检测细胞活性或毒性(Molecular Devices)

在SpectraMax MiniMax 300细胞成像系统上应用 EarlyTox细胞完整性试剂

盒检测细胞活性或毒性

图1. EarlyTox细胞完整性试剂盒检测原理

Live Red Dye

Dead Green Dye

Live Cell Dead Cell

EarlyTox ™细胞完整性试剂盒由一系列易于识别活细胞和死细胞的优化试剂组成。可用于检测不同处理对细胞活性的影响，也可评估不同机制产生的细胞毒性，包括凋亡和坏死。该试剂盒设计工作于多种细胞类型，贴壁和悬浮均可。简单的操作流程和优异的试剂表现使其能应用到高通量扫描上。试剂盒中使用了两种结合DNA的荧光染料，一种为细胞膜可穿透的活细胞红色染料，一种为细胞膜不可穿透的死细胞绿色染料。红色染料可进入所有细胞的细胞核，细胞膜是否完整对其无影响，并可被激发产生亮红色荧光信号。绿色染料只能进入死细胞并产生亮绿色荧光，此类细胞的细胞膜已不完整(图1)。因此，活细胞和死细胞能通过成像系统拍摄到的荧光信号被轻易区分和识别到。

SpectraMax ™ MiniMax ™ 300细胞成像系统和SoftMax ® Pro软件为EarlyTox细胞完整性试剂盒的应用提供了成像和数据分析的整套硬件软件工具。使用仪器的双通道荧光成像功能以及软件的单细胞分析功能，可在5分钟内分析一块96孔板细胞活性。

方法

HeLa细胞以5000个/孔的密度接种到黑壁底透384孔板，培养24小时使其贴壁并生长，然后孔中加入具细胞毒性的药物。药物处理24小时候，按照试剂盒说明书加入染料标记后检测细胞活性。操作方法应尽量均一，以减少移除培养基、冲洗步骤造成的细胞损失和结果不准确性。可选的遮蔽试剂能用于减少培养基或待测药物产生的背景值。

特点

• • • 信号强，缩短曝光时间，成像速度更快

适用于各种细胞类型，应用广泛拍照和分析一体完成，流程简化

通过试剂盒中两种不同特性的染料区分出活细胞和死细胞。红色染料进入所有细胞并将其细胞核标记为红色，另外绿色染料能进入具有不完整细胞膜的细胞中，并将其细胞核标记为绿色。只带红色荧光的细胞被成像和识别为活细胞，同时那些既发绿光又发红光的细胞被识别为死细胞。

图2. 分析未处理组与药物处理组的HeLa细胞

Untreated

3.1 µM Anisomycin

25 µM Anisomycin

图3. 细胞毒性药物的IC 50曲线

Compound (µM)

P e r c e n t L i v e C e l l s

A

B

结果

采用SpectraMax MiniMax 300细胞成像系统的绿色(541nm发射)和红色(713nm发射)通道对384孔进行高通量细胞成像(图2A)。对红色通道成像的图片设置物体大小和荧光阈值，软件的目标识别功能可自动识别每张图片中的所有细胞核。然后通过区分只标记红色的细胞核与同时标记红色绿色的细胞核，软件的分类功能将自动识别计数活细胞和死细胞(图2B)。最后可输出一系列详细数据，例如每孔中活细胞占总细胞百分比。SoftMax Pro软件可进行4参数拟合得到有关药物浓度与细胞活性的IC50曲线(图3)。

结论

同时使用SpectraMax MiniMax细胞成像系统和EarlyTox细胞完整性试剂盒可以通过荧光成像快速方便准确地检测到死细胞和活细胞数目。各种细胞机制导致的细胞毒性均可被识别和定量。SoftMax Pro软件既可区分活细胞和死细胞的不同染色模式，还可自动对数据进行曲线拟合，无需复杂的数据导入导出，节约了数据分析处理时间。

A．未处理组(左图)中大多数细胞为活细胞，核带红色荧光；中浓度药物处理组(中图)中活细胞死细胞混杂存在；高浓度药物处理组(右图)中大多数细胞为死细胞，核同时标记红绿两色。

B．SoftMax Pro软件使用分类功能将细胞区分为活细胞(红色蒙板)或死细胞(蓝色蒙板)。

用茴香霉素(红色曲线)和十字孢碱(蓝色曲线)处理的HeLa细胞。结果用SoftMax Pro软件进行四参数拟合。茴香霉素IC 50=3.3µM，十字孢碱IC 50=0.53µM；两值均符合发表数据。

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