细胞毒实验
细胞毒 标准
细胞毒标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：细胞毒标准是一种对生物体细胞产生不良影响的物质的指导标准。
细胞毒性测试是评估化合物或药物对细胞的危害程度的一种重要方法。
根据世界卫生组织的定义，细胞毒性是指化合物对细胞的有害效应，包括细胞死亡、DNA损伤、细胞形态改变等。
细胞毒性标准的制定对于药物研发、环境监测等方面具有重要意义。
细胞毒性测试是在药物研发、食品安全评价、环境毒理学等领域广泛应用的重要手段。
通过细胞毒性测试，可以评估新药对细胞的毒性，为药物的安全性评估提供数据支持。
细胞毒性测试也可以在食品添加剂、农药、化妆品等产品的安全性评估中发挥重要作用。
细胞毒性测试还可以用于评估环境中有毒化合物的危害程度，指导环境保护和治理工作。
细胞毒性标准的制定是规范细胞毒性测试的重要手段。
通过制定统一的细胞毒性测试方法和评价标准，可以确保测试结果的准确性和可比性，为药物研发和产品安全评价提供可靠的数据支持。
细胞毒性标准通常包括测试方法、样本处理、数据分析和结果解释等内容，旨在提高细胞毒性测试的标准化程度，推动相关领域的科研工作和技术发展。
在制定细胞毒性标准时，需要考虑不同类型的测试样品和测试目的，充分考虑测试方法的可操作性和实用性。
还需要考虑到细胞毒性测试的特殊性，避免干扰因素对测试结果的影响。
制定细胞毒性标准需要多方面的专家共同商讨，确保标准的科学性和实用性。
以上是关于细胞毒标准的文章，希望对您有所帮助。
如果有其他问题，欢迎向我咨询。
谢谢！第二篇示例：细胞毒标准是指在进行细胞毒性实验时所制定的操作规范和指导原则，旨在保证实验结果的可靠性和准确性。
细胞毒性实验是评价物质对细胞的毒性作用的一种重要手段，对药物安全性评价、环境毒理学研究等具有重要意义。
细胞毒标准通常包括以下内容：1. 实验设计：细胞毒性实验的设计应合理、科学，以确保实验结果的可靠性。
设计应包括样本选择、实验方法、数据处理等方面的内容，确保实验过程完整、连贯、可重复。
医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价第 5 局部：体外细胞毒性试验1范围GB/T 16886 的本局部阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
这些方法规定了以下供试品以直接或通过集中的方式与培育细胞接触和进展孵育；a〕用器械的浸提液，和／或b〕与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反响。
2标准性引用文件以下文件中的条款通过GB/T 16886 的本局部的引用而成为本局部的条款。
但凡注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括订正的内容〕或均不适用于本局部，然而，鼓舞依据本局部达成协议的各方争论是否可使用这些文件的最版本。
但凡不注日期的引用文件，其最版本适用于本局部。
GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1 局部：评价与试验〔GB/T 16886.1-2023,idt ISO 10993- 1:1997〕CB/ T 16886. 12-2023 医疗器械生物学评价第12 局部：样品制备和参照材料〔idt ISO 10993-12 :1996〕3术语与定义GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1 中确立的以及以下术语和定义适用于本局部。
3.13.2 阴性比照材料negative control material依据本局部试验时不产生细胞毒性反响的材料。
注：阴性比照的目的是验证背景反响，例如高密度聚乙烯1〕牙科材料的阴性比照物。
阳性比照材料 pos itive control material依据本局部试验时可重现细胞毒性反响的材料。
已作为合成聚合物的阴性比照材料，氧化陶瓷棒则用作注：阳性比照的白目的是验证相应试验系统的反响，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯的阳性比照，酚的稀释液用于浸提液的阳性比照。
2）已用作固体材料和浸提液1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会〔Rockvillie, Maryland, USA〕和Hatano 争论所食品和药品安全中心〔Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan〕获得。
细胞毒性实验总结
细胞毒性实验总结一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识 (1)二、细胞毒性实验方案的确立 (3)三、细胞毒性实验方法稳定后的部分数据 (4)四、细胞毒性实验质量评价指标 (5)五、细胞毒性实验SOP (6)（一）目的 (6)（二）适用范围 (6)（三）责任人 (6)（四）规程 (6)1. 试验准备 (7)2. 试验操作 (8)3．数据处理和分析 (8)六、总结 (9)一、抗HBV药物细胞毒性实验背景知识细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。
按作用机制可分3种类型：①基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；②选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；③细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。
类似毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现。
毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰，任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑。
1983年Ekwall提出“基本细胞功能”的概念，即多数化学物质毒性作用是对细胞功能的非特异性损伤，却可引起器官功能的特异性改变甚至机体死亡。
有研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性。
化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。
体外方法有助于预测化学物质急性暴露引发的全身和局部影响，并评估体内毒性浓度。
目前较为理想的抗HBV药物有拉米夫定（3TC）、恩替卡韦（ETV）等。
3TC是核苷左旋对呋体，早期用于艾滋病的治疗。
改良一步法微量淋巴细胞毒交叉试验
淋巴细胞毒交叉试验也称补体依赖细胞毒试验（cdc）。
它是检查器官移植受者体内有无针对供者，或者供者针对受者的hla抗体，在器官移植前一定要进行cdc检测。
如果受者血清中检出针对供者的hla抗体，一般认为是配合禁忌，移植后受者会发生超急性排异反应，导致移植失败。
由于试验是在施行器官移植术前临时进行匹配的试验，要求在短时间内报告结果，因此我们对该技术作了改良并与传统方法进行比较，收到满意效果。
现报告如下：一、材料和方法1.被检对象：标本来源于我院近10个月住院和门诊280例拟做肾移植待诊病人和其他器官移植待诊病人，采静脉血2 ml不抗凝待测。
2.试剂：免疫磁珠、荧光染液由美国o l公司提供，抗全淋巴细胞抗体试剂购自武汉生物制品研究所。
3.方法：(1)改良一步法：采用免疫磁珠3～5 μl分离出淋巴细胞，在terasaki板上每孔加入无菌矿物油5 μl，每排第1孔加生理盐水1 μl做阴性对照，第2孔加抗全淋巴细胞抗体1 μl做阳性对照，第3～6孔各加受者血清1 μl(即重复4孔试验)，每孔各加供者淋巴细胞1 μl(细胞浓度为2 000个/μl)，每孔各加补体1 μl，置22～25℃室温下反应45 min左右，每孔加荧光染液5 μl，倒置荧光显微镜下观察细胞毒性反应，分析判断结果。
(2)传统常规法见参考文献［1］。
二、结果采用改良一步法进行了400次淋巴细胞毒交叉试验，有9次检出阳性(阳性率为2.25%)。
其中1例患者反复多次cdc阳性，后进行hla抗体检测，特定细胞群反应抗体 (panel reactive antibody， pra) 阳性率为53.5%，提示抗hla-a2抗体增多，故放弃移植。
一步法与传统法试验比较：样本用量一步法1 μl，传统法40 μl；试验全过程一步法1.5 h内完成，传统法需2.5～4 h；补体用量一步法1 μl，传统法40 μl；30例标本用双盲法同时试验，结果一致。
三、讨论改良一步法cdc缩短和简化了试验时间、操作步骤，整个试验过程在1.5 h内完成。
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；K-8法能快速检测；K-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；K-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；5.而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；K-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；K-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：1. 10ul，100-200ul及多通道移液器2. 酶标仪（带有450nm滤光片）3. 96孔培养板4. 二氧化碳培养箱四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。
3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
细胞毒实验
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
从肿瘤组织中分离到的淋巴细胞称为“肿瘤浸润性淋巴细胞” （TIL细胞），并发现这种细胞在体外经白细胞介素2刺激后可 大量增殖。这种刺激后增殖的TIL细胞又称之为“肿瘤来源的 激活细胞”。它具有比LAK细胞更强的特异的杀瘤活性。由于 其特异高效的杀瘤活性，在实验研究及临床应用中，已展现出 用于临床治疗肿瘤的良好前景。
加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min
实验步骤
• 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣 碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩 余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。
微量淋巴细胞毒试验操作规程
微量淋巴细胞毒试验操作规程 SXYJ-GZ-02141目的规范微量淋巴细胞毒试验操作，正确进行HLA抗体鉴定。
2适用范围适用于HLA抗体鉴定。
3职责检测者负责依据此程序进行微量淋巴细胞毒试验操作。
4材料与设备肝素抗凝剂、淋巴细胞分离液、凝血酶、补体、伊红染液、12%甲醛、甘油；空白72孔微量反应板、微量加样枪（1µl、2µl、5µl）、倒置相差显微镜、水平式离心机、血细胞计数池、KUBOTA KA5100型离心机等。
5操作方法5.1待检标本准备及要求移植前交叉淋巴细胞毒患者不抗凝标本3ml,供者肝素抗凝静脉血5ml；习惯性流产女方不不抗凝标本3ml，男方肝素抗凝静脉血5ml。
不抗凝标本充分退缩，分离出血清备用；肝素抗凝静脉血充分混匀，室温放置备用。
5.2淋巴细胞制备5.2.1肝素抗凝静脉血，室温放置20分钟，2000转/分离心10分钟，吸取白膜层于装有2ml盐水的试管中，混匀；5.2.2缓慢加在装有3ml Ficoll液面上，2000转/分离心30分钟，取淋巴细胞层，于另一小试管中，加盐水至3ml,3400转/分离心1分钟（SERO 3键）；5.2.3弃掉上清，加1ml盐水，将细胞轻轻吹起，3400转/分离心15秒钟（SERO 2键），去除血小板的干扰；5.2.4弃掉上清，加入3ml的生理盐水，并将细胞轻轻吹起，3400转/分离心1分钟（SERO 3键），弃掉上清，用1640保养淋巴细胞；5.2.5淋巴细胞浓度调节混匀淋巴细胞后冲入血细胞计数池，倒置相差显微镜下观察细胞浓度为2500-3000个/µl（中方格内的每个小格约20-30个细胞）。
5.3加样5.3.1在空白72孔微量反应板中加液体石蜡，8ul/孔；5.3.2每孔加相应血清1ul(阴性对照孔加血小板配型试剂中阴性对照血清)；5.3.3每孔加淋巴细胞1µl 置室温35分钟；5.3.4每孔加补体5µl，室温65分钟；5.3.5每孔加伊红2µl，室温2分钟；5.3.6每孔加甲醛8µl，盖板；5.3.7将反应板置湿盒内至少4小时或过夜再读板，若是急诊可以600转/分离心5分钟后读板。
毒素对细胞的作用机制及其毒性评估方法
毒素对细胞的作用机制及其毒性评估方法毒素是指对生物体有害的化学物质，它们可以引起中毒和疾病。
近年来，由于人类污染和人类生活方式的变化，毒素的存在和影响越来越重要。
毒素对人体的危害不仅仅是彻底的破坏，同时也会导致许多疾病和症状的发生。
毒素对细胞的影响毒素是一种非常特别的化学物质，它可以对生物体的细胞进行严重的损伤和杀死，甚至影响整个器官的功能和生命力。
这种影响是在分子水平上进行的，因为毒素可以改变生物体内部的化学平衡和生物信息传递的速度、质量和途径。
毒素的作用机制可以大致分为以下三个方面。
1. 作用于膜层。
某些毒素可以改变膜层的结构和功能，细胞内外界物质的交换失去平衡。
这种失衡可能导致细胞的死亡，例如病毒、链球菌等。
2. 作用于细胞内途径。
毒素对细胞内信息传递的途径有影响，例如抑制酶的活性或改变蛋白结构，导致信号传递异常。
3. 作用于细胞生命力。
毒素可能影响细胞的DNA复制或细胞的新生，导致基因突变或细胞的生命周期出现问题。
例如重金属、放射性物质等。
毒性评估方法在评估毒性的时候，必须考虑到细胞和人体的生理特点和差异性。
这是因为毒素在不同的环境中作用方式可能不同，相反也可能导致细胞的代谢和生命力指标的改变。
以下是常见的毒性评估方法：1. 透析膜毒性试验透析膜毒性试验是一种性价比较高的毒性试验方法，它通常用于毒素的筛选，测试毒素是否会对生物体产生毒性，两种物质的对比测试等。
2. 细胞毒性试验细胞毒性试验是在培养皿中进行的，它通常是向一组正常细胞培养中加入毒素，以此评估出毒素的危害程度。
3. 动物毒性试验动物毒性试验是一种比较全面的毒性试验方法，它通常用于毒素对人类的危害评估，测试毒素的致癌性、致畸性、急性毒性等等。
毒素对细胞的影响和危害常常不为人类所知，需要科学家和医学专家们的不断探索和研究。
当然，在进行毒素研究时，要尽量避免使用易受伤害和易受危害的生物，采用合理的科学方法，尽力减少不必要的生命损失。
微量淋巴细胞毒试验原理
微量淋巴细胞毒试验原理微量淋巴细胞毒试验（Microcytotoxicity Assay）是一种常用的体外细胞毒性试验方法，用于评估各种细胞毒性物质对淋巴细胞的毒性作用，以及测定血清中的细胞毒性抗体水平。
本文将详细介绍微量淋巴细胞毒试验的原理、步骤以及相关应用。
原理：微量淋巴细胞毒试验是通过观察淋巴细胞在体外与毒性物质作用后的死亡情况来评估其毒性作用。
该试验通常使用杀伤细胞（如大鼠淋巴瘤细胞线T-Lymphoma Cell line）和靶细胞（如人的白血病细胞）进行共培养，并加入待测物质，观察细胞死亡情况，从而判断待测物质对细胞的毒性作用。
步骤：1.准备试验样本：收集待测物质（如药物、化合物、血清等）和细胞悬液。
2.划定试验板：将细胞悬液和待测物质依次加入96孔板的对应孔中，以确保每个孔的浓度相同。
3.孵育混合物：将孔板孵育在合适的温度下，通常是37℃，并充分孵育一定的时间（如2小时）。
4.加入染色剂：在每个孔中加入染色剂，如溴化乙啶（Ethidium Bromide，EtBr），以染色活细胞和死细胞区分开。
5.观察和记录：使用荧光显微镜观察细胞的存活情况，根据染色剂的染色情况，可以判断待测物质的细胞毒性作用。
应用：1.评估药物的细胞毒性：微量淋巴细胞毒试验可用于评估药物对淋巴细胞的毒性作用，帮助药物研发人员选择合适的候选药物。
2.检测细胞毒性抗体：通过微量淋巴细胞毒试验，可以检测血清中的细胞毒性抗体水平，用于诊断和监测某些自身免疫性疾病，如溶血性贫血和自身免疫性甲状腺炎等。
3.评估环境毒性：微量淋巴细胞毒试验也可用于评估环境样品（如水源、土壤和空气）中的毒性物质，帮助判断环境污染的严重性和对人体健康的影响程度。
4.评估化妆品安全性：微量淋巴细胞毒试验可用于评估化妆品中添加的化学物质对细胞的毒性作用，以确保化妆品的安全性。
优势和限制：微量淋巴细胞毒试验具有以下优势：-简单易行：试验步骤简单，操作相对容易，不需要复杂的设备和技术。
医疗器械生物学评价体外细胞毒性试验
【分享】医疗器械生物学评价-体外细胞毒性试验什么是体外细胞毒性试验？体外细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境，检测医疗器械及生物材料接触机体组织后所发生的细胞溶解、抑制细胞生长和其他毒性作用的体外试验。
体外细胞毒性试验是医疗器械生物学评价体系中最重要的检测指标之一，几乎也是医疗器械及生物材料临床应用前的必选项目。
哪些产品需要进行体外细胞毒性试验？与人体接触或植入体内的医疗器械都需要进行细胞毒性试验。
与人体接触的部位包括：1）表面：皮肤，粘膜，损伤表面。
2）外部接入：组织/骨/牙，循环血液。
3）体内植入：组织/骨，血液。
体外细胞毒性试验的目的和意义目的：评级医疗器械和生物材料致细胞毒性反应的潜在性，并预测最终生物体应用时的组织细胞反应。
通过体外细胞培养技术，可检测供试品接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、细胞溶解、死亡或其他毒性反应。
意义：可在短时间内较经济、简便地筛选出批量供试品的细胞毒性，它为动物试验的进行与否提供了先决条件，对新型医疗器械及生物材料的研制和应用提供了重要保证。
体外细胞毒性试验依据的相关标准o ISO 10993-5:2009 Biological Evaluation of MedicalDevices -- Part 5: Tests for in vitro Cytotoxicityo GB/T16886.5-2007医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验，GB/T16886是由ISO 10993转化过来的标准o GB/T 16175-2008 医用有机硅材料生物学评价试验方法o GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物试验方法o YY/T0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价第2单元试验方法细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法细胞系和培养基的选择优先采用已建立的细胞系并从认可的贮源获取。
试验只能使用无支原体污染细胞，使用前应该检测原代培养细胞是否存在支原体。
USP 87 细胞毒性 体外试验
87BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITROThe following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalian cell cultures following contact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or indirect patient contact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specimen cannot be determined, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to prevent contamination with microorganisms and other foreign matter.Three tests are described (i.e., the Agar Diffusion Test, the Direct Contact Test, and the Elution Test).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its intended use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; contacting media; inks; adhesives; absorption, adsorption, and permeability of preservatives; and conditions of storage. Evaluation of such factors should be made by appropriate additional specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its intended use. Materials that fail the in vitro tests are candidates for the in vivotests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88.USP R EFERENCE S TANDARDS 11— USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS.Cell Culture Preparation— Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells inserum-supplemented minimum essential medium having a seeding density of about 105 cells per mL. Incubate the cultures at 37 ± 1in a humidified incubator for NLT 24 h in a 5 ± 1% carbon dioxide atmosphere until a monolayer, with greater than 80% confluence, is obtained. Examine the prepared cultures under a microscope to ensure uniform, near-confluent monolayers. [NOTE—The reproducibility of the In Vitro Biological Reactivity Tests depends upon obtaining uniform cell culture density. ]Extraction Solvents—Sodium Chloride Injection (see monograph—use Sodium Chloride Injection containing 0.9% of NaCl). Alternatively, serum-free mammalian cell culture media or serum-supplemented mammalian cell culture media may be used. Serum supplementation is used when extraction is done at 37for 24 h.Apparatus—Autoclave— Employ an autoclave capable of maintaining a temperature of 121 ± 2, equipped with a thermometer, a pressure gauge, a vent cock, a rack adequate to accommodate the test containers above the water level, and a water cooling system that will allow for cooling of the test containers to about 20, but not below 20, immediately following the heating cycle.Oven— Use an oven, preferably a mechanical convection model, that will maintain operating temperatures in the range of 50–70within ± 2. Incubator— Use an incubator capable of maintaining a temperature of 37 ± 1 and a humidified atmosphere of 5 ± 1% carbon dioxide in air.Extraction Containers— Use only containers, such as ampuls or screw-cap culture test tubes, or their equivalent, of Type I glass. If used, culture test tubes, or their equivalent, are closed with a screw cap having a suitable elastomeric liner. The exposed surface of the elastomeric liner is completely protected withan inert solid disk 50–75 µm in thickness. A suitable disk can be fabricated from polytef.Preparation of Apparatus— Cleanse all glassware thoroughly with chromic acid cleansing mixture and, if necessary, with hot nitric acid followed by prolonged rinsing with Sterile Water for Injection. Sterilize and dry by a suitable process for containers and devices used for extraction, transfer, or administration of test material. If ethylene oxide is used as the sterilizing agent, allow NLT 48 h for complete degassing.Procedure—Preparation of Sample for Extracts— Prepare as directed in the Procedureunder Biological Reactivity Tests, In Vivo 88.Preparation of Extracts— Prepare as directed for Preparation of Extracts inBiological Reactivity Tests, In Vivo 88using either Sodium Chloride Injection (0.9% NaCl) or serum-free mammalian cell culture media as Extraction Solvents. [NOTE—If extraction is done at 37for 24 h in an incubator, use cell culture media supplemented by serum. The extraction conditions should not in any instance cause physical changes, such as fusion or melting of the material pieces, other than a slight adherence. ]Agar Diffusion TestThis test is designed for elastomeric closures in a variety of shapes. The agar layer acts as a cushion to protect the cells from mechanical damage while allowing the diffusion of leachable chemicals from the polymeric specimens. Extracts of materials that are to be tested are applied to a piece of filter paper. Sample Preparation— Use extracts prepared as directed, or use portions of the test specimens having flat surfaces NLT 100 mm2 in surface area. Positive Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Negative Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation.Procedure— Using 7 mL of cell suspension prepared as directed under Cell Culture Preparation, prepare the monolayers in plates having a 60-mm diameter. Following incubation, aspirate the culture medium from the monolayers, and replace it with serum-supplemented culture medium containing NMT 2% of agar. [NOTE—The quality of the agar must be adequate to support cell growth. The agar layer must be thin enough to permit diffusion of leached chemicals. ] Place the flat surfaces ofSample Preparation, Negative Control Preparation, and Positive Control Preparation or their extracts in an appropriate extracting medium, in duplicate cultures in contact with the solidified agar surface. Use no more than three specimens per prepared plate. Incubate all cultures for NLT 24 h at 37 ± 1, preferably in a humidified incubator containing 5 ± 1% of carbon dioxide. Examine each culture around each Sample, Negative Control, and Positive Control, under a microscope, using a suitable stain, if desired.Interpretation of Results— The biological reactivity (cellular degeneration and malformation) is described and rated on a scale of 0–4 (see Table 1). Measure the responses of the cell cultures to the Sample Preparation, the Negative Control Preparation, and the Positive Control Preparation. The cell culture test system is suitable if the observed responses to the Negative Control Preparation is grade 0 (no reactivity) and to the Positive Control Preparation is at least grade 3 (moderate). The Sample meets the requirements of the test if the response to the Sample Preparation is not greater than grade 2 (mildly reactive). Repeat the procedure if the suitability of the system is not confirmed. Table 1. Reactivity Grades for Agar Diffusion Test and Direct Contact TestGrade Reactivity Description of Reactivity Zone0 None No detectable zone around or under specimen1 Slight Some malformed or degenerated cells under specimen2 Mild Zone limited to area under specimen and less than 0.45 cm beyond specimen3 Moderate Zone extends 0.45 to 1.0 cm beyond specimen4 Severe Zone extends greater than 1.0 cm beyondGrade Reactivity Description of Reactivity ZonespecimenDirect Contact TestThis test is designed for materials in a variety of shapes. The procedure allows for simultaneous extraction and testing of leachable chemicals from the specimen with a serum-supplemented medium. The procedure is not appropriate for very low- or high-density materials that could cause mechanical damage to the cells.Sample Preparation— Use portions of the test specimen having flat surfaces NLT 100 mm2 in surface area.Positive Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Negative Control Preparation— Proceed as directed for Sample Preparation. Procedure— Using 2 mL of cell suspension prepared as directed under Cell Culture Preparation, prepare the monolayers in plates having a 35-mm diameter. Following incubation, aspirate the culture medium from the cultures, and replace it with 0.8 mL of fresh culture medium. Place a single Sample Preparation, a Negative Control Preparation, and a Positive Control Preparation in each of duplicate cultures. Incubate all cultures for NLT 24 h at 37 ± 1in a humidified incubator containing 5 ± 1% of carbon dioxide. Examine each culture around each Sample, Negative Control, and Positive Control Preparation, under a microscope, using a suitable stain, if desired. Interpretation of Results— Proceed as directed for Interpretation of Results under Agar Diffusion Test. The Sample meets the requirements of the test if the response to the Sample Preparation is not greater than grade 2 (mildly reactive). Repeat the procedure if the suitability of the system is not confirmed.Elution TestThis test is designed for the evaluation of extracts of polymeric materials. The procedure allows for extraction of the specimens at physiological or。
细胞毒性试验总结
（一）实验前应明确的问题1。
选择适当的细胞接种浓度.一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系.否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛.根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛.切记!否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间.3. 时间点的设定.在不同时间点的测定OD值,输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显).4。
培养时间.200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果，我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。
做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
6。
理论未必都是对的。
要根据自己的实际情况调整.7.实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔.调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。
对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。
用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性.因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行.在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
(二）实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000—10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验1 范围GB/T 16886 的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T 16886 的本部分的引用而成为本部分的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T 16886.1-2001,idt ISO 10993- 1:1997）CB/ T 16886. 12-2000 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idt ISO 10993-12 :1996）3 术语与定义GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3.1阴性对照材料negative control material按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2阳性对照材料 pos itive control material按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie, Maryland, USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5 ,Hanagawa.257-Japan）获得。
细胞毒性试验培训班用讲义
•
盖法
哪些产品需要进行细胞毒性 试验？
与人体接触或植入体内的医疗器械都需 要进行细胞毒性试验。 接触部位： 1）表面：皮肤、粘膜、损伤表面 2）外部接入：血路间接、组织/骨/牙、 循环血液 3）体内植入：组织/骨、血液
试验材料：细胞系
推荐使用ATCC CCL1(NCTC clone 929)[小鼠成纤维细胞]或ATCC CCL2 (Hela)[人上皮细胞]。如能证明试验的重现性 和精确性，也可选用其他细胞系。优先采用已 建立的细胞系并应从认可的贮源获取。试验应 使用无支原体污染细胞。 用选定的细胞系和培养基制备试验所需的 细胞。使用冻存细胞时, 如加有细胞保护剂应 除去, 使用前至少传代培养一次。
国内标准简介
• 1987年，卫生部标准WS5-1-1987 《医用热 硫化甲基乙烯基硅橡胶》：琼脂覆盖法 • 1996年，GB/T16175-1996 《医用有机硅材 料生物学评价试验方法》：细胞增殖度法 • 1997年，卫生部第81号文《生物材料和医疗 器械生物学评价技术要求》：推荐了琼脂覆盖、 分子滤过、细胞生长抑制三种方法。 • 1997年，GB/T 16886.5-1997等同采用国际 标准ISO 10993-5：1992
有几类细胞毒性试验方法？
GB/T 16886.5－2003/ISO 109935:1999中推荐了三类细胞毒性试验： 1）浸提液试验 2）直接接触试验 3）间接接触试验（包括琼脂扩散试 验、滤膜扩散试验）
常用的细胞毒性试验方法
• 1）浸提液试验（四唑盐（MTT）比色法 或MTT法）：哺乳动物细胞的线粒体酶可 将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色的物质， 用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成溶液， 用酶标仪测定其浓度，从而定量测定细胞 的存活比例。该试验用于细胞毒性定量评 价。对该试验有干扰的供试品不适于本试 验。 2）间接接触试验：琼脂扩散法或琼脂覆
NK细胞毒活性-LDH释放法
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
·7·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)， 即可计算出NK细胞活性。
50ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells +
75ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+
100ul 1% NP-40
100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640
4-6
G
200ul 10% 1640
培养基对照孔
B,C,D
A
SI=
实验孔值-自然释放孔值 Max- S自发
×100%
7-9 10-12 免疫学实验
加 板 方 法
Max=E-F S自发=A-G
·14·
结果处理
免疫学实验
算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐 标为E:T,纵坐标为SI值。
把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel作的图一起贴到实验记录本上。
·8·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，
不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内 释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮 酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还 原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形 成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利 用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
生物学评价之细胞毒性试验
生物学评价之细胞毒性试验1范围细胞毒性试验是利用细胞体外培养方法来评价医疗器械或其浸提液可滤出成分中急性细胞毒性的潜在性。
2 试验项目选择（推荐）根据GB/T16886.5-1997标准中有关细胞毒性试验的要求，现推荐下面任何一种细胞毒性试验方法评价医疗器械的细胞毒性，即琼脂覆盖法，分子滤过法，生长抑制法。
3 试验条件（1）细胞株可以使用已建立的细胞株，目前我国使用较多的是L-929（小鼠结缔组织成纤维细胞）和V-79（中国地鼠肺成纤维细胞）。
（2）培养基培养基及其血清浓度的含量应能适合所选择细胞株的生长，满足细胞生长的需要。
培养基内含抗生素的量应不引起细胞毒性，以免影响材料的评价，含血清和谷氨酰胺的培养基在2~8℃贮存不能超过一周，只含谷氨酰胺不含血清的培养基在2~8℃贮存不能超过一个月，培养基的pH值在7.2~7.4之间，所有培养用液都应是无菌的。
（3）样品的制备•试验样品的制备。
试验样品应选择材料本身或其浸提液进行。
试验材料应用最终产品。
制备材料浸提液的条件往往是夸大临床应用的条件来评价样品潜在的细胞毒性，但不能引起样品严重的变化（如溶解或其化学结构改变），浸提液应在制备后的24h内使用；固体材料应至少有一个平面使其利于在细胞层或琼脂层相接触，各种试验样品在试验时均应经无菌处理。
•阴性对照。
应是已知无细胞毒性的物质。
对于合成高分子材料，高密度聚乙烯较为适宜，牙科材料则可用氧化铝陶瓷作为阴性对照。
•阳性对照。
是已知的有一定细胞毒性的物质。
推荐含锡的聚氯乙烯作为固体材料或浸提液的阳性对照。
稀释苯酚亦可作为浸提液的阳性对照。
4 试验方法1)琼脂覆盖法•目的：本试验是为了评价医疗器械科浸提成分的急性细胞毒性。
•范围：本试验方法适用于固体（粉末，纤维状，金属），液体等试验材料。
•试验样品的制备。
试验样品：将试验样品制成100mm2的圆形，要求边缘光滑整齐。
液体材料用0.1mL的样品吸收在同面积的无菌滤纸片或纤维素上。
YBB60222012细胞毒性检查法
供试品厚度（mm） ≤0.5
＞0.5~1.0 ＞1.0
表面积或重量与浸提液体积的比例 6cm2/ml 3cm2/ml
1.25cm2/ml
不规则形状
0.2g/ml
表 2 浸提条件
浸提温度（℃）
浸提时间（小时）
37±1 37±1 50±2 70±2
24±2 72±2 72±2 24±2
检查法 第一法 相对增殖度法 阴性对照液 为不加供试品的细胞培养液。 阳性对照液 6.3％苯酚的细胞培养液 测定 取 33 个培养瓶，分别加入细胞悬液 1ml，细胞培养液 4ml，置 37℃±2℃，5％二氧 化碳的条件下培养 24 小时。培养 24 小时后弃去原培养液。 阴性对照组：取 13 个培养瓶加入 5ml 阴性对照液；阳性对照组：取 10 个培养瓶加入 5ml 阳性对照液；试验组：取 10 个培养瓶加入 5ml 含 50％供试液的细胞培养液，置 37℃±2℃，5％ 二氧化碳的条件下继续培养 7 天。
结果评价 生物毒性（细胞退化和畸变）按 0～4 级（见表 5）评价和分级。记录样品、阴
性、阳性细胞培养基的现象。如阴性对照为 0 级（无毒）、阳性对照不小于 3 级（中等毒），则
细胞培养基试验系统有效。若试验系统不成立，重复试验。样品不大于 2 级（轻微毒），则样品
判为合格。
365
分级 0 1 2 3 4
切成 0.5cm×2cm 条状，用湿热灭菌或紫外线照射消毒后，置玻璃容器内。除另有规定外，按表
1 加入氯化钠注射液或无血清培养基作为浸提液，使浸提液浸没供试品，按表 2 选择浸提条件（若
采用含血清培养基，应用 37℃±1℃、24 小时±2 小时的条件），浸提，即得。
表 1 供试品表面积或重量与浸提液的比例
细胞毒性检查法
附件细胞毒性检查法本法系将供试品或供试品液接触细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞的毒性作用。
试验用细胞推荐使用小鼠成纤维细胞L-929。
试验时采用传代48～72h生长旺盛的细1 相对增殖度法阴性对照液制备为不加供试品的细胞培养液。
阳性对照液制备取生物毒性阳性参比物质，照供试品制备项下的规定进行，如6.3%苯酚的细胞培养液。
检查法取33个培养瓶，分别加入4×104个/ml浓度细胞悬液1ml，细胞培养液4ml，置(37±1)℃，（5±1）%CO2的条件下培养24h。
培养24h后弃去原培养液。
阴性对照组：取13个培养瓶加入5ml阴性对照液；阳性对照组取10个培养瓶加入5ml根据各组细胞浓度按下式计算细胞相对增殖度（RGR）：100⨯=均值阴性对照组细胞浓度平组）细胞浓度平均值供试品组（或阳性对照RGR 结果评价 试验组相对增殖度（以第7天的细胞浓度计算）为0级或1级判为合格。
试验组相对增殖度为2级，应结合形态综合评价，轻微毒或无毒的判为合格。
试验组相对增殖度为3级～5级判为不合格。
2 琼脂扩散法供试品制备 将样品用纯化水冲洗干净（根据实际情况需要），用滤纸吸干。
若用供试品液进行试验，将制备的供试品液附着到生物惰性吸收性的基质﹙例如超细硼硅玻璃纤维滤纸﹚上，制成面积不少于100mm 2的圆形供试品。
阴性对照制备 取无生物毒性阴性参比物质，例如高密度聚乙烯。
按照供试品制备项下的规定进行。
阳性对照制备 取生物毒性阳性参比物质，例如含二乙基二硫代氨基甲酸锌的聚氨酯（ZDEC ）。
按照供试品制备项下的规定进行。
可采用10%二甲基亚砜(DMSO)溶液，附着到生物惰性吸收性（例如超细硼硅玻璃纤维滤纸）的基质上。
检查法取细胞悬浮液（1×105个/ml ）7ml ，均匀分散至直径60mm 的培养皿中。
置于含（5±1）%CO 2气体的细胞培养箱中培养24h 至近汇合单层细胞，弃去培养皿中培养基，将溶化琼脂冷却至48℃左右与含20%血清的2倍新鲜哺乳动物细胞培养基混合，使琼脂最终质量浓度不大于2%，在每只培养皿内加入新制备的含琼脂培养基（要足够薄以利于可沥滤物的扩散）。
细胞毒性试验方案
精品文档细胞毒性实验设计方案1.准备材料： DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素） DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45滤膜mμ灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头2.实验方案本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时2夹心二氧化硅中药物得以释放。
本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO-SS-HA/DOX）的细胞毒性。
实验组为SiO-SS-HA/DOX、SiO-SS-HA、DOX，222空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。
采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO-SS-HA/DOX、2SiO-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。
培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 2双抗(青霉素/链霉素)。
配制不同浓度的SiO-SS-HA/DOX、SiO、HA、DOX药物载22体培养基溶液。
(1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型:培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87%具体操作步骤：细胞的复活：①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。
②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。
（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。
）③将培养瓶放入培养箱中培养。
细胞的传代：将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。
①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。
②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口.精品文档用火烧。
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细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定
细胞毒T淋巴细胞 (CTL)活性测定是研究机体细胞免疫功 能的重要方法之一。传统的51 Cr释放法虽然有效 ,但也 存在某些不足。随着荧光标记、流式细胞分析和报告基 因等技术的广泛应用 ,促进了寻找灵敏可靠、简单易行 的非同位素法测定CTL活性的方法学研究。
LAK细胞并非是一个独立的淋巴群或亚群，而是NK细胞或T细 胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀 伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细 胞（lymphokine activated killer cells,LAK）。目前应用 LAK细胞过继免疫疗法（adoptive immunotherapy）与直接注 射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤，已获得一定的疗效。
NK细胞分离方法
• 密度梯度离心
Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心
• 磁化细胞分离器分离法
同位素释放法
同位素释放法
G0
Na2 51
G1
S
3 125 CrO4、 H-TdR、 I-UdR
New DNA Or Protein
cpm
试验孔cpm均值－自然释放孔 均值 cpm SI 最大释放孔cpm均值－自然释放孔 均值 cpm
1-3
4-6
7-9-1 cells+ 100ul 10% 1640 100ul YAC-1 cells+ 100ul spleen Cells 100ul YAC-1 cells+ 50ul spleen Cells + 50ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells + 75ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 100ul 1% NP-40 100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640
5%CO2 37℃培养 2小时
30l /孔 1mol/L柠檬酸
离心，取100ul上清移入新 孔， 37℃孵育10min
酶标仪测吸光度值：
OD570nm
加入底物 100ul/well 结果判定： 室温避光孵育15min
实验步骤
• 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣 碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩 余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 • 细胞计数： 1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中， 混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取 20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 2. 调脾细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml
• 因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的 CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析 和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素 测定法。
MTT（或MTS）还原法
本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细 胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进 入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后 比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可 计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便易行，无需预标靶细胞，与 51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。 MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定， 其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假 阳性结果。
1.2.1 PE-mAb/FITC-annexin V 荧光标记法 正常细胞的磷酯酰丝氨（PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡时翻转露于 膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。研究发现PS外翻为细胞凋亡的早 期事件，先于膜通透性增加所致51Cr或其他染料的释放。将效应细胞与 靶细胞充分共育后，用PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8PE）标记效应细胞（不能与PE-mABA结合的细胞即为靶细胞），再用 FITC-annexin V标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同 的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。本法①简单快捷，无需 预标记，直接将上二试剂加入测定管即可；②与51Cr法相关性好 （r=0.989），在早期时段更为灵敏，还可在进行分析，尤其适用于动力 学分析；③可允许效应细胞与靶细胞长时间共育，对探讨E通过合成及 分泌某些细胞因子（如TNF）而杀伤靶细胞的机理性研究特别有利；④ 可用荧光显微镜观察测定。
同位素释放法
• 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞， 当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏， 释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损 伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉 冲数 （cpm)，即可计算出NK细胞活性。
同位素释放法
NK细胞
攻击
Cr标记靶细胞
利用测Cr的放射脉 冲得效应细胞活性
培养YAC－1细胞 ＋10%FBS 1640培养液
操作流程
无菌取脾 研磨成单细胞悬液+2ml 1640
调细胞浓度 6 1×10 /ml
（无FBS)
加板(三复孔) 细胞计数 【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1640 混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝
调细胞浓度 7 1×10 /ml
(加法见附图)
细胞毒实验的分类、原理性 检测方法与应用
可健吉70090310 季敏70090312 李壮70090313
2011年11月
分类
原理
检测方法
应用
分类
细胞毒检测技术主要根据原理 不同进行区分
补体依赖细胞毒实验 细胞介导细胞毒实验 抗体依赖性细胞介导细胞毒实验（ADCC) 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定 淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测定
B
(E:T=100:1）
C
(E:T=50:1）
D
(E:T=25:1）
E
最大释放孔
F
最大释放对照孔
加 法板 方
G
培养基对照孔
200ul 10% 1640
SI=
B,C,D A 实验孔值-自然释放孔值 Max- S自发 ×100%
Max=E-F S自发=A-G
结果处理
算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐标 为E:T,纵坐标为SI值。 把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel作的图一起贴到实验记录本上。
淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测 定
肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
从肿瘤组织中分离到的淋巴细胞称为“肿瘤浸润性淋巴细胞” （TIL细胞），并发现这种细胞在体外经白细胞介素2刺激后可 大量增殖。这种刺激后增殖的TIL细胞又称之为“肿瘤来源的 激活细胞”。它具有比LAK细胞更强的特异的杀瘤活性。由于 其特异高效的杀瘤活性，在实验研究及临床应用中，已展现出 用于临床治疗肿瘤的良好前景。
1.1.2 Calcein-AM荧光扫描测定法 Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本 身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透 出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共充，再加Fluoro-Quench试剂 （一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶试剂，它对 细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液 中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞 对照孔（代表细胞100%存活）比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞%。 本法简便可靠，无南收集和转移培养上清，重复性高，变异性小，测定数 据自动输入计算机，适于大批量测定；可测CTL、LAK及NK细胞活性，还 可在光学显微镜或荧光显微镜下直接观察细胞。不足的是对某些高核浆比 的细胞染色效果不太好；Calce-in-AM在高浓度时可能损害细胞功能。
NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗
YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细
胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。 原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。
系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。
检测方法
• 血红蛋白酶释放法（HbE-Assay）
• 同位素释放法：
51Cr、125I-UdR
、3H-TdR 等
• 乳酸脱氢酶释放法 • MTT比色法 • 测定法
NK细胞介导的细胞毒试验
同位素释放法 乳酸脱氢酶释放法 MTT比色法
原理
NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫
死亡靶细胞 Cr释放
未死亡靶细胞
同位素释放法
• 本法结果准确、重复性好，但存在以下不足：
• ①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测 定仪器； • ②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而 影响结果判定； • ③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验。 • ④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进 行测定。
LDH底物：
2.
3. • 1.
室温避光保存15min。
取出，加入1mol/L柠檬酸， 30l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。