NK细胞毒活性

10. 眼科剪、小镊子 眼科剪、 11. 细胞培养箱 12. 酶标仪 13. 离心机 14. 超净台
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免疫学实验
原 理
NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞， （ 细胞属非特异性免疫细胞， 为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与 、 细 为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细 胞并列的第三类群淋巴细胞。 胞并列的第三类群淋巴细胞。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性 细胞可非特异直接杀伤靶细胞， 细胞可非特异直接杀伤靶细胞 既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与， 既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无 MHC限制。 限制。 限制 YAC-1细胞为 细胞为Moloney鼠科白血病毒 鼠科白血病毒(Mo-MuLV) 细胞为 鼠科白血病毒 感染的鼠T淋巴瘤细胞， 细胞敏感， 感染的鼠 淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测 淋巴瘤细胞 细胞敏感 NK细胞的杀伤活性。 细胞的杀伤活性。 细胞的杀伤活性
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免疫学实验
乳酸脱氢酶释放法
无色底物 靶细胞 YACYAC-1
NK
杀伤
靶细胞 膜损伤
LDH底物 LDH 释放到细胞外
还 原
有色物质 测OD570值 杀伤率( 杀伤率 %)=
实验值-自发释放值 实验值 自发释放值 Max- S自发 ×100
最大释放均值（ 最大释放孔cpm均值 最大释放对照孔 均值-最大释放对照孔 最大释放均值（Max）=最大释放孔 ） 最大释放孔 均值 最大释放对照孔cpm均值 均值 自发释放均值（ 自发释放孔cpm均值 培养基对照孔 均值-培养基对照孔 自发释放均值（S自发）=自发释放孔 自发释放孔 均值 培养基对照孔cpm均值 均值
注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。 注意 在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。 在稀释前一定将原细胞悬液混匀
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实 验 步 骤
细胞培养： 细胞培养： 1. 按图所示加板。 按图所示加板。
免疫学实验
2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%CO2培养箱 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于 ℃ 培养2小时 小时。 中，培养 小时。 LDH底物： 底物： 底物 1. 在培养 小后，1000rpm，离心 在培养2小后， 上清液移入新孔内， 小后 ，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每 ， 上清液移入新孔内 孔内加入LDH底物 100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。 孔内加入 底物 ，加完后轻轻搕板，使之混匀。 2. 室温避光保存15min。 。 室温避光保存 3. 取出，加入1mol/L柠檬酸， 30µl /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。 取出，加入 柠檬酸， µ 孔 酶标仪读数前保证没有气泡。 柠檬酸 结果测定： 结果测定： 1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。 结果测量：用酶标仪测定光密度值： 。记录结果。 2. 结果判定： 结果判定： 实验孔值-自然释放孔值 实验孔值 自然释放孔值 ×100% SI= Max- S自发
分组： 每组4人 1只小鼠 分组： 每组4
动物、细胞及试剂 动物、
无菌吸头（ 无菌吸头（大、中、小）3盒/room 盒
1. 小鼠 (NS,OVA) 2. YAC-1
1只/组 只组 1*106 * 2ml
3. 培养液（DMEM) 无FCS 培养液（ 4ml/ 组 4. 培养液(DMEM)10%FCS 培养液(DMEM)10%FCS 10ml/组 组 3. LDH底物 底物 3ml/组 组 4. 柠檬酸（终止液） 1ml/组 柠檬酸（终止液） 组
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免疫学实验
操作流程
无菌取脾
研磨成单细胞悬液+2ml 1640 研磨成单细胞悬液 （无FBS)
培养YAC－1细胞 － 细胞 培养
＋10%FBS 1640培养液 培养液
调细胞浓度
1×106/ml ×
细胞计数 【?/ml】 】
细胞+980ul的1640 取20ul细胞 细胞 的 1W 混匀后取出20ul细胞 细胞+20ul台盼蓝 混匀后取出 细胞 台盼蓝
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免疫学实验
Excel 作 图
NK杀伤实验 50 40 30 SI 20 10 0 100:1 50:1 E：T 25:1
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调细胞浓度
1×107 /ml ×
加板(三复孔) 加板 三复孔
(加法见附图) (加法见附图) 加法见附图
5%CO2 37℃培养 ℃
30µl /孔 1mol/L柠檬酸 µ 孔 柠檬酸
2小时 小时 离心， 离心，取100ul上清移入新 上清移入新 孔， 37℃孵育 ℃孵育10min
酶标仪测吸光度值： 酶标仪测吸光度值： OD570nm
免疫源自文库实验
NK细胞毒检测 NK细胞毒检测
张 海 红 周艳 E-mail：zhanghh@jlu.edu.cn ： E-mail：julysec@jlu.edu.cn ：
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免疫学实验
主 要 内 容
实验分组及材料 实验原理 检测方法 主要操作步骤 结果判定
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免疫学实验
实验分组及材料
器材
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 75%酒精 酒精 无菌纱网 无菌平皿 无菌96孔培养板 无菌 孔培养板 可调微量加样器 细胞计数板 显微镜 EP管 管 若干 1块/组 块组 1块/组 块组 1块/组 块组 1套/组 套组 1套/组 套组 1台/组 台组 若干 1套/ 组 套 1台/room 台 1台 台 2个/room 个 1台/组 台组
免疫学实验 1-3 4-6 7-9 10-12
A
自然释放孔
100ul YAC-1 cells+ 100ul 10% 1640 100ul YAC-1 cells+ 100ul spleen Cells 100ul YAC-1 cells+ 50ul spleen Cells + 50ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells + 75ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 100ul 1% NP-40 100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640 200ul 10% 1640
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免疫学实验
NK细胞分离方法 NK细胞分离方法
密度梯度离心 Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心 密度梯度离心 磁化细胞分离器分离法
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免疫学实验
常用的检测方法
同位素释放法： 同位素释放法：
51Cr、3H-TdR、125I-UdR 、 、
乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用 本次实验采用) 本次实验采用
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免疫学实验
同位素释放法
G0
G1
S
Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR
New DNA Or Protein
cpm
试验孔 cpm 均值－自然释放孔 cpm 均值 SI = 最大释放孔 cpm 均值－自然释放孔 cpm 均值
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免疫学实验
同位素释放法
应用放射性同位素（ 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶 ）标记靶细胞， 细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出 细胞攻击， 细胞受到 细胞攻击 靶细胞被破坏， 51Cr。51Cr辐射 射线，通过测定受损伤或死亡 辐射γ射线 。 辐射 射线， 靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)， 的放射脉冲数 ， 即可计算出NK细胞活性。 细胞活性。 即可计算出 细胞活性
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免疫学实验
乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法-原理 乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下， 存在于细胞内，正常情况下， 乳酸脱氢酶
不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时， 不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内 可从细胞内 释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮 释放至培养液中。释放出来的 在催化乳酸生成丙酮 酸的过程中，使氧化型辅酶 酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶 变成还原型辅酶 (NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐 ，后者再通过递氢体 吩嗪二甲酯硫酸盐 吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还 还 原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝 或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形 原碘硝基氯化氮唑蓝 或硝基氯化四氮唑蓝 形 成有色的甲基化合物， 波长处有一吸收峰， 成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利 波长处有一吸收峰 用读取的Ａ 用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。 可测得杀伤细胞毒活性。
Max （ 靶细胞最大释放）=最大释放孔均值 最大释放对照孔均值 靶细胞最大释放） 最大释放孔均值 最大释放孔均值-最大释放对照孔均值 S自发 （靶细胞自发释放） =自发释放孔均值 培养基对照孔均值 靶细胞自发释放） 自发释放孔均值 自发释放孔均值-培养基对照孔均值 注： S自发 ＜0，做“0”处理 ， 处理 ·13·
孔
B
(E:T=100:1） ）
C
(E:T=50:1） ）
加 板 方 法
D
(E:T=25:1） ）
E
释放孔
F
释放 孔
G
SI=
B,C,D A 孔 -自然释放孔 自然释放孔 Max- S自
Max=E-F
100%
S自 =A-G
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免疫学实验
结 果 处 理
算出不同E:T时的 值，用Excel作图，横坐 时的SI值 作图， 算出不同 时的 作图 标为E:T,纵坐标为 值。 纵坐标为SI值 标为 纵坐标为 把用酶标仪读出的原始数据（每人一份） 把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel作的图一起贴到实验记录本上。 作的图一起贴到实验记录本上。 作的图一起贴到实验记录本上 要对结果进行分析，写出影响结果的因素， 要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及 注意事项。 注意事项。
结果判定： 结果判定：
加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min 室温避光孵育
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免疫学实验
实验步骤
单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有 培养液的平皿内。 培养液的平皿内 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织， 其捣碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管 其捣碎。然后用 加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入 加样器隔着纱网将细胞悬液吸出 用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 2ml培养液冲洗 50ml离心管中 中，用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 ，常温离心 分钟 弃上清， 分钟， 培养液重悬细胞。 培养液重悬细胞 细胞计数： 细胞计数： 1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的 管中， 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出 ，加到盛有 计数液的EP管中， 计数液的 管中 混匀后取出20ul到一个新的 管中，再向其中加入 到一个新的EP管中 台盼蓝染料， 混匀后取出 到一个新的 管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀 台盼蓝染料 后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 计入到细胞计数版上， 后取 计入到细胞计数版上 在显微镜下计数，计数方法见后。 2. 调脾细胞浓度至 ×107/ml，每组所需总量为 调脾细胞浓度至1× ，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至 ×106/ml，每组需 细胞浓度至1× － 细胞浓度至 ，每组需2ml