核酸标记方法
青岛农业大学
核酸化学结课论文
题目: 核酸的各种标记方法的优缺点比较学院: 生命科学学院
班级: 生物技术1003班
姓名: 陈冠旭
学号: 20105491
指导老师：高龄
2014/5/5
摘要
本文综述了几种常用的DNA/RNA遗传标记及其在遗传多样性研究中的应用。几种标记方法各有其优缺点, 都能从某个角度反映生物的某些遗传特性, 在
科研中应根据研究目的和背景选用恰当的标记方法, 或不同的标记联合使用, 以
获得全面的信息。
关键词：DNA探针，RNA探针，优缺点
正文
核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性
标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。
一、双链DNA探针及其标记方法
分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因
的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平
移法和随机引物合成法。
1. 切口平移法(nick translation) 当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'
的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在
切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先
无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片
段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性
取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的
用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑
制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
2. 随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,
在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。
利用随机引物进行反应的优点是：
(1)Klenow片段没有5'→3'外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。
(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。
(3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。
(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。
二、单链DNA探针
用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时,探针序列与被检测序列间有很多
错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。单链DNA探针的合成方法
主要有下列两种:
(1) 以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针;
(2) 以RNA为模板, 用反转录酶合成单链cDNA探针。
1. 从M13载体衍生序列合成单链DNA探针合成单链DNA探针可将模板序列
克隆到噬粒或M13噬菌体载体中,以此为模板,以特定的通用引物或以人工合成
的寡合苷酸为引物, 在[a-32P]-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射标记
探针，反应完毕后得到部分双链分子。在克隆序列内或下游用限制性内切酶切
割这些长短不一的产物,然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将
探针与模板分离开。双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备,选用适当
的引物即可制备正链或负链单链探针。
2. 从RNA合成单链cDNA探针 cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相
应的基因。用RNA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种:
(1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针。本方法只能用于带Poly(A)的mRNA,并
且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列。
(2) 可用随机引物合成cDNA探针。该法可避免上述缺点,产生比活性较高的探针。但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探针的序列往往比
以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多, 应预先尽量富集mRNA中的目的序列。反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段,经Sephadex G-50柱层析即可得到单链探针。
三、末端标记DNA探针
1、利用本方法可对DNA分子量标准进行标记，利用它可定位因片段太小而无
法在凝胶中观察的DNA片段。
2、对DNA的纯度不很严格，少量制备的质粒也可进行末端标记合成探针。
3、末端标记还有其他的一些方法，如利用T4多核苷酸激酶标记脱磷的5'端突
出的DNA和平末端凹缺DNA分子，也可利用该酶进行交换反应标记5'末端。
四、寡核苷酸探针
利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷
酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针和许多简并性寡核苷酸探针组
成的寡核苷酸探针库。单一已知序列寡核苷酸探针能与它们的目的序列准确配
对,可以准确地设计杂交条件,以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交,对于一些未知序列的目的片段则无效。
五、各种m iRNA标记方法的优缺点及适用条件
总结
每种遗传标记都能反映生物遗传特性的某些方面, 都各有其优缺点和适用范围。在实际应用中相互结合、相互补充, 采用各种不同的遗传标记研究生物的遗传结构和控制机制, 才能从各个角度揭示生物的遗传本质以及遗传结构和功能的内在联系, 更深入全面地了解与我们的生存密切相关的生物世界, 更好地保护生物资源。
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生物素标记EMSA探针-AP1
生物素标记EMSA探针－AP1 产品简介： 生物素标记EMSA探针－AP1是用于EMSA(也称gel shift)研究的并经生物素(Biotin)标记的AP1 consensus oligonucleotide。 这个生物素标记的双链寡核苷酸含有公认的AP1结合位点，可以用作EMSA研究时的探针。 AP1 consensus oligo的序列如下： 5’-CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA-3’ 3’-GCG AAC TAC TGA GTC GGC CTT-5’ 本生物素标记EMSA探针已经过纯化，可以直接用于EMSA结合反应。 本生物素标记EMSA探针可以和碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)配套使用。 一个包装的生物素标记探针可以进行约200-400个样品的EMSA检测。 保存条件： -20℃保存，一年有效。 注意事项： 避免加热到40℃以上，温度过高会导致双链DNA探针解聚成单链。而单链无法用于EMSA研究。 对于基于生物素标记的EMSA检测的详细操作可以参考碧云天的化学发光法EMSA试剂盒(GS009)的使用说明。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.本生物素标记EMSA探针用于EMSA结合反应时，参考如下步骤进行： A.如下设置EMSA结合反应： 阴性对照反应： Nuclease-Free Water 7-7.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 0μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 探针冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 未标记的探针 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl Super-shift反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 目的蛋白特异抗体 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 样品反应： Nuclease-Free Water 5-5.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl 突变探针的冷竞争反应： Nuclease-Free Water 4-4.5μl EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) 2μl 细胞核蛋白或纯化的转录因子 2μl 未标记的突变探针 1μl 生物素标记探针 0.5-1μl 总体积 10μl
DNA3’端生物素标记
1、准备工作： A、取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。 B、取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。如果待标记的EMSA探针为双链， 95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA探针转变为单链的探针，然后同样用水稀 释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA 探针浓度为0.5μM。 2、DNA探针的标记： Ultrapure water 29μl TdT Buffer(5X) 10μl 待标记探针(1μM) 5μl Biotin-11-dUTP(5μM) 5μl TdT(10U/μl) 1μl 总体积 50μl A、参考上述设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。 B、用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37℃孵育30分钟。 C、加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。 3、TdT的去除： A、探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。 B、12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。 4、探针的纯化(选做)： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。 如需纯化，可以按照如下步骤操作： A、对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。 B、-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。 C、4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。 D、4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 E、加入50μl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20℃保存。 5、生物素标记探针标记效率的检测： A、取5μl Biotin-Control Oligo(0.4μM)，加入196μl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 B、取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27μl TE，混匀，稀释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。 C、参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。对于经过
生物素标记试剂盒使用说明书
生物素标记试剂盒 使用说明书 货号: EBLK0002
产品介绍： Elabscience生物素标记试剂盒提供了生物素标记所需全部试剂，用于含有氨基（NH2-）抗体的标记。生物素已经活化，可直接使用，每个试剂盒足以完成3次标记，每次可标记0.2-2mg。试剂盒中包括6个用于抗体标记脱盐的Filtration tube，不用透析，操作简便，熟练操作90min可完成整个标记过程。 产品特点： 试剂全面:本试剂盒提供了生物素标记所需全部试剂。 快速:整个过程仅需90min。 方便:通过Filtration tube即可脱盐，无需透析或者凝胶过滤。 使用灵活:既可用于微量标记又可大量标记，每次可标记0.2-2mg。 理想的标记效果:已经优化确定了最适的标记比例，降低标记不足或由于过度标记而失活的可能性。 产品组成： 标记过程需要仪器： 1. 10ul，50ul，200ul，1000ul可调高精度移液器 2. 恒温箱（37℃） 3. 离心机（离心力可达到12,000×g） 储存条件： 本试剂盒未开封前在2-8℃可稳定保存一年
生物素标记反应原理： NH2-Reactive Biotin专一地与伯胺反应（N-末端及赖氨酸残基侧链）形成稳定的酰胺键 生物素标记NH 2 -Reactive Biotin使用量的计算： 每个反应中生物素试剂的使用量取决于待标记蛋白质的量和浓度。通过优化，我们确定了标记2mg/ml的抗体（IgG ，150KD），使用生物素和抗体的分子比为20:1能达到较理想的标记效果。 1、标记2mg/ml的抗体，使用生物素和抗体的分子比为20:1时，应加入生物素量的计算方 法： ml蛋白×2mg蛋白 ml蛋白×1mmolIgG 150,000mgIgG ×20mmol生物素 mmol蛋白 = mmol生物素 2、对于10mmol的生物素溶液，应加入反应中该生物素体积的计算方法： mmol生物素×1,000,000μL L ×L 10mmol = ul生物素 计算示例： 对于0.5ml 2mg/ml的IgG（分子量为150,000）溶液，需加入10mM的生物素溶液13.3ul。 0.5ml IgG×2mgIgG 1mLIgG ×1mmolIgG 150,000mgIgG ×20mmol生物素 1mmolIgG =0.000133mmol生物素 0.000133mmol生物素×1,000,000μl L ×L 10mmol =13.3ul生物素溶液 操作过程： 实验前准备： 1.仔细阅读使用说明书。 2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。 3.提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的NH2- Reactive Biotin 继续放置冰箱中）。
34抗体的标记——生物素(Biotin)
抗体/蛋白的生物素（Biotin）标记 一般每个抗体可以标记3～5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。 蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。 SOP35 抗体/蛋白的生物素（Biotin）标记 1. 抗体/蛋白的前处理： 1.1 选择适当截留的超滤柱中加入400μl 标记反应溶液（0.1M PBS pH 7.2），加入1mg抗体，混匀。 1.2 4℃，6,000rpm，离心2min，弃滤液；于超滤柱中再加入200μl标记反应溶液，混匀。4℃，6,000rpm，离心2min， 1.3 重复步骤1.2 6～7次。 1.4 混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min；将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，6,000rpm，2min，收集液体。 1.5 取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。倒置超滤柱，4℃，6,000rpm，2min，收集液体。 1.6 步骤1.4 与步骤1.5 的收集的滤液合并，用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml，4℃放置备用。 2. 生物素的标记： 2.1 将生物素溶解在合适的溶剂中（请参照所选购生物素的说明书，不同的生物素其溶剂不同），浓度为20mg/ml,按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入抗体溶液，室温反应1h。 2.2 葡聚糖凝胶分离纯化/透析袋或者超滤管去除游离生物素及其他试剂。 2.3 将抗体保存于合适的抗体保存液。 进行抗体标记的时候，需要对抗体性质、交联剂和标记物的性质非常了解，否则很难标记出高品质的抗体；标记量低，导致信号值低；标记量太高，不但容易造成背景，并且还容易由于标记物的聚集造成信号拮抗，反而降低或者淬灭信号值。标记物的种类繁多，不同类型的标记物其性质完全不一样，标记物很难选择和把握，建议初学者使用专业化的试剂盒进行标记，或者直接委托专业化公司标记。福因德生物提供以下抗体标记相关产品，同时可以提供抗体/蛋白标记服务。
生物素标记抗体的免疫荧光方法
生物素标记抗体的免疫荧光方法 *重要提示：在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用（APPLICATIONS）部分，确认这支抗体已经验证过可用于你计划采用的本实验方法中的特定方案。 A.所需溶液和试剂 注意：用Milli-Q超纯水或是相当级别的水配制溶液。 1.10 X磷酸盐缓冲液(PBS): 1升水中加入80 g 氯化钠(NaCl), 2 g 氯化钾(KCl), 14.4 g 磷 酸氢二钠(Na2HPO4) and 2.4 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)。调整pH到7.4。 2.甲醛溶液，16%，无甲醇的类型，Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。开封 以后放在4°C避光保存。使用时用PBS稀释。 3.二甲苯 4.无水乙醇，组织学级，100%和95%。 5.蒸馏水(dH2O) 6.封闭缓冲液：配制25ml时，2.5 ml 10X PBS和1.25ml正常血清（来源与二抗相同， 例如正常山羊血清，正常驴血清）兑到21.25ml的蒸馏水中，混匀。边搅拌边加入75μL Triton X-100(100%) 7.抗体稀释缓冲液配置40ml时，取4 ml 10X PBS兑入36 ml蒸馏水，混匀。加入0.4 BSA，使溶解。边搅拌边加入120μL Triton X-100(100%)。 8.10 mM 柠檬酸钠缓冲液配置1L时，称取2.94g二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7?2H2O) 溶解在1L蒸馏水中。调整pH为6.0。 9.荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin 注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低 11.Prolong? Gold 抗淬灭试剂(Invitrogen, Eugene, OR, Cat# P36930) B.样品制备 I.细胞系培养物来源(IF-IC) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-IC。 注意：细胞应直接在多孔板，腔室玻片或是盖玻片上直接培养，处理，固定和染色。 1.用PBS稍加润洗。 2.吸去PBS，将细胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（PBS配制）中。 注意：甲醛有毒，需要在通风橱中操作。 3.室温下固定细胞15分钟。 4.吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟。 5.甲醇打孔步骤（是否需要参考抗体说明首页）在甲醛固定后，将细胞浸泡在冰纯甲 醇中（加入足量甲醇完全盖住细胞，液层厚度在3-5mm，千万别让细胞干掉），–20°C 孵育10分钟。用PBS润洗5分钟。 6.继续C部分的免疫染色。 II.石蜡切片(IF-P) 重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。 脱蜡处理/再水化 1.用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。 2.用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。 3.用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟 4.在蒸馏水中润湿2次，每次5分钟。 抗原暴露：
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、 生物素标记 抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。 一、酶标记 1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml)，混匀。 (4)称取Sephadex
G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。 (5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。 (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。 (7)酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量(mg/ml)=OD403×0.4 IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62 克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效
生物素标记
生物素标记 1,向皿中加入2ml 1mg/ml的生物素试剂。 2,4℃，温和shaking30min，孵育后有一些细胞会悬浮起来，转移这些细胞至离心管中，离心收集细胞，并按下面方法洗涤细胞。 3，用2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+，100Mm Glycine的PBS清洗细胞2次，这时也会有一些细胞悬浮起来，转移它们到一个离心管，离心收集细胞。 4，加2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+的PBS到皿中。 5，4℃，45min停止未反应的生物素试剂的反应。（使生物素试剂失活），并收集浮起来的细胞，离心收集细胞。 6，收集细胞：将皿中的细胞和浮起来的细胞转移进入一个1.5ml的离心管。 7，向1.5ml的离心管中加入1ml RIPA/lysis buffer。（含蛋白酶抑制剂1table /50ml）8，4℃涡旋1h。 9,20000g,10min,4℃,以沉淀核酸与其他残渣。 10，把上清转入新的EP管，（这是总蛋白，T，一般情况下浓度应该在1-5mg/ml，可以用B radford method来测定浓度，并调整全部样品至同一浓度） 11，向300ul pre-cleared sample中加入300ul含50% slurry-Avidin beads的PBS,P I孵育。（PI，蛋白酶抑制剂，的工作浓度0.1-1mM，17-174ug/ml） 12，室温涡旋1h。（使生物素和亲和素充分结合） 13，离心除去beads，将上清转移至一新离心管中。（这是位结合的蛋白质，浓度相对于总蛋白被稀释了1.5倍。） 14，向beads中加入150ul 2×Laemmli buffer来将beads上的蛋白质洗掉。（洗下来的蛋白浓度是总蛋白浓度的2倍）
生物素标记cRNA的纯化
生物素标记cRNA的纯化、定量及检测 实验材料 已纯化好的Double-Stranded cDNA。 实验步骤 1. 体外转录合成生物素标记cRNA 使用Affmetrix IVT Labeling Kit，按操作说明进行: 1) 取0.2 ml EP管，加入纯化后12ul Double-Stranded cDNA。 2) 室温下，按照表1依次加入下列组分，轻弹管壁使其充分混匀，瞬时离心(约5 sec)收集溶液于管底。 3) 37℃温育16h，之后进行下一步。 2. 生物素标记cRNA纯化、定量和检测 1) cRNA纯化 a. 加60ul RNase-free Water到IVT反应体系中，漩涡3 sec混匀。 b. 加350 ul IVT cRNA Binding Buffer到样品中，漩涡3 sec混匀。 c. 加250ul无水乙醇到混合物中，移液器吹打充分混匀。 d. 将700 ul混合液转移到IVT cRNA Cleanup Spin Column(置于2ml Collection Tube内)中，大于等于8000 g离心15 sec，弃滤液和Collection Tube。 e. 将Spin Column转移至新的2 ml Collection Tube中，加500 ul IVTcRNA Wash Buffer 到Spin Column中，大于等于8000 g离心15 sec，弃滤液。 f. 加500 ul80%乙醇到Spin Column中，大于等于8000 g离心15 sec，弃滤液。 g. 打开Spin Column的管盖，最大转速(小于等于25000 g)离心5 min，弃滤液和Collection Tube。
生物素测定说明书
INSTRUCTIONS Number Description 28005 Kit Contents: 24 microtubes Biotinylated Horseradish Peroxidase (40kDa), 5mg Storage: Upon receipt store at 4°C. Product is shipped at ambient temperature. Introduction 4-Biotin (Product No. 21329). HABA (4′-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid) is a reagent that enables a quick estimation of the mole-to-mole ratio of biotin to protein. The Thermo Scientific? Pierce? Biotin Quantitation Kit contains a premix of HABA and avidin and a biotinylated horseradish peroxidase (HRP) positive control. The HABA/Avidin Premix is supplied in convenient Thermo Scientific? No-Weigh? Microtube packaging, which eliminates the difficulties associated with weighing small quantities of reagent. the protein. A protein can be conjugated with several biotin molecules, each of which can bind one molecule of avidin, thereby greatly increasing the sensitivity of many assays. The bond formation between biotin and avidin is rapid and once formed is unaffected by most extremes of pH, organic solvents and other denaturing agents.1-3 To quantitate biotinylation, a solution containing the biotinylated protein is added to a mixture of HABA and avidin. Because of its higher affinity for avidin, biotin displaces the HABA and the absorbance at 500nm decreases proportionately. By this method, an unknown amount of biotin present in a solution can be quantitated in a single cuvette by measuring the absorbance of the HABA-avidin solution before and after addition of the biotin-containing sample. The change in absorbance relates to the amount of biotin in the sample by the extinction coefficient of the HABA-avidin complex. Important Product Information ? Following any biotin-labeling reaction, the biotinylated protein sample to be assayed must be dialyzed or desalted to remove nonreacted and hydrolyzed biotinylation reagent. ? Samples must be in one of the recommended buffers (PBS or TBS, see Reagent Preparation Section) for the assay. Avoid buffers containing potassium (such as Modified Dulbecco’s PBS), which will cause precipitation in the assay. Other buffers may interfere and should not be used unless first validated by comparison to results using PBS or TBS. ? Slight color variation between the HABA/Avidin Premix microtubes does not affect product performance. (Product No. 28376) Note: Avoid using buffers containing potassium salts (see Important Product Information). Biotinylated HRP (Positive Control) Visit our website to obtain the lot-specific certificate of analysis for the kit (Product No. 28005); note the exact package size (5 to 6mg) of the supplied Biotinylated HRP. Prepare the Biotinylated HRP at 1mg/mL by adding the appropriate volume of ultrapure water to the vial. Mix with a pipette tip and allow it to solubilize. Complete solubilization requires approximately 5 minutes at room temperature. Store solution in single-use volumes (i.e., 120μL ) at -20°C until ready to use. Pierce Biotin Quantitation Kit
生物素标记蛋白操作方法
生物素标记蛋白操作方法 下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。 1、溶解2－10mg蛋白于1ml的Buph Tm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰 当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。 2、在打开之前，平衡生物素至室温。加2mg Sulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的 生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。（见下表） 3、室温30分钟，或冰上放置2小时。 4、用30ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。 5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。 6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。 HABA法检测生物素标记效果 试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mM Nacl PH7.2） ②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mM HABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。 比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比： 1、吸取900ul HABA/亲和素溶液于1ml比色杯。 2、测定该溶液在500nm处的吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。 3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin (数 值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。 注：计算结果时必须考虑稀释度。 4、计算Biotin/Protein摩尔比 ①A=生物素化的蛋白毫摩尔浓度＝蛋白浓度（mg/ml）/蛋白的分子量 ②B=500nm处的吸光度变化 △A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin ③C=生物素的毫摩尔浓度=mmol Biotin/ml反应溶液=△A500/（34,000×光程） ④Biotin/Protein摩尔比=C·10·稀释倍数/A
生物素标记抗体
生物素标记抗体 生物素标记抗体 生物素标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性，生物素标记的抗体可存放多年而不失活。能与生物素结合的二级试剂为亲和素和链霉亲和素，所需的各种标记物均可购置。此外，亲和素和链霉亲和素的结合背景水平非常低．结合紧密且快速。故可消除多步骤程序中的许多缺点。生物素拯记—尥王要优点是标记一抗后，再选用亲和素或链霉亲和素标记的二级试剂进行测定。 抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料或放射性碘的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。链霉亲和素及亲和素与生物素的亲和力非常高(Ka1015L／mo1)，并且二者间的相互作用实质上是不可逆的。由于链霉亲和素的等电点（pI）更适宜故其更常用，背量也因此较低。 将生物素与抗体共价结合是一种非常简便和直接的标记方法。通常，生物素对抗体并无负面影响且标记条件温和，用亲和素或链霉亲和素标记试剂进行检测的敏感性与使用标记抗IZ抗体相同。Becker和Wichek(1972)、Heitzmann和Richards(1974)及Heggeness和Ash(1977)等提供了首次使用
生物素与亲和素复合物的例证，而且Green(1963，1990)对两者的相互作用做了详细论述。 大多数生物素酰基化反应是利用生物素的N—羟基琥珀酰亚胺酯。琥珀酰亚胺基可以与抗体上的自由氨基结合，通常是赖氨酰侧链。现在许多生物素酰基化酯均可购得。此类变构物改变了生物素的分子大小及其与偶合基团之间空间桥联臂的特性等。某些情况下，空间桥联臂起决定性作用。例如，较长的空间桥联臂可以使偶联物更容易接近生物素，其柔韧性也更好，尽管也更容易出现非特异结合。某些空间桥联臂可以劈开，这样就可在一定的控制条件下将抗体释放出来。表4．6列出许多可以利用的空间桥联臂及其特性。所有这些酯类均可用下列方法处理。如果没有其他特殊要求，一般推荐使用生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯。 可利用的空间桥联臂及其特性偶合基团 化合物类型 反应基团 侧链原子数(个) 说明
生物素标记提取膜蛋白以及WB具体步骤
一，Lipo2000转染 1,准备细胞：转染前一天，向含9mlDMEM（含血清不含抗生素）的9cm平板接入细胞，使其在转染时长到90%。转染前用DMEM（—）洗2遍后，加入9mlDMEM（不含血清不含抗生素） 2,准备混合物： ①将6ug质粒稀释于300ulDMEM（—）中，涡旋1s，静置5min。 ②将18ul Lipo2000稀释于300ulDMEM（—）中，涡旋1s，静置5min。 ③将①②混匀，静置20min。 3，将混合物加入平板，前后摇匀。 4,6h后给细胞换DMEM（含血清不含抗生素）。 5，继续培养8—48h，观察。 二，生物素标记 1,向皿中加入2ml 1mg/ml的生物素试剂。 2,4℃，温和shaking30min，孵育后有一些细胞会悬浮起来，转移这些细胞至离心管中，离心收集细胞，并按下面方法洗涤细胞。 3，用2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+，100Mm Glycine的PBS清洗细胞2次，这时也会有一些细胞悬浮起来，转移它们到一个离心管，离心收集细胞。 4，加2ml含0.1mM Ca+，1mM mg2+的PBS到皿中。 5，4℃，45min停止未反应的生物素试剂的反应。（使生物素试剂失活），并收集浮起来的细胞，离心收集细胞。 6，收集细胞：将皿中的细胞和浮起来的细胞转移进入一个1.5ml的离心管。 7，向1.5ml的离心管中加入1ml RIPA/lysis buffer。（含蛋白酶抑制剂1table /50ml）8，4℃涡旋1h。 9,20000g,10min,4℃,以沉淀核酸与其他残渣。 10，把上清转入新的EP管，（这是总蛋白，T，一般情况下浓度应该在1-5mg/ml，可以用Bradford method来测定浓度，并调整全部样品至同一浓度） 11，向300ul pre-cleared sample中加入300ul含50% slurry-Avidin beads的PBS,PI孵育。 （PI，蛋白酶抑制剂，的工作浓度0.1-1mM，17-174ug/ml） 12，室温涡旋1h。（使生物素和亲和素充分结合） 13，离心除去beads，将上清转移至一新离心管中。（这是位结合的蛋白质，浓度相对于总蛋白被稀释了1.5倍。） 14，向beads中加入150ul 2×Laemmli buffer来将beads上的蛋白质洗掉。（洗下来的蛋白浓度是总蛋白浓度的2倍） 三，WB (一)做胶 1，将板洗干净，晾干 2，把两个板合在一起放到模具上，板要对齐放平，板下垫胶皮垫，防止液体渗出。 3，配制分离胶：1.5mm的胶，一块大约7ml 用一个小烧杯，按顺序加入，每加入一样都混匀一下，再加下一样。加入 TEMED后，混匀，用枪头搅拌30s。 4，用蓝枪头吸取配制好的分离胶，慢慢加入两板之间，从板的一角竖直加入。 加到离梳齿下缘1cm处。 5，用蓝枪头吸取ddH2O，从两板之间的上方水平加入，直到水平面与玻璃板
生物素标记蛋白操作方法
下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。 1、溶解2－10mg蛋白于1ml的Buph Tm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的 缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。 2、在打开之前，平衡生物素至室温。加2mg Sulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的生物 素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也 可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。（见下表） 3、室温30分钟，或冰上放置2小时。 4、用30ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。 5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。 6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。 HABA法检测生物素标记效果 试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mM Nacl PH7.2） ②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mM HABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。 比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比： 1、吸取900ul HABA/亲和素溶液于1ml比色杯。 2、测定该溶液在500nm处的吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。 3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin (数值 必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。 注：计算结果时必须考虑稀释度。 4、计算Biotin/Protein摩尔比 ①A=生物素化的蛋白毫摩尔浓度＝蛋白浓度（mg/ml）/蛋白的分子量 ②B=500nm处的吸光度变化 △A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin ③C=生物素的毫摩尔浓度=mmol Biotin/ml反应溶液=△A500/（34,000×光程） ④Biotin/Protein摩尔比=C·10·稀释倍数/A
生物素标记蛋白操作方法
抗体生物素标记操作方法 一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。 蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。 一、试剂和器材： 1、标记反应溶液：0.1M pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride） NaCl 8.77 g ；Na 2HPO 4 ·12H 2 O 32.3g ；NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 4.5g；加双蒸水 900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至 7.2，最后定容为 1000mL 2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：称取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量为587），溶解于95 μl 超纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，开瓶前平衡至室温。也可以配置200 nmol/L 储备液：20mg NHS-dPEG4-Biotin溶解于170μl DMSO中，-20℃稳定几个月。 由于NHS-PEG4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以实际称量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入超纯水。 3、超滤管 ⑴、Millipore超滤管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，残留体积200μl，蛋白回收率95%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心10min。 ⑵、Millipore超滤管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，残留体积80μl，蛋白回收率94%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心5 min。 ⑶、Amicon Ultra -0.5ml离心超滤管（Millipore），效果更好，典型的最终浓缩物体积：5-15ul。
生物素维生素B7说明书
生物素维生素B7说明书 维生素B7也称为生物素，是B族复合维生素的一部分。“Vincent Du Vigneaud”在1940年首先发现了这种维生素，它的主要作用是帮助人体细胞把碳水化合物、脂肪和蛋白质转换成可以使用的能量。然而，这只是其众多功能之一。这篇文章将帮助你了解更多与之相关的知识。 维生素B7是水溶性纤维。维生素有脂溶性和水溶性两种不同类型。脂溶性维生素非常稳定，并难以摧毁。水溶性维生素则更为敏感，很容易被强大的热和光摧毁。其次，脂溶性维生素可以储存在体内，而水溶性维生素不能。 由于可溶于水，意味着每天需要摄入一定数量维生素B7，建议 量是男子0.03mg，女性0.01mg。此外，还要确保适当保存和烹饪含该维生素的食物，确保其B7成分完好无损。 几乎所有食物中都包含生物素。然而，某些食物的含量更为丰富。如蛋黄、动物肝、牛奶、蘑菇和坚果都是最好的维生素B7来源。因此，应该在日常饮食中包含这些食品。 有很多因素可以导致维生素B7缺乏。不同于大多数维生素，B7摄入量不足不是唯一导致缺乏症的原因。酗酒也会妨碍对这种维生素的吸收，一些遗传性疾病会迫使身体提高B7的摄入量。因此，应该根据上述因素适当考虑采取补充措施。 维生素B7有控制糖尿病的作用。研究发现这种维生素有助于糖 尿病患者控制血糖水平，并防止疾病造成的神经损伤。一个人身体
正常机能的发挥是需要用各种营养成分支撑的，维生素b7 就是其中的一种，这种维生素主要发挥的作用体现在对于皮肤黏膜和免疫系统当中的，由于其细胞内部含有一定的感光物质，所以在使用的时候需要适度的避开阳光的直射，还应该注意保护眼角膜等比较脆弱的器官 在日常当中维生素b7是比较少听说的，维生素b7被称作为生物素，是生物体固定二氧化碳的重要因素。 缺乏；缺乏维生素b7会导致脱毛、皮炎或者是体重降低。 注意；大量的食用鸡蛋白会阻碍生物素的吸收。