #TM046, available online at:Cell LysisRemove growth media from cells.Rinse with 1X PBS.Add 11X P L B .Perform lysis.Transfer to a new tube or vial.*2866M A 02_0A•••••••••••••••••••ORDERING /TECHNICAL INFORMATION:Dual-Luciferase ®and Dual-Luciferase ® 1000 Assay ProtocolsAdditional protocol information is available in Technical Manual #TM040 or #TM046, available online at:Plate with ≤20µl of PLB Lysate/well.Dispense 100µl of L A R I I .Measure firefly luciferase activity.Dispense 100µl of S t o p & G l o ®R e a g e n t .Measure Renilla luciferase activity.Assay with Manual or Single-Injector LuminometerPredispense100µl of LL A R I I into luminometer tube.Program luminometer.Transfer 20µl of PLB Lysate. Mix.Measure firefly luciferase activity.Dispense 100µl of S t o p & G l o ®R e a g e n t .Measure Renilla luciferase activity.Assay with 96-Well PlateBefore you begin:Set injectors 1 and 2 to dispense 100µl of L A R I I and S S t o p & G l o ®R e a g e n t , respectively.For measurements, use a 1- to 2-second delay and a 5- to 10-second read time.(inside luminometer)Repeat cycle for remaining wells in plate.2864M A 02_0A2865M A 02_0A。
双荧光素酶报告基因检测系统-promega
Dual-Luciferase® Reporter Assay试剂准备Luciferase Assay Buffer II 10mlLuciferase Assay Substrate 1vialStop & Glo® Buffer 10mlStop & Glo® Substrate, 50X 200ulPassive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH0中，40C2保存（一个月）。
R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay BufferII 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。
3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo® Substrate加入49体积的Stop& Glo® Buffer中（-200C保存15天）。
（每次试验需要100ul）细胞处理1. 吸除细胞培养液2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞3. 加入1X PLB（推荐用量）4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min，瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。
重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。
pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。
具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。
1. 将质粒DNA(3.2µg)与phRL-tk (0.8µg)按1:4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min;3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0.8mL;4. 6h后，加入2mL完全DMEM;5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;6. 100µg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 µM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)；（H2O2不引起OGG1升高）7. 采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为化学发光仪(30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作。
双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验引言。
双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告实验是一种常用的生物学实验技术，用于研究基因表达调控、转录因子活性、信号转导通路等生物学过程。
该实验利用双荧光素酶作为报告基因，通过测定其产生的荧光信号来研究目标基因的表达水平和调控机制。
本文将介绍双荧光素酶报告实验的原理、操作步骤和数据分析方法，以及该技术在生物学研究中的应用。
一、双荧光素酶原理。
双荧光素酶系统由火萤酶（Luciferase）和甲基火萤酶（Renilla Luciferase）两种荧光素酶组成，分别对应于两种不同的底物荧光素和甲基荧光素。
在双荧光素酶报告实验中，将目标基因的启动子区域与火萤酶基因或甲基火萤酶基因连接，构建成双荧光素酶报告载体。
通过转染该报告载体到细胞中，利用双荧光素酶底物依次检测火萤酶和甲基火萤酶的活性，从而测定目标基因的表达水平和调控机制。
二、实验操作步骤。
1. 构建双荧光素酶报告载体，将目标基因的启动子区域克隆至双荧光素酶报告载体中，构建成双荧光素酶报告载体。
2. 细胞培养和转染，选择适当的细胞系进行培养，将构建好的双荧光素酶报告载体转染到细胞中。
3. 荧光素酶活性检测，使用双荧光素酶检测试剂盒，按照说明书进行火萤酶和甲基火萤酶的活性检测。
4. 数据采集和分析，测定荧光素酶活性的荧光信号，并进行数据的统计分析和图表展示。
三、数据分析方法。
1. 荧光素酶活性比较，分别测定转染实验组和对照组的火萤酶和甲基火萤酶活性，计算两者的荧光信号比值，用于比较目标基因的表达水平。
2. 荧光素酶活性调控分析，在不同处理条件下进行双荧光素酶报告实验，比较不同条件下的火萤酶和甲基火萤酶活性，分析目标基因的调控机制。
四、双荧光素酶报告实验的应用。
1. 研究基因表达调控，通过双荧光素酶报告实验，可以研究转录因子对目标基因启动子的调控作用，揭示基因表达调控的分子机制。
2. 研究信号转导通路，利用双荧光素酶报告实验，可以分析信号转导通路中的关键分子对目标基因表达的调控作用，揭示信号转导通路的调控机制。
双荧光素酶系统实验操作步骤及方法
启动子-Luc
转染细胞
刺激物处理 未处理对照
LUC
细胞内目的基因 的转录被激活
启动子
测得的荧光值
启动子-Luc的 启动子被激活
Luc的转录 Luc表达量
➢ 同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目 和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确 性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase ）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共 转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实 验条件变化的干扰。
Protocols Run Promega Protocol DLR-O-INJ OK 3.将50μl LAR II加入1.5ml EP管中（专用的进口EP管），取
10μl 细胞裂解液加入装有LAR II的1.5ml EP管中，吹打2-3 次混匀（尽量不要吹出气泡），置于检测仪，点击 “Measure” 开始读数（为萤火虫荧光素酶反应强度）。（ 使用前LAR II要混匀，并平衡到室温）
4. 测量结束后，取出EP管，再加入50μl Stop & Glo® Reagent ，吹打2-3次混匀（尽量不要吹出气泡），再次置于检测 仪，点击“Measure” 开始读数（为内参海肾荧光素酶反应 强度）。（Stop & Glo® Reagent 现配现用，不能保存）
5. 记录读数: 每个样品会有3个数值：RLU1——萤火虫荧光 素酶反应强度, RLU2——内参海肾荧光素酶反应强度, Ratio——RLU1/ RLU2。一ห้องสมุดไป่ตู้记录Ratio 值即可，但RLU1 和RLU2为实际荧光强度值，可以反映细胞的转染效率， 也可根据实际荧光强度来调整报告质粒与内参的比例。
双荧光素酶报告基因原理
双荧光素酶报告基因原理
双荧光素酶报告基因是一种常用的测量基因转录活性的方法。
它可以通过荧光信号的读数来表达基因的表达程度，是许多实验室研究中使用的基础技术。
双荧光素酶报告基因的原理是基于荧光分子的性质。
荧光分子通常具有在电子能级间跃迁时吸收和放射光子的能力，因此它们可以被用来标记分子或触发荧光。
在双荧光素酶报告基因系统中，荧光分子通常被用于标记报告基因。
报告基因是那些包含可转录区域和调节元件的DNA序列，而荧光素酶报告基因特定于DNA序列。
因此，在实验中，荧光素酶基因被转染到体外细胞或植物细胞中，荧光分子会与其结合成荧光素酶复合物。
荧光素酶复合物在存在荧光素底物时催化荧光素底物转变为发射荧光的代谢产物，即荧光素。
这种发射荧光的信号可以通过荧光读数器进行测量。
因此，双荧光素酶报告基因的读数可以反映报告基因的表达程度。
这种方
法可以非常灵敏地检测基因表达的变化，可以用于判断基因表达
受到调控因素的影响。
当然，双荧光素酶报告基因技术也有其局限性。
一方面，由于
不同的细胞或组织内部环境的不同，荧光素酶的表达水平可能会
受到一些方面的影响，从而影响测量结果的准确性。
另一方面，双荧光素酶报告基因技术只能检测已经转录的基因，而无法检测可能受到转录后修饰的基因，或包含缺失或突变的基因。
因此，在进行实验前，需要对实验设计进行详细、系统的规
划和考虑。
综上所述，双荧光素酶报告基因技术是一种有效的基因表达检
测方法，广泛应用于生物医学和分子生物学的研究领域。
但是，
该技术的实验设计和数据分析需要谨慎地考虑其局限性和优缺点。
荧光双报告系统
荧光双报告系统简介荧光双报告系统（Fluorescent Dual Reporter System）是一种常用于生物学研究中的分子工具。
通过引入两个不同的荧光报告基因来实现对目标基因表达的定量监测和可视化。
荧光双报告系统具有灵敏、准确、实时监测等优势，在基因调控、药物筛选、细胞信号传导等领域发挥着重要作用。
原理荧光双报告系统的原理基于自然界存在的一些生物现象和分子机制，其中常用的有双荧光素酶（Dual Luciferase）、绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）等。
双荧光素酶系统双荧光素酶系统采用荧光物质荧光素（luciferin）和酶荧光素酶（luciferase）来实现荧光信号的产生。
该系统使用两种不同的荧光素和对应的荧光素酶，通常为火萤石酶（firefly luciferase）和海啸藻酶（Renilla luciferase）。
引入双荧光素酶基因到表达目的基因的启动子区域，通过检测两种荧光素酶在细胞中的表达水平，可以获得目标基因的表达量。
GFP和RFP系统GFP和RFP是最常使用的荧光蛋白，它们能够在细胞中发出绿色和红色荧光。
利用GFP和RFP的特性，可以通过将它们作为报告基因连接到目标基因的启动子或编码区，来实现对目标基因表达的监测。
通过荧光显微镜或流式细胞术等技术，可以实时观察到目标基因的表达情况。
应用荧光双报告系统广泛应用于各个领域的研究中，具有许多重要的应用价值和优势。
基因调控研究荧光双报告系统可以用来研究基因调控的过程和机制。
通过构建包含目标基因启动子的荧光双报告载体，并使用转染等技术将其导入到细胞中，可以通过荧光测定的方式来定量检测目标基因的表达量。
进而可以研究转录因子、启动子序列、染色质结构等因素对基因表达水平的影响。
药物筛选荧光双报告系统可以用于高通量药物筛选。
通过将荧光双报告载体导入到特定的细胞系中，可以在细胞级别上对药物的效果进行快速筛选和评价。
该系统能够实时监测目标基因的表达水平，从而判断药物对目标基因的调控效果。
双荧光报告系统
报告基因Promega中文通讯第2期 2002荧光素酶双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。
系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。
介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。
使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。
但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。
另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。
双荧光报告实验步骤
双荧光报告实验步骤：荧光步骤实验报告荧光酶报告实验植物写物理实验报告的步骤实验报告模板篇一：双荧光报告系统报告基因Promega中文通讯第2期2002荧光素酶双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。
系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。
介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。
使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。
但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势, 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。
promega双荧光素酶说明书
promega双荧光素酶说明书摘要：I.引言- 介绍Promega 双荧光素酶报告基因检测系统- 说明该系统的应用领域和实验流程II.实验原理- 介绍荧光素酶报告基因检测技术的基本原理- 阐述Promega 双荧光素酶报告基因检测系统的技术优势III.实验操作- 详细介绍实验操作步骤，包括实验材料、实验方法等- 强调实验过程中需要注意的事项IV.实验结果分析- 介绍实验结果的检测方法和分析流程- 阐述实验结果的可靠性和准确性V.应用案例- 分享几个Promega 双荧光素酶报告基因检测系统在实际应用中的成功案例- 说明这些案例证明了该系统在研究中的重要性和可靠性VI.结论- 总结Promega 双荧光素酶报告基因检测系统的优点和应用价值- 展望该系统在未来的发展和应用前景正文：Promega 双荧光素酶报告基因检测系统是一种广泛应用于生物学、医学等领域的检测工具，它可以帮助研究人员快速、准确地检测基因表达和调控。
该系统采用了荧光素酶报告基因技术，通过荧光信号的强度来反映基因表达的水平，从而实现对基因表达的定量分析。
该系统的应用领域非常广泛，可以用于检测基因表达、基因调控、药物筛选、生物学通路研究等。
在实验流程上，首先需要将待检测的基因与荧光素酶报告基因构建成报告基因质粒，然后将质粒转染到目标细胞中，最后通过检测荧光信号的强度来定量分析基因表达水平。
Promega 双荧光素酶报告基因检测系统的技术优势在于，它采用了两种荧光素酶，可以同时检测两个基因的表达水平，从而提高了检测的准确性和可靠性。
此外，该系统还具有灵敏度高、检测速度快、操作简单等优点，深受广大研究人员的青睐。
在实验操作过程中，需要注意的事项包括：正确选择实验材料、准确设置实验条件、严格控制实验操作等。
只有做好这些细节，才能保证实验结果的可靠性和准确性。
实验结果的分析是整个实验的重要环节。
通过荧光信号的检测和分析，可以得到基因表达水平的数据，这些数据可以用于进一步的研究和分析。
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报告基因Promega中文通讯第2期 2002荧光素酶双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。
但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。
Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。
双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。
系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。
对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。
双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。
介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。
检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。
通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。
报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。
通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。
使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。
但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。
另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。
许多类型的细胞有内源β-Gal 或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。
尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2), 会降低内源性β-Gal和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。
因此,在此类双报告基因检测中, 必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。
理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。
这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。
相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶， Promega 的双荧光素酶报告基因测试 (DLR) 系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。
双荧光素酶报告基因测试化学荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点 , 但它们在进化上的起源不同 , 因此 , 具有不同的酶学结构和底物要求。
这些差别用来发展了 DLR 测试化学 , 选择性地区别这两种发光报告基因的活力。
萤火虫荧光素酶是一个 61kDa 单亚基蛋白质 , 酶活力不需翻译后修饰 (3,4), 在翻译后即可作为遗传报告基因。
在 ATP,Mg 2+ 和 O 2 存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应发光 ( 图 1) 。
在常规反应条件下 , 荧光素的氧化发生时 , 以荧光素-AMP 作为中间体 , 转换非常缓慢。
结果 , 在底物和酶混合后 , 测试化学产生"闪烁"的光 , 并迅速衰减。
专利化的测试试剂 , 定量萤火虫荧光素酶活力 , 掺入了辅酶 A(CoA), 增强快速酶转换来提高反应动力学 (5), 导致持续的"闪烁"发光信号 ( 图 2) 。
图 1由萤火虫和Renilla荧光素酶催化的生物发光海洋腔肠荧光素酶，一个 36 kDa单亚基蛋白质，纯化自天然来源的Renilla reniformis (6)，含有3%的碳水化合物，但是和萤火虫荧光素酶一样，酶活力不需翻译后修饰，在翻译后即可作为遗传报告基因。
海洋腔肠荧光素酶所催化的发光反应，利用O 2 和海样腔肠荧光素(coelenterazine) (图1)。
当用DLR测试化学作实验时，海洋腔肠荧光素酶反应的动力学产生闪烁型发光信号，在检测过程中缓慢地衰减(图2)。
在 DLR测试系统中，用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力。
在完成萤火虫荧光素酶活力("实验"报告基因)的测定后，萤火虫发光被快速湮灭，并同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光反应("对照" 报告基因)。
因此，DLR测试系统整合了两个测试化学，对共表达的两个报告基因作快速地定量，酶来自转染细胞裂解液，或无细胞转录/翻译反应。
萤火虫荧光素酶测试的线性范围延伸达酶浓度的8个数量级，可测定≤1fg (大约10 -20 摩尔)的实验报告基因酶(图3A)。
用双荧光素酶报告基因测试系统，海洋腔肠荧光素酶的线性范围达酶浓度的7个数量级，较低的底限是≤ 10fg (大约3×10 -19 摩尔)的对照报告基因酶(图3B)，并且这两个酶的特异活力相似。
图 2 用双荧光素酶报告基因测试由萤火虫和Renilla荧光素酶产生的发光。
CHO细胞(1×10 6 /60mm培养板)共转染pGL3Control和pRL SV40载体DNA。
细胞用PBS洗涤后，加入400μl PLB制成裂解液。
将20μl小量细胞裂解液和100μl荧光素酶测试试剂II(LARII)混合，萤火虫荧光素酶的活力立即用荧光照度仪检测(细线示踪)。
100μl Stop &Glo TM 试剂加入到荧光照度仪管中，湮灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活Renilla荧光素酶反应，并立即检测Renilla荧光素酶的活力(粗线示踪)。
Turner Designs 型号20/20荧光照度仪配有计算机用来示踪荧光发射，12秒内完成两次测试。
双荧光素酶报告基因测试系统的方式定量两个报告基因荧光素酶的发光信号，可在制备裂解液后立刻进行，不需将样品分成小组分或作额外的处理。
因海洋腔肠和萤火虫荧光素酶均呈现闪烁型反应动力学，作双荧光素酶报告基因测试不需要有试剂注射器的荧光照度仪。
通常DLR测试，大约需要30秒钟完成，如图4所说明。
起始萤火虫荧光素酶报告基因测试时，将一份裂解产物和荧光素酶测试试剂II (LAR II)混合。
在完成萤火虫荧光素酶测试时，此时萤火虫发光被湮灭，同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光，加入Stop & Glo TM 试剂到样品管。
在1秒钟内，Stop & Glo TM 试剂湮灭大于10 5 滴度萤火虫反应的发光信号(图5)，并同时激活海洋腔肠荧光素酶。
图 3 萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶发光反应的线性范围。
纯化的萤火虫和Renilla荧光素酶连续地用含1mg/ml BSA的1×PLB稀释，配有计算机的Turner Designs荧光照度仪用来检测10秒钟的总荧光，在最初2秒的预读延迟后。
直接检测高浓度的两种荧光素酶的发光反应时，在荧光照度仪的样品室中加入中性密度滤光片。
在含10fg和100fg的Renilla荧光素酶反应中测试发光，需减去来自海洋腔肠荧光素自发光的背景信号。
两种荧光素酶的发光活力对各自的测试变化浓度作图。
图 4 用手工荧光照度仪或配有试剂加样器的荧光照度仪的双荧光素酶测试方式。
如荧光照度仪配有两个加样器，将裂解液预先分装到荧光照度仪的管子中，随后按序自动加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II) , Stop & GloTM 试剂。
PLB裂解液PLB裂解液 (Passive Lysis Buffer)，经特别设计可有效裂解培养的哺乳细胞，而不必刮下贴壁细胞或作冻融循环。
尽管PLB设计应用于被动裂解过程中，但它可靠的裂解效果同样有益于使用常规处理方法制作的裂解液。
无论使用何种裂解方法，对培养的哺乳细胞而言，释放到PLB 裂解液中的萤火虫和海洋腔肠荧光素酶报告基因酶是定量和可靠的 (图6)。
被动裂解液的一个明显优点，是可以抑制低水平的非酶促发光 (自发光)，这是海洋腔肠荧光素在水溶液中的固有特点。
通常用来制备细胞裂解液的试剂可增强海洋腔肠荧光素自发光，包括Triton? X-100, Promega的细胞培养裂解试?(CCLR) 和报告基因裂解试剂(RLB)，这些试剂还会显著抑制海洋腔肠荧光素酶的发光反应。
PLB经特别设计用来最大地增强荧光素酶活力，使自发光减弱到最低，可提供最优的测试灵敏度，定量很低水平的海洋腔肠荧光素酶。
另外，PLB抑制发泡，非常适合高通量应用，可用于自动化系统中将培养在多孔板中的细胞组制备成裂解液并测试。
图 5双荧光素酶报告基因测试系统湮灭萤火虫荧光素酶发光和激活Renilla荧光素酶发光。
CHO 细胞裂解液有共转染pGL3 -Control和pRL SV40载体DNA，按图2描述的方法制备。
萤火虫荧光素酶(报告基因1) 和Renilla荧光素酶 (报告基因2) 活力检测在10秒内完成，最初有2秒的预读延迟。
为了显示Stop & Glo TM 试剂湮灭报告基因1的高效率，加入等体积的Stop & Glo TM 试剂 (缺少海洋腔肠荧光素无法激活Renilla荧光素酶反应)，萤火虫荧光素酶发光被湮灭而又不激活Renilla荧光素酶发光。
在这一实验中，湮灭萤火虫荧光素酶反应的残留发光，小于未湮灭反应值的0.0004%图 6 用PLB裂解哺乳细胞的高效率和被动或主动裂解方法。
用pGL3-Control 和pRL-SV40载体DNA共转染图示的培养哺乳细胞，制备裂解液时，向贴壁细胞加入PLB，温和摇动培养液达15分钟 (被动细胞裂解)，或从培养板中刮下贴壁细胞，在-80℃进行 1次冻/融循环(主动细胞裂解)。
萤火虫和Renilla荧光素酶活力用DLR方法确定，如图4所示。
为了便于比较，报告基因活力用主动裂解方法对每种细胞进行归一化。
图A：萤火虫荧光素酶报告基因活力。
图B：Renilla 荧光素酶报告基因活力。
海洋腔肠荧光素酶对照载体 pRL系列设计的 pRL载体系列可在哺乳动物细胞中，组成型地表达海洋腔肠荧光素酶。
这些载体含有克隆自Renilla reniformis (7)海洋腔肠荧光素酶的cDNA (R luc )，在R luc 基因中导入了3个碱基替换，消除了内Bgl II, Bam H I和Nar I 酶切位点，这些突变不造成海洋腔肠荧光素酶表达的氨基酸序列的改变。