IPTG诱导原理

E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I（图15-4）。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I 序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

材料

1、诱导表达材料

( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基

酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10g

NaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%

蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0

适用范围：大肠杆菌

( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。

( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS （电泳级）

0.1 ％溴酚蓝

10 ％甘油

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

1 ）酶溶法

（1）裂解缓冲液：

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。

（3）10 mg / mL 溶菌酶。

（4）脱氧胆酸。

（5）1 mg / mL DNase I。

2 ）超声破碎法

( 1 ) TE 缓冲液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 ％溴酚蓝

20 ％甘油

实验方案

1、外源基因的诱导表达

( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。

( 2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。

( 3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，

确定无误后进行下一步。

( 4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。

( 5 ）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化

1 ）细菌的裂解

常用方法有：

①高温珠磨法；

②高压匀浆；

③超声破碎法；

④酶溶法；

⑤化学渗透等。

前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：①4 ℃，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。

第一节基因表达调控基本概念

一、基因表达的概念及意义

1、基因表达的概念

一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整

套基因，称为基因组。不同生物基因组所含基因

多少不同。在某一特定时期，基因组中只有一

部分基因处于表达状态。在个体不同生长时期、不同生活环境下，某种功能的基因

产物在细胞中的数量会随时间、环境而变化。基因表达就是基因转录及翻译的过程

(图15-1)。在一定调节机制控制下，大多数基因经历基因激活、转录及翻译等过

程，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子。但并非所有基因表达过程都产生蛋白

质。rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。

2、基因表达调控的生物学意义

适应环境、维持生长和增殖生物体赖于生存的外环境是在不断变化的。有生

命体中的所有活细胞都必须对外环境变化作出适当反应，调节代谢，以使生物体能更好地适应变化着的外环境，维持生命。这种适应调节的能力总是与某种或某些蛋白质分子的功能有关，即与相关基因表达有关。生物体调节基因表达，适应环境是普遍存在的。原核生物、单细胞生物调节基因的表达就是为适应环境、维持生长和细胞分裂。高等生物也普遍存在适应性表达方式。经常饮酒者体内醇氧化酶活性高即与相应基因表达水平升高有关。

维持个体发育与分化在多细胞个体生长、发育的不同阶段，细胞中的蛋白质

分子种类和含量差异很大；即使在同一生长发育阶段，不同组织器官内蛋白质分子分布也存在很大差异，这些差异是调节细胞表型的关键。高等哺乳类动物各种组织、器官的发育、分化都是由一些特定基因控制的。当某种基因缺陷或表达异常时，则会出现相应组织或器官的发育异常。

二、基因表达的规律

病毒、细菌，乃至高等哺乳类动物及人，基因表达表现为严格的规律性，即时间、空间特异性。基因表达的时间、空间特异性由特异基因的启动子（序列）和/或增强子与调节蛋白相互作用决定。

时间特异性

噬菌体、病毒或细菌侵入宿主后，呈现一定的感染阶段。随感染阶段发展、生长环境变化，有些基因开启，有些基因关闭。按功能需要，某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，这就是基因表达的时间特异性（图15-2）。在多细胞生物从受精卵到组织、器官形成的各个不同发育阶段，相应基因严格按一定时间顺序开启或关闭，表现为与分化、发育阶段一致的时间性。因此，多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶段特异性。

空间特异性

在多细胞生物个体某一发育、生长阶段，同一基因产物在不同的组织器官表达多少是不一样的；在同一生长阶段，不同的基因表达产物在不同的组织、器官分布也不完全相同。在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，这就是基因表达的空间特异性（图15-3）。基因表达伴随时间或阶段顺序所表现出的这种空间分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，因此基因表达的空间特异性又称细胞特异性或组织特异性。

三、基因表达的方式

不同种类的生物遗传背景不同，同种生物不同个体生活环境不完全相同，不同的基因功能和性质也不相同。因此，不同的基因其表达方式或调节类型存在很大差异。