什么是荧光定量(转)
荧光定量PCR基础知识
内参-校准生物学误差
• 内参用于校准实验过程对定量结果的影响核酸提取时通常以重量或体积 为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源 于等量细胞（或基因组）
1. 用DNase酶处理样本 2. 检测no-RT对照（不进
行逆转录的样本）
+RT 和–RT 应该至少 相差6-7 Cts
(大约1% 信号由DNA 产生).
+RT -RT
4 阳性对照-监控系统故障
• 内参(管家基因) – 标准品线性范围 – 灵敏度 – 扩增效率
• 外源阳性内对照 – 来源PCR产物 – 质粒 – 阳性样本
3’端的前4个碱基不能有3个以上的G
避免重复序列：避免序列中4个以上的G或连续6个A
选择C比G多的链当探针
5‘端第一个碱基不能为G，如为FAM，则第二个碱 基 也 不 能 是 G。5" 端染料最好连接在T或C碱基上 。
Primer PCR产物大小建议50-150bp
Tm值:58-60℃ Primer长度： 20bp
RNA降解（小量等份分装）
两步法
• 先将RNA逆转录成cDNAs
• 将cDNAs 1:2 – 1:10 稀释
• 加入反应板中，实时扩增 cDNA，或-20º C储存（稳定保 存数周）
– 优势：cDNA远比RNA稳定， 可以反复冻融多次
– 不足：和一步法相比，需要更 多的加样步骤
预扩增
传统的基因表达分析
• 原始光谱视图（Raw Date ） : 显示PCR反应中荧光信号的软件视图 • 背景组分: 仪器基座的背景“噪音”。
背景噪音影响反应的灵敏度。 背景读数存储于计算机并被反应的荧光信号扣除
纯荧光校正
荧光定量PCR技术简介
荧光定量PCR技术简介荧光定量PCR技术简介常规PCR中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA的精确copy数等，如此，荧光定量PCR技术便应运而生。
1、荧光定量PCR概念所谓定量PCR技术（real-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（如下图）。
2、荧光定量PCR与普通PCR的主要区别理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。
这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。
当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。
由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。
所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（如下图），所以在实验过程中我们不能根据最终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。
2.jpg而从上图我们也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR仪上进行96次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96次PCR扩增曲线都有一个共同的拐点，而且拐点极具重现性，为荧光定量PCR技术的应用提供了理论基础。
3、几个基本概念为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR技术，接下来有必要向大家介绍几个最基本的概念。
3.1扩增曲线为了更好的理解荧光定量PCR原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。
描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。
前面我们也了解到，PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线(如下图)从上图我们可以很直观的看出，荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。
荧光PCR定量质量控制及防污染措施
荧光PCR定量质量控制及防污染措施解放军第三0⼆医院王海滨写在课前的话近⼏年在临床检测病毒核酸和细菌核酸上，荧光定量PCR技术越来越⼴泛。
但是如何进⾏治疗控制以及出现污染后怎样进⾏清除污染？本⽂主要讲述怎样来防⽌污染的产⽣。
⼀、荧光PCR定量的概述（⼀）荧光PCR定量的原理实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加⼊荧光基团，利⽤荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进⾏定量分析的⽅法。
常规的PCR也就是电泳PCR，它是合成⼀个正向引物和反向引物为⽬的模板，即DNA或RNA作为⼀个模板扩增，扩增后通过跑电泳的⽅式来检测它存在与否，是相对量的变化。
由于跑电泳经常导致产物外泄，因此污染的⼏率⽐较⾼。
近⼏年 PCR 扩增时在参⼊⼀对引物的同时参⼊单个特异性的荧光探针，该探针为⼀寡核苷酸，两端分别标记单个报告荧光基团和单个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时， Taq 酶的5'端～3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从⽽荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增⼀条 DNA 链，就有单个荧光分⼦构成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物构成完全同步。
通过荧光物质参⼊和TapMan探针技术来做实时荧光PCR,避免了电泳检测结果的过程,使整个PCR过程从扩增到检测都在⼀个封闭的状态。
荧光集团⽬前临床常⽤的有两个，⼀个是SYBR green，⼀个是TapMan探针。
SYBR green是⼀类荧光染料，能与所有的 DNA 双链相结合，对 DNA 模板没有选择性，所以特异性不如 TaqMan 探针。
变性后双螺旋变成单链，然后作为扩增的模板。
在扩增的过程中由变性到负性扩出了另⼀条链和模板DNA进⾏退⽕变成双链。
这时SYBR green染料与 DNA 双链结合,发出荧光信号。
⽤SYBR green荧光染料来作为指⽰剂时，中间要加⼀个溶解曲线来证实它的特异性的问题。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
荧光定量pcr的原理
荧光定量pcr的原理荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测DNA的技术，它结合了PCR和荧光探针技术，可以快速、高效地定量检测DNA样本。
荧光定量PCR的原理主要包括PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个部分。
首先，PCR扩增是荧光定量PCR的基础。
PCR是一种体外扩增DNA的技术，通过反复的热循环使得DNA序列得以扩增。
在荧光定量PCR中，扩增反应中加入了荧光标记的引物和探针，当PCR反应进行到特定的温度时，探针与目标DNA结合，导致荧光信号的释放。
PCR扩增的循环次数越多，荧光信号累积的越多，从而可以定量检测目标DNA的含量。
其次，荧光信号检测是荧光定量PCR的关键步骤。
在PCR扩增过程中，荧光信号会随着DNA的扩增而不断累积。
荧光信号的检测可以通过实时荧光定量PCR仪器来完成，这些仪器可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。
通过监测荧光信号曲线的变化，可以准确地测定目标DNA的含量。
最后，数据分析是荧光定量PCR的最后一步。
通过实时荧光定量PCR仪器获取的荧光信号曲线，可以通过计算机软件进行数据分析。
软件可以根据标准曲线和样本曲线的荧光信号强度来计算目标DNA的含量，从而实现对目标DNA的定量检测。
总的来说，荧光定量PCR的原理是通过PCR扩增、荧光信号检测和数据分析三个步骤来实现对目标DNA的定量检测。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。
希望通过本文的介绍，读者能够对荧光定量PCR的原理有一个清晰的了解，并能够在实验中正确应用这一技术。
荧光定量
荧光定量PCR应用
01
绝对定量分析
02
相对定量分析
03
定性分析
病原体定量检测 转基因检测
mRNA表达分析 miRNA表达分析 lncRNA表达分析 CNV差异分析 蛋白表达分析
SNP检测 病原体检测 生物品种鉴定
绝对定量分析
绝对定量分析主要用于进行病原体定量检测(如乙肝类、肠道类、呼吸道 类病原微生物)、转基因植物中转基因成分的定量检测。
二者各有优缺点 ，在不同的研究 目的中被应用 。
两种荧光定量PCR方法比较
定量PCR与普通PCR比较
与常规 PCR相比，荧光定量 PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量 准确、速度快、自动化程度高、全封闭无污染性等特点。
阈值与C(t)值
• C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数；
• 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定 在扩增曲线指数增长期；
定量原理
Ct值与初始模板浓度的对数值 成线性关系：初始模板量越多， Ct值越小。 根据样品扩增达到阈值的循环 数（Ct值）就可分析样品中起 始模板量。
specific product
单一特异峰值 Real-TimePCR扩 增特异目标检测位 置，定量准确。
Non-specific product
specific product
出现杂峰 Real-TimePCR扩 增出现非特异扩增 产物，定量不准确。
定性分析—SNP检测
定性分析-SNP检测用于检测已知单核苷酸突变 DNA多态性，包括单碱基的 转换、插入及缺失。
荧光定量
20160617程节薇
什么是荧光定量(转)
1、什么是定量？以参照物为标准，对终产物进行分析或对过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量。
定量的可行性定量一般是在扩增的指数期进行的。
2、定量定量的理论依据是什么？特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。
理想的扩增结果：×2n 其中Y代表扩增产物量，X代表反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上扩增效率为100%，产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：X(1)n ，其中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个扩增过程中不是固定不变的。
通常X 在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（>30次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。
3、荧光定量定量的理论模式又是什么？是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。
近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量方法，即荧光定量。
扩增通式：①0（1）n②1（1）n 注：[0其中E表示扩增效率，n为循环数，表示在n个周期后产物的数量，1表示在1个周期后产物的数量，T0为原始模板数量。
设定到达指数扩增期时，产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K，为常数，大约在1010左右)高于背景为仪器所识别，此时的循环数为（）,也就是T0（1），取对数即：T0*(1)1(1)* T0 (1)由于对一特定的而言，E与K均为常数，故上式为循环数（）对原始模板拷贝数的对数（T0）一次方程，其标准形式,该直线的斜率为- 1(1)，在横坐标上的截距为(1)，也是荧光定量所谓的标准曲线。
荧光定量pcr 实验报告
荧光定量pcr 实验报告荧光定量PCR 实验报告引言：荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种非常重要的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增特定DNA片段，并通过荧光信号实时监测扩增过程。
本实验旨在利用荧光定量PCR技术，检测目标基因在不同组织中的表达水平。
材料与方法：1. 提取RNA：从待测组织中提取总RNA，采用RNA提取试剂盒按照说明书操作，获得高质量的RNA样品。
2. RNA逆转录：使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应条件为37℃反应30分钟，然后95℃反应5分钟，最后冷却至4℃。
3. 荧光定量PCR反应体系准备：将PCR反应体系按照说明书中的推荐比例配制，包括模板cDNA、引物、荧光探针和PCR Master Mix。
4. 荧光定量PCR反应条件设置：根据引物和荧光探针的特性，设置PCR反应条件，包括初始变性、循环扩增和荧光信号检测等步骤。
5. 荧光定量PCR实验操作：将反应体系加入PCR管或板中，放入荧光定量PCR 仪中，进行扩增和信号检测。
记录荧光信号变化曲线。
结果与讨论：通过荧光定量PCR实验，我们成功检测到目标基因在不同组织中的表达水平。
在实验中，我们选择了心脏、肝脏和肺脏作为待测组织，以GAPDH作为内参基因。
在荧光定量PCR实验中，我们观察到了荧光信号的实时变化曲线，通过计算Ct值（Cycle threshold），可以获得目标基因的相对表达量。
实验结果显示，在心脏组织中，目标基因的表达量较高，Ct值较低；而在肝脏和肺脏组织中，目标基因的表达量较低，Ct值较高。
这与我们的预期相符，心脏是目标基因的主要表达器官，而肝脏和肺脏则是次要表达器官。
这些结果为我们进一步研究目标基因的功能和调控机制提供了重要线索。
荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，能够快速、准确地检测目标基因的表达水平。
通过该技术，我们可以对基因的表达调控机制进行深入研究，为疾病的诊断和治疗提供重要依据。
荧光定量pcr结果怎么看历史数据
荧光定量PCR结果怎么看历史数据什么是荧光定量PCR（qPCR）？荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction），简称qPCR，是一种用于检测和定量特定DNA分子的方法。
它结合了PCR和荧光信号检测技术，可以精确地测定样品中目标DNA的数量。
荧光定量PCR广泛应用于生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域。
荧光定量PCR的结果分析在进行荧光定量PCR实验时，我们常常会得到一组荧光数据。
这些数据代表了不同循环数下目标DNA的荧光信号强度。
1. 阈值周期数（Ct值）阈值周期数（Cycle threshold，Ct值）是qPCR结果分析中最重要的参数之一。
Ct值定义为荧光信号强度达到设定阈值时的PCR循环数。
Ct值越低，说明样品中的目标DNA 含量越高。
2. 商品曲线（Standard curve）商品曲线是一个由已知浓度的标准样品所构建的曲线。
通过检测标准样品的荧光信号强度和浓度之间的关系，可以将未知样品的Ct值与标准曲线进行比较，从而推断出未知样品中目标DNA的浓度。
3. 目标与参考基因的相对表达在一些研究中，我们想要知道目标基因在不同样品中的相对表达水平。
为了实现这一目的，通常会选择一个稳定表达且广泛分布的参考基因。
通过将目标基因与参考基因的Ct值进行比较，可以计算出它们之间的相对表达量。
4. 判定结果的可靠性为了保证实验结果的准确性和可靠性，我们需要注意以下几点： - 重复性：重复进行qPCR实验并比较结果的一致性，可评估实验的稳定性和可重复性。
- 阈值选择：合理选择阈值，通常建议在指数增长阶段的荧光信号取一个固定的数值。
- 负对照：包括未加模板DNA的反应体系，用于验证实验的特异性，即排除潜在的污染或假阳性结果。
如何观察历史荧光定量PCR数据如果我们有一批历史qPCR数据，想要重新分析或比较结果，以下是一些方法和注意事项：1. 比较Ct值首先，我们可以比较不同样品或不同实验之间的Ct值。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
荧光定量pcr中ct值的定义
荧光定量PCR中Ct值的定义一、什么是荧光定量PCR?荧光定量PCR（qPCR）是一种基于聚合酶链反应（PCR）原理的分子生物学技术，通过检测PCR反应过程中释放的荧光信号来定量检测目标DNA或RNA的含量。
相比传统的定性PCR，荧光定量PCR可以提供更精确、灵敏和可靠的结果。
二、Ct值的定义Ct值是荧光定量PCR中的一个重要参数，是Cycle threshold的缩写。
Ct值表示检测到目标序列的荧光信号达到Threshold（阈值）时所需的PCR循环数。
Ct值越低，表示样品中目标分子的起始浓度越高。
三、Ct值的计算方法Ct值的计算方法有多种，其中最常用的是基于基线修正法（Baseline Correction）的阈值法（Threshold Method）。
具体过程如下：1.数据采集：PCR仪会在每个PCR循环的结束时检测荧光信号，并记录下来。
2.数据分析：根据数据采集到的荧光信号，可以得到一条荧光曲线。
3.基线修正：在进行Ct值计算之前，需要对荧光曲线进行基线修正。
基线指的是荧光信号的起始水平，通常选择PCR反应开始的前几个循环作为基线。
4.阈值设置：一般情况下，阈值会被设置为基线修正后的荧光曲线上升的斜率最大处。
阈值的设置需要根据实验设计和具体情况进行调整。
5.Ct值计算：Ct值是荧光曲线与阈值相交的循环数。
PCR仪会自动计算Ct值，也可以通过软件对荧光曲线进行分析来计算Ct值。
四、Ct值的应用Ct值在荧光定量PCR中具有广泛的应用，主要用于以下几个方面：1.定量检测：Ct值与样品中目标分子的起始浓度呈反比关系，可以通过标准曲线法或绝对定量法来计算目标分子的浓度。
2.目标基因表达水平研究：Ct值可以用来比较不同样品或不同处理条件下目标基因表达的水平，从而研究基因的表达调控机制。
3.病原体检测：Ct值可以用来判断病原体的感染程度。
Ct值越低，表示样品中的病原体含量越高。
4.药物研发：Ct值可以用于评估药物的效力和毒性，通过比较治疗组和对照组的Ct值来判断药物的治疗效果。
荧光定量pcr两步法和三步法
荧光定量pcr两步法和三步法1 荧光定量PCR简介荧光定量PCR是一种检测DNA样本中特定目标序列数量的方法，它结合了聚合酶链式反应（PCR）技术和荧光探针的使用。
相对于传统PCR技术，荧光定量PCR能够给出更加准确的目标序列数量结果，并且可以在一个反应管中同时检测多个目标序列。
荧光定量PCR分为两步法（Two-Step qPCR）和三步法（Three-Step qPCR），它们的反应机理有所区别，适用于不同的实验需求。
2 两步法2.1 反应机理两步法荧光定量PCR，又称为逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR），是通过逆转录将RNA转化为cDNA，再将cDNA参与PCR反应，并通过荧光探针实时监测反应过程中目标序列数量变化的方法来定量RNA的表达水平。
具体过程：先用一个专门的逆转录酶II将RNA转化为cDNA，然后将cDNA加入到PCR反应中，PCR反应过程中，荧光探针会与目标序列结合并荧光发射，PCR反应的进程中，荧光探针完全分解之前，荧光信号增强，通过分子探测器检测荧光信号的数量，即可以得到目标序列的数量。
2.2 应用场景两步法荧光定量PCR通常被用于研究转录调控、RNA可变剪接的研究，以及疾病诊断中的病原体检测，包括HIV、乙肝病毒、H1N1流感病毒等等。
3 三步法3.1 反应机理三步法荧光定量PCR，又称为普通荧光定量PCR或SYBR-green染料荧光定量PCR，是利用SYBR-green染料的荧光信号实时监测PCR反应过程中DNA目标序列数量变化的方法来定量DNA的含量。
具体过程：PCR反应体系中加入SYBR-green染料，在PCR反应过程中，荧光信号随着PCR扩增产物的增加而增大，通过检测荧光强度的变化，可以计算出PCR扩增产物的数量。
3.2 应用场景三步法荧光定量PCR通常被用于基因表达、基因定量、基因型鉴定以及SNP分析等实验中。
4 两步法和三步法的区别两步法和三步法的主要区别在于荧光信号的来源不同。
荧光定量分析仪原理
荧光定量分析仪原理
荧光定量分析仪是一种利用化学物质在吸收辐射能量后再放出辐射的特性来定量测定样品中特定物质含量的仪器。
它基于荧光现象的产生和测量，与光谱仪一起使用，能够提供准确、快速的分析结果。
荧光定量分析仪的工作原理是通过激发样品中的化学物质产生荧光，并测量荧光的强度来确定物质的含量。
它利用激发光源产生的电磁辐射能量来激发样品中的分析物，激发后的分析物进入高能级激发态，当分析物从高能级跃迁回到基态时，会放出能量较低的光子，即荧光。
荧光的发射波长和强度与分析物的浓度成正比关系。
荧光定量分析仪通常包括一个光源、一个激发光滤光片、样品室、检测器和信号处理系统。
光源产生适当波长的激发光，经过激发光滤光片选择特定波长的光进入样品室。
样品室中的分析物被激发后产生荧光，荧光通过检测器接收并转换成电信号。
信号处理系统对电信号进行放大和数字化处理，并根据预先建立的标准荧光强度与分析物浓度的关系曲线，计算出样品中分析物的含量。
荧光定量分析仪具有灵敏度高、选择性强、操作简便等优点，广泛应用于化学、生物、环境等领域的测量和分析。
它在药物研发、环境监测、食品安全等方面发挥了重要作用，为科学研究和工业应用提供了可靠的分析结果。
荧光定量PCR
荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。
其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。
荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。
2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。
因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。
TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。
在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。
只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。
荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。
cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。
2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。
3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。
4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。
荧光定量pcr原理
荧光定量pcr原理荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是一种可以在实验室中快速准确测量DNA的技术，它使用荧光来检测和计算特定DNA序列的定量，在生物学和医学研究中极其重要。
本文旨在深入讨论荧光定量PCR的原理，以及它是如何在分子生物学研究中发挥作用。
一、荧光定量PCR原理荧光定量PCR（qPCR）是一种检测DNA的技术，它使用荧光探针和背景抑制剂来检测DNA片段的存在。
qPCR使用DNA复制的反应来放大特定的DNA序列，并使用荧光探针来检测这些序列。
荧光定量PCR的过程包括三个主要阶段：反应制备、反应启动和反应完成。
在反应制备阶段，实验室工作人员将模板DNA、反转录酶（RT）、DNA聚合酶（Taq）、荧光探针和背景抑制剂放入PCR反应管中。
在反应启动阶段，Taq DNA聚合酶将反应温度升至95摄氏度以上，以启动DNA复制。
在复制过程中，荧光探针捕获复制产物，并发出荧光信号，使其可以被检测到。
在反应完成阶段，实验室工作人员将反应温度降至60摄氏度以上，以终止DNA复制。
在这个阶段，实验室工作人员可以使用特定设备（如实时PCR仪或qPCR仪）测量DNA复制产物的定量，以确定模板DNA的定量。
二、荧光定量PCR的应用荧光定量PCR在分子生物学研究中发挥着重要作用，它可以用来精确测量模板DNA的定量，以及从细胞或组织样本中快速鉴定出特定的基因。
它还可以用来研究不同细胞和组织中特定基因的表达水平，以及研究基因突变、转录因子的活性等问题。
荧光定量PCR在病毒感染的检测中也发挥着重要作用，它可以快速确定病毒的存在，以及病毒在体内的活跃度。
例如，可以使用qPCR快速检测COVID-19病毒，从而帮助诊断和控制疾病的传播。
此外，荧光定量PCR还可以用于在肿瘤组织中鉴定具有致癌潜能的基因突变，并帮助确定患者是否需要接受放疗或化疗治疗。
qPCR技术也可以用于检测细菌和真菌感染，以及检测抗药性菌株，帮助确定最佳治疗方案。
荧光定量PCR方法高敏感特异
荧光定量PCR方法高敏感特异引言：荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是一种可以准确测量DNA或RNA的数量的分子生物学技术，其特点是具有高灵敏度和高特异性。
本文将重点介绍荧光定量PCR方法的原理、优势以及如何实现高敏感特异的目标。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR是一种基于聚合酶链反应（PCR）的扩增技术。
它在PCR反应过程中利用荧光染料或标记物（如SYBR Green I或探针）与PCR产物结合，通过检测荧光信号的强度来定量分析初始模板的数量。
荧光定量PCR基本步骤如下：1. DNA/RNA样本的提取和纯化；2. 反转录（如果需要检测RNA）和前处理步骤；3. 设计和合成引物；4. 设置PCR反应体系，包括引物浓度、模板浓度等；5. 扩增反应，通常包括热启动和多个循环的温度变化；6. 实时监测荧光信号的强度；7. 定量分析数据。
二、荧光定量PCR的优势1. 高灵敏度：荧光定量PCR可以检测到非常低的模板浓度，如单个拷贝级别的DNA/RNA分子。
这对于检测罕见突变、低表达基因以及病原体感染等非常有价值。
2. 高特异性：荧光定量PCR可以通过设计特异性引物来避免非特异性扩增。
这是由于引物的碱基序列与目标DNA/RNA序列的互补性，使得只有目标序列才能被引物特异性地扩增，避免了背景干扰。
3. 可靠性和稳定性：荧光定量PCR采用实时监测模式，可以在PCR反应过程中实时检测荧光信号强度，减少结果的变异性。
此外，不同批次之间的实验结果也具有良好的重复性和可比性。
三、实现荧光定量PCR的高敏感特异要实现荧光定量PCR的高敏感特异，需要从以下几个方面进行考虑和优化：1. 引物设计：引物的设计是影响荧光定量PCR的灵敏度和特异性的关键因素。
合理选择引物的碱基序列和长度，可以提高引物与目标序列的互补性。
此外，引物的浓度和两个引物之间的相对浓度差异也可以影响PCR反应的特异性以及扩增效率。
荧光定量 PCR 要点解析
荧光定量PCR要点解析一、荧光定量PCR 原理荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR 扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
以探针法荧光定量PCR 为例：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
开始时，探针完整地结合在DNA 任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR 扩增时，Taq 酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。
传统的PCR 进行检测时，扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离，并且只能作定性分析，不能准确定量，易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制。
实时定量PCR 技术不仅实现了对模板的定量，且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点，使得荧光定量PCR 逐渐取代常规PCR。
在PCR 扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线，这条线是可以自动生成也可以手动设置的。
之后反应会进入指数增长期，这个期间扩增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将荧光阈值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT 值，这个值与起始浓度的对数成线性关系，且该值具有重现性。
Ct 值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。
相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。
荧光定量PCR的原理及使用
荧光定量PCR的原理及使用荧光定量PCR(FQ-PCR)就是新近出现的一种定量PCR检测方法。
其基本特点就是:1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。
2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA,或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得,大大提高了检测的灵敏度、特异性与精确性。
3、动态实时连续荧光检测,免除了标本与产物的污染,且无复杂的产物后续处理过程,高效、快速。
下面介绍常用的几种检测方法:1、双链DNA内插染料某些染料如SYBR GreenⅠ能选择性地与双链DNA结合,同时产生强烈荧光。
在PCR过程中SYBR GreenⅠ可与新合成的双链DNA结合,产生的荧光信号与双链DNA成正比。
SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I就是一种只与DNA双链结合的荧光染料。
当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。
因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。
SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程就是:1、开始反应,当SYBR Green 染料与DNA双链结合时发出荧光。
2、DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。
3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。
4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合,对DNA模板没有选择性,所以特异性不如TaqMan探针。
要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性与PCR反应的质量要求就比较高。
在此前提下,本法就是一种成本低廉的选择。
2、TaqMan探针技术原理TaqMan探针法就是高度特异的定量PCR技术,其核心就是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。
荧光定量pcr 应用
荧光定量pcr应用
1.什么是荧光定量PCR
荧光定量PCR是一种快速检测DNA浓度的方法，其原理是利用PCR 技术扩增DNA同时添加特定荧光剂并使用荧光实时检测仪器记录荧光信号，从而测定反应体系中的DNA量。
2.荧光定量PCR的优势
荧光定量PCR方法优于传统的凝胶电泳，它可以直接定量DNA的起始量，且准确度更高，而且更加快速，因为它是实时检测，可以在PCR反应过程中快速得出结果。
3.荧光定量PCR的应用
荧光定量PCR广泛应用于分子生物学和遗传学领域。
例如，荧光定量PCR可用于以下方面：
-检测肿瘤标志物，早期发现并诊断肿瘤疾病；
-检测某些遗传性疾病的基因突变，如囊性纤维化的基因突变；
-定量检测微生物、细胞和病毒中的DNA、RNA等分子物质的数量；
-监测特定基因表达的水平，如荧光定量RT-PCR常用来检测mRNA 的表达水平。
4.荧光定量PCR的操作步骤
荧光定量PCR需要进行以下步骤：
（1）选择合适的引物，设计PCR反应体系；
（2）加入荧光探针，使用荧光实时检测仪器检测荧光信号；
（3）设置PCR反应程序，进行PCR反应。
5.总结
荧光定量PCR已成为快速、准确、高信噪比和灵敏度的PCR定量方法。
它广泛应用于医学临床、生物医学工程与生物技术等许多领域中，将为分子医学的发展和完善做出贡献。
荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。
但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。
因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。
如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。
Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。
与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。
下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。
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1、什么是定量PCR？以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR 扩增的指数期进行的。
2、定量PCR定量的理论依据是什么？特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。
理想的扩增结果：Y=X×2n 其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：Y= X(1+E)n ，其中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。
通常X 在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（>30次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。
3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。
近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量PCR方法，即荧光定量PCR。
PCR扩增通式：①Tn=T0（1+E）n②Tn=Tn-1（1+E）n 注：[0其中E表示扩增效率，n为循环数，Tn表示在n个周期后PCR产物的数量，Tn-1表示在n-1个周期后PCR产物的数量，T0为原始模板数量。
设定PCR到达指数扩增期时，产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K，为常数，大约在1010左右)高于背景为仪器所识别，此时的循环数为CP（crossing point）,也就是K= T0（1+E）CP，取对数即：lg K=lg T0+CP*lg(1+E)CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)由于对一特定的PCR而言，E与K均为常数，故上式为循环数（CP）对原始模板拷贝数的对数（lg T0）一次方程，其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为-1/lg(1+E)，在横坐标上的截距为lgk/lg(1+E)，也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。
例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标准曲线：目前荧光定量PCR均采用外标定量外标法定量PCR扩增效率的计算，由于标准曲线的斜率(Slope)为- 1/lg(1+E)，可知E=10-1/Slope-1 ,如从标准曲线中知道Slope=-3.337,则可推知扩增效率E=101/3。
337-1=0.99,也有作者将(1+E)直接视为扩增效率E，则E=10-1/Slope，求得的E值均在1—2之间，有时也有大于2的结果，如下图所示。
另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分析扩增效率的高低，例如系列10倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0En2, N3=(10*N0)En3,在扩增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同，即N2=N3，En2-n3=10,取对数得到⊿ngE=1, E=101/⊿n，E=2，⊿n=3.32; E=1.8，⊿n=3.91.反之亦然。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类以及最后检测的信号的不同可分为四种类型：①直接定量检测法，②同位素标记定量，③酶标记定量检测法，④荧光定量PCR技术荧光定量PCR 主要原理发射波长与受体荧光染料光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。
SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光大增强。
因此，SYBR Green I的检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I的优点：SYBR Green I的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。
5、为什么要用荧光定量PCR技术进行定量？它与传统的定量PCR有什么不同？如前所述的，传统的定量PCR有很多，主要是倍比稀释法、内参照法、竞争法、PCR-ELISA法，但这些定量PCR技术的难点主要在于：（1）如何确定PCR正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。
（2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。
为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；有的研究者加一个竞争性模板，有的做限制性的稀释梯度分析，或者加一个PCR模拟（mimic）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增，而扩增产物的检测通常在跑胶以后通过染料、放射活性或者探针进行检测。
（3）大多数是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。
同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（如下图所示），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量；虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。
但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法，所以传统定量PCR的缺点是：劳动强度大、定量不准确、重复性差。
而荧光定量PCR有如下显著的优点：1、特异性好，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。
同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。
2、灵敏度高，荧光PCR 检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。
3、线性关系好、线性范围宽，由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量；定量范围可在0－1010拷贝/毫升。
4、操作简单、安全、自动化程度高、防污染。
扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。
5、速度快、高通量，可在2－3小时完成96个样品的定量分析。
6、荧光定量PCR为什么使用外标定量，而不是内标定量？A、内标对实时荧光定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
B、荧光定量PCR无需内标定量实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。
实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：（1）Ct值的高度重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
（2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。
7、为什么要用定量PCR而不是定性PCR？在实验生物学及临床医学的一些场合，由单纯PCR所提供的阳性或阴性结果还远远不够，在阐述许多问题的本质时，基因及其表达的定量起着至关重要的作用。
定量PCR常用来研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。
通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来，为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。
与非定量PCR分析方法不同，定量PCR分析的操作程序有助于评估污染的情况，即测出污染的程度，即使负对照产生了正的信号，只要这些信号比实验样品的低得多，依据这样的结果，至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的。
在一定程度上消除了单纯PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。
8、如何设计荧光定量PCR实验方案？1)、大量阅读相关的背景资料后，根据自己所要研究的基因名称，在genebank中找到相应的基因序列。
（）2)、用引物设计软件Primer5.0、Oligo6.0或beacon designs3.0进行引物探针的设计；（该软件可在下载）引物设计通常遵守如下原则：A、引物与模板的序列要紧密互补。
B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。
C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
D、引物长度通常在20－25bp,Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%，产物大小在100-250bp之间。
E、引物的3’端避免使用碱基A；引物3’端避免出现3 个以上连续相同的碱基。
F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
探针设计通常遵守如下原则：A、探针位置尽可能地靠近上游引物。
B、探针长度通常在20－30bp，Tm值在65－70℃，通常比引物高5－10℃，GC 含量在40%－70%。
C、探针的5’端应避免使用碱基G。
D、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。
3）、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
(www.ncbi.nlm.nih/blast)4）、根据仪器特点和个人的喜好，选择标记的荧光素种类。
如：FAM、Texas red、LC-Red640，LC-Red705等，同时确定荧光定量PCR的方法，选择Taqman或beacon等，可参考前面所述。