NK细胞毒活性
nk细胞检验标准
nk细胞检验标准NK细胞检验标准NK细胞是一种重要的免疫细胞，它能够识别并杀死病毒感染的细胞和癌细胞。
因此，检测NK细胞的数量和功能状态对于诊断和治疗某些疾病具有重要意义。
下面将介绍NK细胞检验的标准。
1. NK细胞数量检测NK细胞数量检测是通过流式细胞术或细胞计数器进行的。
正常人的NK细胞占外周血淋巴细胞的10%至15%。
如果NK细胞数量低于正常范围，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
2. NK细胞功能检测NK细胞功能检测是通过测量NK细胞的杀伤活性来进行的。
常用的方法是使用靶细胞，如K562细胞，来评估NK细胞的杀伤能力。
正常人的NK细胞杀伤活性应该在10%至50%之间。
如果NK细胞杀伤活性低于正常范围，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
3. NK细胞表面标志物检测NK细胞表面标志物检测是通过检测NK细胞表面的分子来评估NK 细胞的功能状态。
常用的标志物包括CD56、CD16、NKG2D等。
正常人的NK细胞应该表达这些标志物。
如果NK细胞表面标志物异常，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
4. NK细胞基因检测NK细胞基因检测是通过检测与NK细胞功能相关的基因来评估NK 细胞的功能状态。
常用的基因包括KIR、NKG2A等。
正常人的NK 细胞应该表达这些基因。
如果NK细胞基因异常，可能表明免疫功能受损，需要进一步检查。
NK细胞检验是评估免疫功能的重要方法之一。
通过检测NK细胞数量、功能、表面标志物和基因等指标，可以帮助医生诊断和治疗某些疾病，如感染、肿瘤等。
因此，对于需要进行免疫功能检查的患者，建议进行NK细胞检验。
免疫学检测技术及应用
划痕法
细胞因子的检测技术
一、 生物学检测技术 二、 免疫学检测技术 三、分子生物学检测技术
依赖细胞株测定法 ELISA法
分子杂交、PCR 等检测mRNA
细胞因子检测的特点
• 样品含量低 •样品具有时效性 •生物效应特异性差
Figure 14-12
细胞因子的功能
Cell activation
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA 合成含量。灵敏度高，具有放射性。 •四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性 MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使 其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性 差。
NK细胞表面标志无特异性表面标志1、CD562、CD16(FcRⅢ)3、
NK细胞的检测
1、CD56+、CD16+、CD3-
2、细胞毒实验
抗体分子
抗体——生物体最奇妙的分子
●无限的多样性（diversity) ●功能与结构的双重性
可变区——抗原结合 恒定区——生物学效应功能
●分泌型和膜型表达
与抗体有关的诺贝尔奖获得者
1901 1908
1972 1977 1984
1987
二、免疫球蛋白水解片段 Fab Fab
木瓜蛋白酶
木瓜蛋白酶
胃蛋白酶
胃蛋白酶
Fc
F(ab’)
pFc’
三、免疫球蛋白功能区
Ig分子的每条肽链可折叠为 几个球形的功能区，也称结构域， 每个结构域约由110个氨基酸组 成。
• 轻链有两个结构域：VL 和 CL。
• IgG、IgA和IgD均有VH 、 CH1、 CH2 、CH3四个结构域
细胞工程抗体——杂交瘤-单克隆抗体
•简介基因工程抗体
基因工程抗体
通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新
的抗体
基
小分子抗体
因
工
程
改
造
的
抗
体 鼠单抗人源化
基因工程方法研制新的单抗
抗体库技术
抗体库——在原核系统功能性表 达多样性抗体基因(repertoire)
通过多种选择手段筛选出特定性 能的抗体基因
铰 链 区
F 段 CH2 CH2
C
CH3 CH3
C端
1、重链和轻链
重链可分为μ、γ、α、δ、ε链；轻链可分为κ、λ型。
2、可变区和恒定区
（1）重链和轻链N端约110个氨基酸为可变区（variable region,V区)，V区存在3个高变区（hypervariable region,HVR1~3)及4个骨架区（framework region, FR1~4).三个 高变区共同组成Ig 的抗原识别部位，形成与抗原决定基互补 的表位。高变区也称互补决定区（complementaritydetermining region, CD1~3)。
NK细胞毒活性-LDH释放法
1只/组
2. YAC-1 1*105 * 2ml 3. 培养液（1640) 无FCS
5ml/ 组
3. 培养液(1640) 3%FCS
10ml/组
3. LDH底物
3ml/组
4. 柠檬酸（终止液）1ml/组
·3·
原理
免疫学实验
➢ NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞， 为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细 胞并列的第三类群淋巴细胞。 ➢ NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性 既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无 MHC限制。 ➢YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV) 感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测 NK细胞的杀伤活性。
·8·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，
不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内 释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮 酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还 原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形 成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利 用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
·7·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)， 即可计算出NK细胞活性。
NK免疫细胞
NK细胞(Natural Killer Cell)又称自然杀伤细胞。
属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，占外周血淋巴细胞总数的5％-10％，是机体重要的免疫细胞，具有广谱抗肿瘤细胞作用，其不依赖于抗原刺激作用，就可以非特异直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染的靶细胞，对肺癌、肝癌、卵巢癌、食道癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌、骨癌等均有效果，以NK细胞为中心的巨噬细胞，24小时加以监视，一旦发现癌细胞，就陆续加以清除。
特别是对造血细胞来源的肿瘤细胞更为敏感。
特别是对淋巴瘤和白血病细胞作用更为明显，因此，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用，是抗瘤免疫的第一线细胞，能迅速溶解某些肿瘤细胞。
人体的健康是由免疫系统来保证的，因此绝大多数的保健品都是为了提高机体免疫力的。
NK细胞作为免疫系统中最重要的效应杀伤细胞，就像免疫系统中的巡警，时刻游弋在人体的血液中，一旦遇到入侵体内的细菌、病毒和体内产生的癌变、病变、衰老细胞，便启动免疫攻击和免疫稳定功能，当自己无法独立完成攻击和清除任务，就会发出信号，调集其他类型的免疫细胞来共同完成清除任务。
·人体的健康是由免疫系统来保证的。
免疫系统被医学专家誉为世界上最好的医生，就像一支不知疲倦的部队，24小时保护着我们的健康。
·NK细胞作为先天免疫系统中最重要的效应细胞，是免疫系统在进化过程中所分化出的广谱性防御机制，对外清除病毒、细菌及其他有害物质，对内清除衰老、病变及癌变细胞,维护着我们机体的相对健康状态，被医学界誉为“人体第一道防线”。
·NK细胞平时像巡警一样游弋在人体的血液中，行使着免疫监视功能，当遇到癌变，疾病及衰老的细胞时，便启动免疫攻击和免疫稳定功能。
·NK细胞与我们的生活息息相关，它可以抑制病毒和细菌的入侵，清除体内癌变、病变及衰老细胞，具有延缓机体衰老的功能。
NK细胞功能在人生不同阶段呈现不同趋势和特征。
科学研究发现，在人的一生中，NK 细胞功能变化大致可分为五个阶段：（1）0-8周左右：出生到2月龄为NK细胞功能成熟期，在此阶段，NK细胞功能提升至与成年接近水平，表现为NK细胞在骨髓中分化成熟并释放入血，成为新生儿自身抵抗力的主要效应细胞。
NK细胞讲解
6
谢谢观看
2023/4/16
1. NK细胞的起源
2. NK细胞的识别和反应模式
3. NK细胞的调节作用
1. NK细胞的生物学功能：
NK细胞通过细胞毒杀、分泌细胞因子等多种方式参与非特异性免疫反应，对病原体感染和肿瘤等异常细胞具有重要作用。此外，NK细胞还可以与其他细胞相互作用，参与免疫调节、造血等生物学过程。
2. NK细胞在人类疾病中的作用：
In-depth analysis of NK cell function and characteristics - A comprehensive training to master NK cells.
2023/4/16 小胖作品
CONTENTS
1. 其他生物的免疫系统与人类免疫系统的差异
3. NK 细胞在病原体感染早期特别重要。NK 细胞对病原体感染的早期识别和清除非常重要，因为它们不需要进行病原体免疫学记忆，从而能够快速响应并抵御感染。同时，NK 细胞能够清除一些常见病原体，如病毒、细菌、寄生虫等，从而具有广泛的防御作用。
4. NK 细胞在免疫调节中也有重要作用。NK 细胞虽然不会直接参与体液和细胞免疫应答，但它们能够通过释放交互分子和调节蛋白，参与并调节免疫应答过程。例如，NK 细胞可以刺激和抑制抗原递呈细胞和其他免疫细胞的功能，从而影响整个免疫过程的进展和结果。
1.在 NK 细胞在感染和病原体清除中的作用方面，可以从以下几个方面进行深入阐述：
2. NK 细胞通过杀伤靶细胞来清除病原体。NK 细胞能够通过自身表面的受体识别感染或癌症细胞，并释放细胞毒素或引起细胞凋亡来杀死这些细胞。此外，NK 细胞还能够合作其他免疫细胞来清除病原体，如通过释放干扰素调节其它免疫细胞或参与细胞相关的适体应答等。
免疫细胞分离及NK活性测定
取对数生长期YAC- 细胞， Hanks液洗涤 取对数生长期YAC-1细胞， Hanks液洗涤2次，计数， 液洗涤2 计数， 调整至2 调整至2×105/ml。 /ml。
3、细胞毒试验： 细胞毒试验：
实验组 靶细胞 效应细胞 1640培养基 1640培养基 100µ 100µl 100µ 100µl － 靶细胞对照 效应细胞对 组 照组 100µ 100µl － 100µ 100µl － 100µ 100µl 100µ 100µl 空白组 － － 200µ 200µl
NK细胞代谢途径及其功能
NK 细胞代谢途径及其功能于雅婷 张建 （山东大学药学院免疫药物学研究所，济南 250012）中图分类号 R392.9 文献标志码 A 文章编号 1000-484X （2024）01-0021-10［摘要］ NK 细胞是固有免疫系统的重要成员，在免疫应答中发挥关键作用。
NK 细胞激活主要依赖于其表面表达的活化性受体和抑制性受体间的动态平衡。
然而，在许多慢性疾病模型中，NK 细胞受体表达失衡，导致杀伤活性及细胞因子产生能力降低，处于免疫失活状态。
近年许多研究表明，胞内代谢对包括NK 细胞在内的免疫细胞至关重要，代谢改变能够通过影响细胞发育、增殖和活性等调节免疫细胞效应功能发挥。
鉴于NK 细胞强大的抗肿瘤和抗病毒功能及其重要的临床应用价值，深入研究其代谢特征及机制具有重要意义。
本文主要从NK 细胞的代谢方式及其相关调控通路、代谢对NK 细胞发育、记忆和功能的调控作用以及基于代谢的NK 细胞疗法进行综述，阐述代谢对NK 细胞生物合成、体内稳定及效应功能的重要作用，以及不同慢性疾病模型中NK 细胞失活的代谢相关因素，为NK 细胞治疗的临床应用提供坚实的研究依据。
［关键词］ NK 细胞；免疫失活；代谢；细胞治疗Metabolism and function of NK cellsYU Yating ， ZHANG Jian. Institute of Immunopharmaceutical Sciences ， School of Pharmaceutical Sciences ， Shan⁃dong University ， Jinan 250012， China［Abstract ］ NK cells are important components of innate immune system and play a key role in immune responses. Activation of NK cells mainly depends on dynamic balance between activatory and inhibitory receptors expressed on surface. However ， in many chronic diseases ， balance between these receptors of NK cells is disorder ， resulting in reduced cytolysis activity and cytokine produc‐tion ， which is in a state of immune inactivation. In recent years ， many studies have shown that intracellular metabolism is crucial for immune cells such as NK cells ， and changes of metabolism will regulate functions of immune cells by affecting cell development ， pro‐liferation and activity. In view of powerful anti -tumor and anti -viral effects of NK cells and their important clinical application value ， it is important to study their metabolic characteristics and mechanisms. This review mainly introduces metabolic patterns of NK cell ，related regulatory pathways ， regulatory effects of metabolism on NK cell development ， memory and functions ， and metabolism -based NK cell therapy ， also expounds important role of metabolism on NK cell biosynthesis ， stability and effector function in vivo ， as well as metabolism -related factors involved in NK cell inactivation in different chronic diseases ， providing a solid research basis for clinical application of NK cell therapy.［Key words ］ NK cells ；Immune inactivation ；Metabolism ；Cell therapydoi ：10.3969/j.issn.1000-484X.2024.01.003基金项目：国家重点研发计划（2021YFC2300603）。
nk细胞
属于细胞生物学，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，细胞来源：NK细胞确切的来源还不十分清楚，一般认为直接从骨髓中衍生，其发育成熟依赖于骨髓的微环境。
小鼠和人的体外实验表明，胸腺细胞在体外IL-2等细胞因子存在条件下培养也可诱导出NK细胞。
小鼠脾脏在体内IL-3诱导下可促进NK细胞的分化。
NK细胞主要分布于外周血中，占PBMC 5~10%，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。
由于NK细胞具有部分T细胞分化抗原，如80~90%NK细胞CD2+，20~30%NK细胞CD3+(表达CD3ζ链)，30%NK细胞CD8+(α/α)和75~90%NK细胞CD38+，而且NK细胞具有IL-2中亲和性受体，在IL-2刺激下可发生增殖反应，活化NK细胞可产生IFN-γ，因此一般认为NK细胞与T细胞在发育上关系更为密切。
细胞功能自然杀伤活性：由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。
NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。
NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。
NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。
⒈识别靶细胞NK细胞识别靶细胞是非特异性的，这与CTL识别靶细胞机理不同，但确切的机理尚未明了。
现已知淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1) 与靶细胞表面的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的作用参与NK细胞的识别过程，抗LFA-1或抗ICAM-1 McAb可抑制NK细胞的杀伤活性。
此外CD2与LFA-3(CD58)结合以及CD56也可能介导NK细胞与靶细胞的结合。
NK细胞作用及效应机制
NK细胞作用及效应机制1 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）NK细胞低亲和力的CD16分子与靶细胞IgG抗体复合物结合后，活化蛋白酪氨酸激酶（PTK），使PLC γ的酪氨酸磷酸化，裂解膜磷酯酰肌醇为三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油，IP3增加细胞内游离钙浓度，进而释放细胞毒性物质（如穿孔素和颗粒酶）。
研究发现，IgG1抗体与凝集抗原作用能增强IgG1与NK细胞的结合，且去除岩藻糖的IgG1抗体更易募集和活化NK细胞，从而减少诱导ADCC所需的抗原量并且明显提高ADCC作用；当低岩藻糖抗体与靶细胞同时存在时，NK细胞尤其是CD56dim细胞群的活化标记CD69表达增高。
Forthal等报道在HIV急性感染期，病毒感染的靶细胞表达HIV糖蛋白与特异抗体结合，介导NK细胞发挥ADCC作用杀伤靶细胞。
另有研究者用HIVgp120特异的IgG1/IgA嵌合蛋白交联CD16，活化新鲜分离的NK细胞，只需pmol浓度即可溶解HIV感染的靶细胞。
2 天然细胞毒性（Natural cytotoxicity）天然细胞毒性是指不需要抗体介导,也不经预先致敏而直接杀伤靶细胞的作用,其具体机制尚未完全阐明。
与ADCC不同，该作用需要多个表面受体结合靶细胞传递溶细胞信号。
例如，CD11a/CD18、CD2、CD44、CD54、CD58、CD69均有利于NK细胞与靶细胞建立稳定连接,形成免疫突触。
在动物模型中，Lck、Fyn、ZAP70分子的缺失会引起T细胞缺陷，但却不影响天然细胞毒性，表明NK细胞发挥细胞毒性不一定需要这些激酶。
另有研究报道IFN γ和IL 12等细胞因子活化的STAT1分子提供了另一重要信号，STA T1敲除的小鼠天然细胞毒性被抑制，但不影响ADCC 作用。
Sconocchia等还发现一条不同于ADCC或传统天然细胞毒性的信号传导途径，即专一表达于NK细胞上的CD44依赖的溶细胞效应通路。
3 NK细胞介导的凋亡（NK cell mediated apoptosis）靶细胞对NK细胞诱导的凋亡很敏感，尤其大多数对自然杀伤不甚敏感的肿瘤细胞对NK细胞诱导的凋亡却很敏感。
nk细胞
NK细胞是天然免疫系统中一类十分重要的淋巴细胞，由于其杀伤作用是自发的，无需有抗体存在或预先加以致敏，因此将其命名为自然杀伤细胞。
它通过其细胞毒活性和产生淋巴因子，在机体抗感染、抗肿瘤、免疫调节和造血调控等方面发挥重要的免疫功能。
NK细胞和杀伤T细胞在清除病原生物感染靶细胞方面有着相似的功能，但NK细胞的杀伤功能属于天然免疫，病原生物侵人机体后数小时到数天就会遭到NK细胞的攻击，阻止其感染的扩散，同时NK细胞分泌的细胞因子，为杀伤T细胞的分化提供有利条件；而杀伤T 细胞从杀伤T细胞前体细胞诱导成熟为效应的杀伤T细胞需要一个应答过程，一般需1周以上，识别和杀伤具有特异性，免疫力维持时间也较长。
另外，在病毒感染过程中，病毒感染细胞产生的IFN－a和IFN－5可诱导NK细胞的活化，提高其杀伤功能。
在病毒感染初期，NK细胞主要通过自然杀伤来控制病毒的感染，在机体产生了针对病毒抗原的特异性抗体后，NK细胞还可通过ADCC 来杀伤感染的靶细胞，从而达到清除病毒的目的。
穿孔素是NK细胞杀伤病毒感染靶细胞的重要因素。
在病毒感染过程中，NK细胞可提供辅助B细胞免疫应答的细胞因子，尤其是针对胸腺非依赖抗原的应答。
NK细胞可产生多种趋化因子，参与白细胞趋化和炎前反应。
NK 细胞无论在血循环中或组织中均可参与控制肿瘤转移和阻抑转移肿瘤的生长。
NK细胞控制肿瘤生长及其转移主要是通过穿孔素依赖的机制，但也存在着穿孔素非依赖的机制。
NK细胞除具有抗感染和抗肿瘤免疫功能外，还参与机体的免疫调节和移植排斥反应。
NK细胞和K细胞的不同点1、数量不同K细胞占血液中淋巴细胞总数的5％～7％，NK细胞占血中淋巴细胞总数的2％～5％。
2。
免疫杀伤方式不同K细胞必须在抗体协助下才能具有免疫杀伤作用,NK细胞不需抗原激活,更不需抗体的协助,它可直接杀伤靶细胞。
3、细胞体积不同K细胞体积略大,是中型淋巴细胞,其直径约为9～12μm。
NK细胞是大淋巴细胞,平均直径为12～15μm,胞质较多,在胞质内有许多大小不等的嗜天青颗粒。
NKLAK细胞活性原理及操作步骤
NKLAK细胞活性原理及操作步骤自然杀伤细胞（nature killer cell，NK cell）是一类既不表达TCR，也不表达BCR的淋巴细胞。
来源于骨髓，属于固有免疫细胞。
NK细胞杀伤靶细胞体现MHC非限制性，是抗病毒感染和抗肿瘤免疫的第一道天然防线。
淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cell，LAK）是PBMC经体外IL-2培养后诱导产生的一类新型杀伤细胞，其杀伤肿瘤细胞不需抗原致敏，也无MHC限制性，其来源可能为NK细胞，临床上用于肿瘤和慢性病毒感染的非特异性免疫治疗。
51Cr释放试验1.原理效应细胞（NK或LAK细胞）和不同的51 Cr标记靶细胞按适当的效∶靶（E：T）比值进行混合，引起效应细胞对靶细胞的溶细胞作用。
通过检测上清中靶细胞内释放出的放射活性来判断NK或LAK细胞活性。
试验时必须同时设立仅有51 Cr标记靶细胞（无效应细胞）的自发释放管以及和含51 Cr标记靶细胞和Triton X-100最大释放管，从而确保检测活性的准确性。
2.材料（1）效应细胞：NK细胞、LAK细胞或通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从肝素抗凝血中分离获得的PBMC。
（2）靶细胞：推荐测定NK细胞活性的靶细胞株是K562。
K562是一种NK细胞敏感的慢性髓细胞性白血病细胞株；对于LAK细胞活性的测定，常用到对NK细胞抵抗，而对LAK细胞敏感的一种肿瘤靶细胞系，即Daudi细胞。
培养细胞使其处于对数生长期，进行细胞毒性检测的前一天，调整细胞浓度至2×105/ml。
（3）RPMI-10培养基。
（4）用PBS配制5%（v/v）Triton X-100。
（5）10ml圆底聚丙烯管。
（6）96微孔圆底微孔反应板。
（7）8通道微量移液器。
（8）含有H-1000B型转子的Sorvall RT-6000离心机。
（9）γ闪烁计数器和计数管。
3.操作步骤所有操作步骤必须在一个特定的有防护条件的指定为放射性核素使用的区域内进行，51 Cr的使用和处理必须遵循有关生物安全规则。
启动NK细胞细胞毒活性的自然细胞毒受体和协同受体
５０ ６
Ｊ Ｂ ｎ ｂ ｅ ｏ ｌＮｏ ｅ ｅ ０ ２， １２ Ｎｏ ６ ｅ ｇ ｕＭ ｄ Ｃ ｌ， ｖ ｍｂ ｒ２ ０ Ｖｏ ． ７， ．
・
［ 文章编号 】１０ —２ ０ ２０ ） ６０ ６ ．３ ０ ０２ ０ （０ ２ ０ ．５ ００
３ 非 一 Ｃ 限 制 的 特 异 性 启 动 ＮＫ 细 胞 活 化 的 表 面 分 子 ， 个 ＭＨ
即 ＮＫｐ６ ＞ ｐ ４和 ＮＫ ３ ， 些 分 子 具 有 严 格 的 Ｎ 细 胞 ４ 、￣ ４ ｐ０ 这 Ｋ
特异性 ， Ｎ 细胞 细胞 毒作 用 中起 关键 作用 ， 统 称 为 自 在 Ｋ 现 然 细 胞 毒 受 体 （ Ｃ ｓ 。 另 外 ， 究 还 表 明 一 种 新 近 发 现 的 Ｎ Ｒ） 研
同受体而发挥 作 用。本 文 拟就 Ｎ Ｒ Ｃ ｓ和 ２ ４的 研 究 进 展 作 Ｂ
一
综述 。
１ ＮＫｐ ａ６
１１ Ｎ ａ ． Ｋｐ ６的 基 １ 定 位 与 分 子 结 构 ＇ １
Ｐ ｓｉ ｅｓ ｏ等 … 用 分 子 ｎ
胞 的溶 解 活 性 极 低 。在 新 鲜 ＮＫ 细 胞 中 检 测 出 的 Ｎ ４ Ｋｐ ６弱
些个 体 的 ＮＫ 细 胞 只 有 弱 的 Ｎ ４ Ｋｐ ６表 达 。 进 一 步 研 究 发
现 ， 细胞克 隆的 Ｎ ４ ＮＫ Ｋｐ６表 型 与 其 自然 细 胞毒 活 性 之 问 有 精 确 的相 关 性 ， 表 达 Ｎ ４ 强 Ｋｐ ６的 Ｎ 细 胞 克 隆 可 有 效 地 溶 Ｋ 解 人 类 和小 鼠 肿 瘤 细 胞 ； 弱 表 达 ＮＫｐ６ 的 克 隆 对 肿 瘤 细 而 ４
化 的细 胞 ） 溶 解 中 ， 具 有 关 键 作 用 。 用 特 异 性 ｍＡｂ遮 蔽 的 均
NK细胞毒活性-LDH释放法
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
Or Protein
cpm
SI
试验孔cpm均值－自然释放孔 cpm均值 最大释放孔 cpm均值－自然释放孔 cpm均值
·7·
同位素释放法
免疫学实验
❖应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)， 即可计算出NK细胞活性。
50ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells +
75ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+
100ul 1% NP-40
100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640
4-6
G
200ul 10% 1640
培养基对照孔
B,C,D
A
SI=
实验孔值-自然释放孔值 Max- S自发
×100%
7-9 10-12 免疫学实验
加 板 方 法
Max=E-F S自发=A-G
·14·
结果处理
免疫学实验
算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐 标为E:T,纵坐标为SI值。
把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel作的图一起贴到实验记录本上。
·8·
乳酸脱氢酶释放法-原理
免疫学实验
乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，
不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内 释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮 酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还 原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形 成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利 用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。
NK细胞功能测定
操作方法
测定管：待测淋巴细胞0.5ml+靶细胞0.1ml+ RPMI1640 0.4ml
自然释放管：靶细胞0.1ml+ RPMI1640 0.9ml
最大释放管：靶细胞0.1ml+ 1%TritonX-100 0.9ml 上述样管放37℃，5%CO2培养18h,4000 rpm10min离心，吸取全部上清液。 见试剂盒说明。
结果判断
各管酶单位数 LDH(IU)=每分钟吸光值升高数*10080
细胞毒指数
细胞毒指数=（测定管酶单位数-自然释放管酶单位数）×100%
（最大管酶单位数-自然释放管酶单位数）
ห้องสมุดไป่ตู้ 注意事项
NK和靶细胞必须新鲜 严格控制NK细胞和靶细胞的比例 反应液要新鲜配制
方法学评价
测定NK细胞的活性主要有掺入法、释 放形态法、LDH法等。
用RPMI1640洗涤两次（2500rpm,10min）， 最后用10%小牛血清配成4*106/ml的效应细 胞。（加0.5ml小牛血清，即可） 靶细胞（肿瘤细胞）：消化细胞，洗涤细胞 两次（2500rpm,10min），最后用10%小牛 血清配成2*106/ml的效应细胞。（计数板数5 个中方格，总数为40个）
该法经济、快速、简便、准确、亦可 定量、无污染。
谢 谢！
NK细胞功能测定
原理
乳酸脱氢酶（LDH）存在于细胞浆中，当靶 细胞受到攻击时，细胞膜通透性增加，大量 的LDH释放到细胞外，释放的数量与受损程 度呈一定的相关性。LDH催化辅酶I由氧化型 转变为还原型，后者在340nm有一吸收峰， 而前者没有，根据吸光度上升量反应LDH量。
试剂与器材
培养液：RPMI1640 待测细胞：肝素抗凝血2ml，分离淋巴细胞，
NK细胞活性检测的原理及应用
NK细胞活性检测的原理及应用引言自然杀伤细胞（NK细胞）作为一种重要的免疫细胞，在机体的免疫防御中扮演着重要的角色。
NK细胞不仅可以杀死肿瘤细胞和感染病原体的细胞，还可以调节和激活其他免疫细胞的功能。
因此，研究NK细胞的活性对于预防和治疗肿瘤、感染疾病等免疫相关疾病具有重要的意义。
本文将详细介绍NK细胞活性检测的原理及其在临床和科研中的应用。
原理NK细胞的活性可以通过多种方法进行检测，其中最常用的方法是使用细胞毒性检测。
细胞毒性检测主要分为两种方法：靶细胞直接杀伤法和溶血/变性法。
靶细胞直接杀伤法靶细胞直接杀伤法是通过将靶细胞与NK细胞一起培养，观察并计算靶细胞的存活率来评估NK细胞的活性。
具体步骤如下： 1. 将靶细胞和NK细胞分别培养在细胞培养基中。
2. 将培养好的NK细胞与靶细胞按照不同的比例混合。
3. 经过一定时间的培养后，观察并计算靶细胞的存活率，即可评估NK细胞的杀伤活性。
溶血/变性法溶血/变性法是通过观察和测量NK细胞对溶血红细胞的溶血能力来评估NK细胞的活性。
具体步骤如下： 1. 准备一定浓度的溶血红细胞悬液。
2. 将溶血红细胞悬液与NK细胞按照不同的比例混合。
3. 经过一定时间的孵育，离心沉淀红细胞。
4. 通过测量上清液的吸光度来计算溶血率，即可评估NK细胞的杀伤活性。
应用NK细胞活性检测在临床和科研中都具有广泛的应用。
临床应用在临床中，检测患者的NK细胞活性可以帮助医生评估患者的免疫状态和疾病进展情况，从而制定更合理的治疗方案。
常见的临床应用包括： - 评估抗肿瘤免疫治疗的疗效：通过监测患者的NK细胞活性，可以评估抗肿瘤免疫治疗的疗效，指导治疗方案的调整。
- 检测传染病的免疫性：通过检测患者的NK细胞活性，可以评估患者对于传染病的免疫性，指导预防和治疗。
- 评估移植排斥反应：通过监测移植患者的NK细胞活性，可以评估移植排斥反应的发生和程度，指导治疗和预防。
科研应用在科研领域，NK细胞活性检测可以帮助研究人员深入了解NK细胞的免疫功能和机制，从而为免疫治疗的研发提供理论依据和实验数据。
NK细胞活性测定
（5）吸上清过120目或200目滤网，滤液滤入试管；
（6）滤液1500转/min离心5min，倒去上清；
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（7）脾细胞沉淀用Hanks液洗2次（加入3ml Hanks液，混匀，1500r/min，离心5min，倒去 上清；重复上述步骤1次）； （8）用1ml 1640培养液溶解脾细胞沉淀，混匀， 配成脾细胞悬液（原液），计数（吸取20ul加入 780ul白细胞稀释液中，稀释40倍，用血球计数 板在显微镜下计数，根据P53页公式计算脾细胞 悬液原液中脾细胞浓度）； （9）吸取一定量脾细胞悬液原液，用1640培养 液配制2×106/ml浓度的脾细胞悬液1毫升至2毫 升，待用。 3、细胞毒试验 按表7-3加样，
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4、孵育 二氧化碳培养箱孵育2小时； 加MTT，继续孵育2小时。 5、测OD值 轻轻吸弃上清，加二甲亚砜150ul ， 振荡5min，测OD值。 6、结果分析
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表7-3 MTT法测NK细胞活性试验各组成分(3复孔/组) 实验组 靶细胞 效应细胞 1640培养基 100ul 100ul
——
靶细胞对 照组 100ul
——
效应细胞 对照组
——
空白对照
—— ——
100ul 100ul
100ul
200ul
NK细胞活性（%）= （1实验组OD值 - 效应细胞对照组OD值 靶细胞对照组OD值
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）×100%
NK细胞活性（%）=
实验组OD值 - 效应细胞对照组OD值 （1靶细胞对照组OD值
）×100%
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9
附：P53细胞计数公式：
细胞浓度（细胞数/ml原液）=
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实 验 步 骤
细胞培养： 细胞培养： 1. 按图所示加板。 按图所示加板。
免疫学实验
2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%CO2培养箱 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于 ℃ 培养2小时 小时。 中，培养 小时。 LDH底物： 底物： 底物 1. 在培养 小后，1000rpm，离心 在培养2小后， 上清液移入新孔内， 小后 ，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每 ， 上清液移入新孔内 孔内加入LDH底物 100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。 孔内加入 底物 ，加完后轻轻搕板，使之混匀。 2. 室温避光保存15min。 。 室温避光保存 3. 取出，加入1mol/L柠檬酸， 30µl /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。 取出，加入 柠檬酸， µ 孔 酶标仪读数前保证没有气泡。 柠檬酸 结果测定： 结果测定： 1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。 结果测量：用酶标仪测定光密度值： 。记录结果。 2. 结果判定： 结果判定： 实验孔值-自然释放孔值 实验孔值 自然释放孔值 ×100% SI= Max- S自发
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免疫学实验
Excel 作 图
NK杀伤实验 50 40 30 SI 20 10 0 100:1 50:1 E：T 25:1
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免疫学实验
乳酸脱氢酶释放法
无色底物 靶细胞 YACYAC-1
NK
杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH底物 LDH 释放到细胞外
还 原
有色物质 测OD570值 杀伤率( 杀伤率 %)=
实验值-自发释放值 实验值 自发释放值 Max- S自发 ×100
最大释放均值（ 最大释放孔cpm均值 最大释放对照孔 均值-最大释放对照孔 最大释放均值（Max）=最大释放孔 ） 最大释放孔 均值 最大释放对照孔cpm均值 均值 自发释放均值（ 自发释放孔cpm均值 培养基对照孔 均值-培养基对照孔 自发释放均值（S自发）=自发释放孔 自发释放孔 均值 培养基对照孔cpm均值 均值
分组： 每组4人 1只小鼠 分组： 每组4
动物、细胞及试剂 动物、
无菌吸头（ 无菌吸头（大、中、小）3盒/room 盒
1. 小鼠 (NS,OVA) 2. YAC-1
1只/组 只组 1*106 * 2ml
3. 培养液（DMEM) 无FCS 培养液（ 4ml/ 组 4. 培养液(DMEM)10%FCS 培养液(DMEM)10%FCS 10ml/组 组 3. LDH底物 底物 3ml/组 组 4. 柠檬酸（终止液） 1ml/组 柠檬酸（终止液） 组
结果判定： 结果判定：
加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min 室温避光孵育
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免疫学实验
实验步骤
单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有 培养液的平皿内。 培养液的平皿内 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织， 其捣碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管 其捣碎。然后用 加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入 加样器隔着纱网将细胞悬液吸出 用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 2ml培养液冲洗 50ml离心管中 中，用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 ，常温离心 分钟 弃上清， 分钟， 培养液重悬细胞。 培养液重悬细胞 细胞计数： 细胞计数： 1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的 管中， 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出 ，加到盛有 计数液的EP管中， 计数液的 管中 混匀后取出20ul到一个新的 管中，再向其中加入 到一个新的EP管中 台盼蓝染料， 混匀后取出 到一个新的 管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀 台盼蓝染料 后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 计入到细胞计数版上， 后取 计入到细胞计数版上 在显微镜下计数，计数方法见后。 2. 调脾细胞浓度至 ×107/ml，每组所需总量为 调脾细胞浓度至1× ，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至 ×106/ml，每组需 细胞浓度至1× － 细胞浓度至 ，每组需2ml
免疫学实验 1-3 4-6 7-9 10-12
A
自然释放孔
100ul YAC-1 cells+ 100ul 10% 1640 100ul YAC-1 cells+ 100ul spleen Cells 100ul YAC-1 cells+ 50ul spleen Cells + 50ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells + 75ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 100ul 1% NP-40 100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640 200ul 10% 1640
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免疫学实验
操作流程
无菌取脾
研磨成单细胞悬液+2ml 1640 研磨成单细胞悬液 （无FBS)
培养YAC－1细胞 － 细胞 培养
＋10%FBS 1640培养液 培养液
调细胞浓度
1×106/ml ×
细胞计数 【?/ml】 】
细胞+980ul的1640 取20ul细胞 细胞 的 1W 混匀后取出20ul细胞 细胞+20ul台盼蓝 混匀后取出 细胞 台盼蓝
调细胞浓度
1×107 /ml ×
加板(三复孔) 加板 三复孔
(加法见附图) (加法见附图) 加法见附图
5%CO2 37℃培养 ℃
30µl /孔 1mol/L柠檬酸 µ 孔 柠檬酸
2小时 小时 离心， 离心，取100ul上清移入新 上清移入新 孔， 37℃孵育 ℃孵育10min
酶标仪测吸光度值： 酶标仪测吸光度值： OD570nm
免疫学实验
NK细胞毒检测 NK细胞毒检测
张 海 红 周艳 E-mail：zhanghh@ ： E-mail：julysec@ ：
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免疫学实验
主 要 内 容
实验分组及材料 实验原理 检测方法 主要操作步骤 结果判定
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免疫学实验
实验分组及材料
器材
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 75%酒精 酒精 无菌纱网 无菌平皿 无菌96孔培养板 无菌 孔培养板 可调微量加样器 细胞计数板 显微镜 EP管 管 若干 1块/组 块组 1块/组 块组 1块/组 块组 1套/组 套组 1套/组 套组 1台/组 台组 若干 1套/ 组 套 1台/room 台 1台 台 2个/room 个 1台/组 台组
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免疫学实验
乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法-原理 乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下， 存在于细胞内，正常情况下， 乳酸脱氢酶
不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时， 不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内 可从细胞内 释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮 释放至培养液中。释放出来的 在催化乳酸生成丙酮 酸的过程中，使氧化型辅酶 酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶 变成还原型辅酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐 ，后者再通过递氢体 吩嗪二甲酯硫酸盐 吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还 还 原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝 或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形 原碘硝基氯化氮唑蓝 或硝基氯化四氮唑蓝 形 成有色的甲基化合物， 波长处有一吸收峰， 成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利 波长处有一吸收峰 用读取的Ａ 用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。 可测得杀伤细胞毒活性。
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免疫学实验
同位素释放法
G0
G1
S
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
New DNA Or Protein
cpm
试验孔 cpm 均值－自然释放孔 cpm 均值 SI = 最大释放孔 cpm 均值－自然释放孔 cpm 均值
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免疫学实验同位素释放法来自应用放射性同位素（ 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 ）标记靶细胞， 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 细胞攻击， 细胞受到 细胞攻击 靶细胞被破坏， 51Cr。51Cr辐射 射线，通过测定受损伤或死亡 辐射γ射线 。 辐射 射线， 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)， 的放射脉冲数 ， 即可计算出NK细胞活性。 细胞活性。 即可计算出 细胞活性
10. 眼科剪、小镊子 眼科剪、 11. 细胞培养箱 12. 酶标仪 13. 离心机 14. 超净台
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免疫学实验
原 理
NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞， （ 细胞属非特异性免疫细胞， 为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与 、 细 为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细 胞并列的第三类群淋巴细胞。 胞并列的第三类群淋巴细胞。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性 细胞可非特异直接杀伤靶细胞， 细胞可非特异直接杀伤靶细胞 既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与， 既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无 MHC限制。 限制。 限制 YAC-1细胞为 细胞为Moloney鼠科白血病毒 鼠科白血病毒(Mo-MuLV) 细胞为 鼠科白血病毒 感染的鼠T淋巴瘤细胞， 细胞敏感， 感染的鼠 淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测 淋巴瘤细胞 细胞敏感 NK细胞的杀伤活性。 细胞的杀伤活性。 细胞的杀伤活性