基因芯片的技术原理及在动植物研究上的应用
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河北农业科学，２００８，１２ （９）：５３－ ５４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
责任编辑 蔡海燕
基因芯片的技术原理及在动植物研究上的应用
杨东英 （德州学院生物系，山东省生物物理重点实验室，山东 德州 ２５３０２３）
摘要：基因芯片是常见的生物芯片之一。综述了基因芯片的作用原理及其在动植物研究方面的应用。
１ 基因芯片及其技术原理
基因芯片是指应用大规模集成电路的微阵列技术， 将大量代表不同基因的寡核苷酸探针有序的、高密度的 排列在载玻片等载体上，点与点之间的距离﹤５００ μｍ。 使用时，将样品核酸用同位素和荧光等方法标记，然后 与芯片探针杂交，洗涤，杂交后芯片扫描，并配合计算 机系统分析，从而迅速得到所需信息。
基因芯片应用于畜禽基因组研究，将大大加快其研 究进程，为畜禽经济性状基因定位提供强有力的工具。 动物遗传育种研究进入分子水平后，基因芯片将有效地 对动物基因表达和调控进行研究，为新品种的育成提供 基因水平的依据。未来应用于动物研究的芯片将成功地 对杂交后代的基因进行检测，直接从基因水平早期判断 杂交效果［１７～１８］在转基因技术中将用于外源基因检测与外 源基因表达和功能检测，并将广泛应用于动物的选种和 保种工作。
ＹＡＮＧ Ｄｏｎｇ!ｙｉｎｇ （Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄｅｚｈｏｕ ２５３０２３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ：Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｉｐ． Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ：Ｇｅｎｅｃｈｉｐ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
参考文献： ［１］ 赵革新，任鲁风，刘凤杰，等． 全基因组扩增策略在基因
芯片分析 ＳＡＲＳ 冠状病毒实验中的应用 ［Ｊ］． 中国生物 工程杂志，２００４，４ （３）：５４－ ５９． ［２］ 张小燕，左明雪，张占军，等． 用基因芯片检测单核苷酸 多态性反应原理 ［Ｊ］． 中国生物工程杂志，２００５，２５ （１１）：５２－ ５６． ［３］ Ｅｒｉｃ Ｌｅｐｒｏｕｓｔ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｎ ｇｌａｓｓ ｐｌａｔａｓ ［Ｊ］ ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００１，１９ （１０）：２１７１－ ２１８０． ［４］ 朱 滨，景奉香，赵建龙，等． 用氨基修饰的载玻片制作 ｃＤＮＡ 微阵列 ［Ｊ］． 生物化学与生物物理进展，２００１，２８ （１）：１２１－ １２３． ［５］ 王忠华，王金兴，王建潮． 发育分子生物学 ［Ｍ］． 西安： 第二军医大学出版社，２０００． ［６］ Ｓｃｈｕｍｍｅｒ Ｍ，Ｎｇ Ｗ，Ｎｅｌｓｏｎ ＰＳ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｈａｎｄ－ ｈｅｌｄ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｒｒａｙｓ ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，２３ （６）：１０８７－ １０９２． ［７］ Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ＫＬ，Ｈｕｎｇ ＸＣ，Ｍｏｒｒｉｓ ＭＳ，ｅｔ ａｌ． Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅ－ ｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｔｅ （ｎ－ ｍｅｒ） ＤＮＡ ａｒｒａｙｓ ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１９９８，８：１１４１－ １１４７． ［８］ 王升启． 基因芯片技术及应用研究进展 ［Ｊ］． 生物工程进 展，１９９９，１９ （４）：４５－ ５１． ［９］ 马立人，蒋中华． 生物芯片 ［Ｍ］． 北京：化学工业出版 社，２００１． ［１０］张思仲． 人类基因组的单核苷酸多态性及其医学应用 ［Ｊ］． 中华医学遗传学杂志，１９９９，１６ （２）：１１９－ １２１． ［１１］Ｗａｎｇ Ｄ，Ｆａｎ Ｊ，Ｓｉａｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ－ ｓｃａｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｍａｐｐｉｎｇ， ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ － ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒ－ ｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ［Ｊ］ ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９８， ２８０： １０７７－ １０８２． ［１２］陈菊祥，范静平，应 康，等． 基因表达谱芯片发现 ３６ 条喉鳞癌相关基因 ［Ｊ］． 第二军医大学学报，２００１，２２ （６）：５１９－ ５２２． ［１３］ Ａｓｈ Ａ Ａｌｉｚａｄｅｈ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ Ｅｉｓｅｎ， Ｒ Ｅｒｉｃ Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ－ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ［Ｊ］ ． Ｎａｔｕｒｅ， ２０００， ４０３ （６７６９）：５０３－ ５１１． ［１４］吴 海，顾少华，胡志前，等． 检测乙、丙型肝炎病毒基 因芯片的制备 ［Ｊ］． 第二军医大学学报，２００１，２２ （６）： ５２７－ ５２９． ［１５］李 禾，徐 琦，吴忠华，等． 基因芯片技术检测 ３ 种 肠 道 病 原 微 生 物 方 法 的 建 立 ［Ｊ］ ． 生 物 技 术 通 讯 ， ２００７，１８ （３）：４４１－ ４４５． ［１６］唐先明，王振月，赵海鹏，等． 基因芯片技术在中药基 因组学研究中的应用 ［Ｊ］． 时珍国医国药，２００７，１８ （５）：１０９７－ １０９９． ［１７］狄春红，杨 磊，桂 芬，等． 凋亡和周期基因芯片研究 Ａｓ２Ｏ３ 对 ＮＢ４ 细胞凋亡相关基因表达谱的影响 ［Ｊ］． 中 国生物工程杂志，２００５，２５ （１１）：７－ １１． ［１８］饶志明，张荣珍，王正祥，等． 基因芯片技术在微生物 学研究中的应用 ［Ｊ］． 中国生物工程杂志，２００３，２３ （８）：６１－ ６５．
ＤＮＡ 阵列的集成有 ２ 种不同的技术路线： （１）利 用半导体激光光刻技术和照相平板印刷技术，在固相支 持物表面原位合成寡核苷酸探针［４～５］。探针的固相合成类 似于 “搭积木”，每 １ 个探针都是由 Ａ、Ｔ、Ｇ 和 Ｃ 自下 而上堆积而成。每 １ 层合成都需要相应的掩盖物 （ｍａｓｋ）。在合成碱基单体的 ５＇ 羟基末端连上 １ 个光敏 保护基，利用汞灯发出的光束照射载体表面特定合成区 域，激活这个区域，使羟基端脱保护产生自由羟基，然 后 １ 个 ５，端保护的核苷酸的 ３，端通过化学键连接上 去。这个过 程 反 复 进 行 直 至 合 成 １ 整 套 探 针 ； （２） ＤＮＡ 微集阵列技术 （ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒｙ），又叫点样法，是 将合成好的探针、ｃＤＮＡ 或基因组 ＤＮＡ 通过特定的高速 点样机器人直接点在芯片上，然后经过紫外线照射交联 固定［６］。采用的机器人由计算机控制，有多个打印／喷印 针头，将探针打印或喷印于芯片上。打印法的优点是探 针密度高，通常 １ ｃｍ２ 可打印 ２ ５００ 个探针；缺点是定 量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有 限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命 长。缺点是喷印斑点大，因此探针密度低，通常 １ ｃｍ２ 只有 ４００ 点。 １．２ 样品制备和生物分子反应
２ 基因芯片在动植物研究的应用
应用基因芯片对动植物基因表达的个体特异性、发 育阶段特异性、分化阶段特异性、种属特异性进行综合 分析和判断，加快基因功能的确立，同时进一步研究基 因与形状的关系，为物种改良奠定基础。
２０００ 年国内首张水稻基因芯片问世［１６］。这种芯片能 正确检测基因表达丰度的改变，并实现以基因群体模式 对生物学事件 （如水稻抗旱、抗寒、抗病虫等）的基因 水平解析。浙江大学生物技术研究所已经通过基因芯片 技术克隆了与白叶枯菌诱导密切相关的一组基因。目 前，国内有公司研制成功了转基因植物检测性芯片，通 过检测可以判断该植物是否存在外源基因序列。
液滴在膜上的扩散，制作的微阵列密度很低，同时因膜 的荧光背景很高，探针多用放射性同位素标记，不仅存 在放射性污染，而且在研究基因差异表达时必需用 ２ 张 膜，从而带来较大误差。因此，现在制作高密度的微阵 列多用经修饰的载玻片，可以用荧光技术标记，用激光 共聚焦扫描仪检测信号，对于基因的差异表达研究可用 双荧光标记。目前国内外对载玻片的修饰多用多聚赖氨 酸 （ｐｏｌｙ"Ｌ"ｌｙｓｉｎｅ）处理。朱滨［３～４］ 等用氨基硅烷处理载 玻片制备基因芯片，固定效果和杂交后芯片检测灵敏度 比前者好。
同位素标记的样品核酸经杂交后通过放射自显影显 示杂交信号的强弱与分布；用荧光标记的样品核酸与芯 片探针杂交后，用荧光共聚焦扫描仪扫描，采集各杂交 点的荧光信号位置、荧光强弱，双色荧光测定则需读出 两种荧光的强度，得到相关图象，然后经计算机软件如 Ｇｅｎｅｐｉｘ３．０ 软件 ＩｍａＧｅｎｅ３．０ 软件分析，将图象数字化， 即可获得有关的生物信息。
基因芯片是基于核酸探针杂交技术原理而研发的。 根据碱基互补原理，利用核酸探针到基因混合物中识别 特定基因。基因芯片技术主要包括 ４ 个技术环节：ＤＮＡ 微阵列制备、样品制备、生物分子反应和信号的检测及 分析［１～２］。 １．１ ＤＮＡ 微阵列制备
芯片制备之前要对载体进行修饰，使其表面有可进 行化学反应的活性集团，以便与生物分子进行偶联，并 使载体具有良好的稳定性和生物兼容性［２］。早期的微阵 列有许多采用尼龙膜或硝酸纤维素膜做固相载体，由于
生物芯片（Ｂｉｏｃｈｉｐ 或 Ｂｉｏａｒｒｙ）是近 １５ 年来在生命 科学领域迅速发展起来的一项高新技术。它是指根据生 物分子间特异性相互作用原理，通过微加工和微电子技 术将生化分析过程集成于固体芯片表面，从而实现对 ＤＮＡ、ＲＮＡ、多肽、蛋白质以及其他生物成分准确、快 速和大信息量的检测。目前常见的生物芯片分为 ３ 大 类，即基因芯片 （Ｇｅｎｅｃｈｉｐ，ＤＮＡ ｃｈｉｐ 或 ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒ－ ｒｙ）、蛋白质芯片 （Ｐｒｏｔｅｉｎｃｈｉｐ）和芯片实验室 （Ｌａｂ－ ｏｎ－ ａ－ ｃｈｉｐ）。最近出现了微珠芯片 （ＢｅａｄＡｒａａｙ）和 ＭＯ－ ＴＯＲＡＬＡ 公司的便携式无线生物芯片装置。目前使用最 多、最广泛、技术发展较成熟的生物芯片为基因芯片。
芯片上的杂交反应是芯片检测的关键一步。杂交条 件的选择与研究目的有关。一般影响异源杂交双链形成 的因素包括样品核酸的浓度、探针的浓度、杂交双方序 列组成、盐浓度及温度［９］。通过实验确定严谨的反映条 件使成千上万的杂交反应中的大多数处于最佳状态中， 使尽可能多的正确配对物不被遗漏 （假阴性尽可能少）， 错配比率降至最低 （假阳性尽可能少），从而获得最能 反映生物本质的信号。 １．３ 芯片信号检测与分析
收稿日期：２００８－ ０７－ １５ 基金项目：山东省自然科学基金项目 （Ｑ２００７Ｄ０２，Ｙ２００７Ｄ５５）； 山 东 省 教 育 厅 资 助 项 目 （Ｊ０７ＷＪ５０）；德 州 学 院 人 才 引 进 项 目 （０６ｒｃ０１２，０７ｒｃ００７） 作者简介：杨东英 （１９７４－ ），女，山东嘉祥人，博士，主要从事 动物生物技术研究工作。
待分析基因一般不能与芯片探针直接杂交，在杂交 之前必须进行分离、扩增和标记。根据样品来源、基因 含量和分析目的不同，采取的基因分离、扩增和标记的
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河北农业科学
２００８ 年
方法不同。常规的基因分离、扩增和标记技术完全可以 采用，如以 ＤＮＡ、ＲＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩增反应或克 隆或逆转录 （ｍＲＮＡ）［７］，获取其中的 ＤＮＡ、ＲＮＡ 等信息 分子并以放射性同位素如 ３２Ｐ／３３Ｐ 或荧光素标记，但操作 烦琐费时。高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯 片及基因扩增芯片是实现上述目的的有效手段和发展方 向［８］。目前采用最普遍的荧光标记方法与传统方法如体 外转录、ＰＣＲ、逆转录等原理上无多大差异，只是采用 多种荧光标记，以满足不同来源样品的平行分析。
关键词：基因芯片；寡核苷酸探针；生物信息
中图分类号：Ｑ７８
文献标识码：Ａ
文章编号：１００８－ １６３１ （２００８）０９－ ００５３－ ０２
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Ｐｒ ｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ
责任编辑 蔡海燕
基因芯片的技术原理及在动植物研究上的应用
杨东英 （德州学院生物系，山东省生物物理重点实验室，山东 德州 ２５３０２３）
摘要：基因芯片是常见的生物芯片之一。综述了基因芯片的作用原理及其在动植物研究方面的应用。
１ 基因芯片及其技术原理
基因芯片是指应用大规模集成电路的微阵列技术， 将大量代表不同基因的寡核苷酸探针有序的、高密度的 排列在载玻片等载体上，点与点之间的距离﹤５００ μｍ。 使用时，将样品核酸用同位素和荧光等方法标记，然后 与芯片探针杂交，洗涤，杂交后芯片扫描，并配合计算 机系统分析，从而迅速得到所需信息。
基因芯片应用于畜禽基因组研究，将大大加快其研 究进程，为畜禽经济性状基因定位提供强有力的工具。 动物遗传育种研究进入分子水平后，基因芯片将有效地 对动物基因表达和调控进行研究，为新品种的育成提供 基因水平的依据。未来应用于动物研究的芯片将成功地 对杂交后代的基因进行检测，直接从基因水平早期判断 杂交效果［１７～１８］在转基因技术中将用于外源基因检测与外 源基因表达和功能检测，并将广泛应用于动物的选种和 保种工作。
ＹＡＮＧ Ｄｏｎｇ!ｙｉｎｇ （Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄｅｚｈｏｕ ２５３０２３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ：Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｉｐ． Ｔｈｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ：Ｇｅｎｅｃｈｉｐ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｂｅ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
参考文献： ［１］ 赵革新，任鲁风，刘凤杰，等． 全基因组扩增策略在基因
芯片分析 ＳＡＲＳ 冠状病毒实验中的应用 ［Ｊ］． 中国生物 工程杂志，２００４，４ （３）：５４－ ５９． ［２］ 张小燕，左明雪，张占军，等． 用基因芯片检测单核苷酸 多态性反应原理 ［Ｊ］． 中国生物工程杂志，２００５，２５ （１１）：５２－ ５６． ［３］ Ｅｒｉｃ Ｌｅｐｒｏｕｓｔ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｎ ｇｌａｓｓ ｐｌａｔａｓ ［Ｊ］ ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００１，１９ （１０）：２１７１－ ２１８０． ［４］ 朱 滨，景奉香，赵建龙，等． 用氨基修饰的载玻片制作 ｃＤＮＡ 微阵列 ［Ｊ］． 生物化学与生物物理进展，２００１，２８ （１）：１２１－ １２３． ［５］ 王忠华，王金兴，王建潮． 发育分子生物学 ［Ｍ］． 西安： 第二军医大学出版社，２０００． ［６］ Ｓｃｈｕｍｍｅｒ Ｍ，Ｎｇ Ｗ，Ｎｅｌｓｏｎ ＰＳ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ ｈａｎｄ－ ｈｅｌｄ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｒｒａｙｓ ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，２３ （６）：１０８７－ １０９２． ［７］ Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ＫＬ，Ｈｕｎｇ ＸＣ，Ｍｏｒｒｉｓ ＭＳ，ｅｔ ａｌ． Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅ－ ｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｔｅ （ｎ－ ｍｅｒ） ＤＮＡ ａｒｒａｙｓ ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，１９９８，８：１１４１－ １１４７． ［８］ 王升启． 基因芯片技术及应用研究进展 ［Ｊ］． 生物工程进 展，１９９９，１９ （４）：４５－ ５１． ［９］ 马立人，蒋中华． 生物芯片 ［Ｍ］． 北京：化学工业出版 社，２００１． ［１０］张思仲． 人类基因组的单核苷酸多态性及其医学应用 ［Ｊ］． 中华医学遗传学杂志，１９９９，１６ （２）：１１９－ １２１． ［１１］Ｗａｎｇ Ｄ，Ｆａｎ Ｊ，Ｓｉａｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ－ ｓｃａｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｍａｐｐｉｎｇ， ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ － ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒ－ ｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ［Ｊ］ ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９８， ２８０： １０７７－ １０８２． ［１２］陈菊祥，范静平，应 康，等． 基因表达谱芯片发现 ３６ 条喉鳞癌相关基因 ［Ｊ］． 第二军医大学学报，２００１，２２ （６）：５１９－ ５２２． ［１３］ Ａｓｈ Ａ Ａｌｉｚａｄｅｈ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ Ｅｉｓｅｎ， Ｒ Ｅｒｉｃ Ｄａｖｉｓ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ－ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ［Ｊ］ ． Ｎａｔｕｒｅ， ２０００， ４０３ （６７６９）：５０３－ ５１１． ［１４］吴 海，顾少华，胡志前，等． 检测乙、丙型肝炎病毒基 因芯片的制备 ［Ｊ］． 第二军医大学学报，２００１，２２ （６）： ５２７－ ５２９． ［１５］李 禾，徐 琦，吴忠华，等． 基因芯片技术检测 ３ 种 肠 道 病 原 微 生 物 方 法 的 建 立 ［Ｊ］ ． 生 物 技 术 通 讯 ， ２００７，１８ （３）：４４１－ ４４５． ［１６］唐先明，王振月，赵海鹏，等． 基因芯片技术在中药基 因组学研究中的应用 ［Ｊ］． 时珍国医国药，２００７，１８ （５）：１０９７－ １０９９． ［１７］狄春红，杨 磊，桂 芬，等． 凋亡和周期基因芯片研究 Ａｓ２Ｏ３ 对 ＮＢ４ 细胞凋亡相关基因表达谱的影响 ［Ｊ］． 中 国生物工程杂志，２００５，２５ （１１）：７－ １１． ［１８］饶志明，张荣珍，王正祥，等． 基因芯片技术在微生物 学研究中的应用 ［Ｊ］． 中国生物工程杂志，２００３，２３ （８）：６１－ ６５．
ＤＮＡ 阵列的集成有 ２ 种不同的技术路线： （１）利 用半导体激光光刻技术和照相平板印刷技术，在固相支 持物表面原位合成寡核苷酸探针［４～５］。探针的固相合成类 似于 “搭积木”，每 １ 个探针都是由 Ａ、Ｔ、Ｇ 和 Ｃ 自下 而上堆积而成。每 １ 层合成都需要相应的掩盖物 （ｍａｓｋ）。在合成碱基单体的 ５＇ 羟基末端连上 １ 个光敏 保护基，利用汞灯发出的光束照射载体表面特定合成区 域，激活这个区域，使羟基端脱保护产生自由羟基，然 后 １ 个 ５，端保护的核苷酸的 ３，端通过化学键连接上 去。这个过 程 反 复 进 行 直 至 合 成 １ 整 套 探 针 ； （２） ＤＮＡ 微集阵列技术 （ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒｙ），又叫点样法，是 将合成好的探针、ｃＤＮＡ 或基因组 ＤＮＡ 通过特定的高速 点样机器人直接点在芯片上，然后经过紫外线照射交联 固定［６］。采用的机器人由计算机控制，有多个打印／喷印 针头，将探针打印或喷印于芯片上。打印法的优点是探 针密度高，通常 １ ｃｍ２ 可打印 ２ ５００ 个探针；缺点是定 量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有 限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命 长。缺点是喷印斑点大，因此探针密度低，通常 １ ｃｍ２ 只有 ４００ 点。 １．２ 样品制备和生物分子反应
２ 基因芯片在动植物研究的应用
应用基因芯片对动植物基因表达的个体特异性、发 育阶段特异性、分化阶段特异性、种属特异性进行综合 分析和判断，加快基因功能的确立，同时进一步研究基 因与形状的关系，为物种改良奠定基础。
２０００ 年国内首张水稻基因芯片问世［１６］。这种芯片能 正确检测基因表达丰度的改变，并实现以基因群体模式 对生物学事件 （如水稻抗旱、抗寒、抗病虫等）的基因 水平解析。浙江大学生物技术研究所已经通过基因芯片 技术克隆了与白叶枯菌诱导密切相关的一组基因。目 前，国内有公司研制成功了转基因植物检测性芯片，通 过检测可以判断该植物是否存在外源基因序列。
液滴在膜上的扩散，制作的微阵列密度很低，同时因膜 的荧光背景很高，探针多用放射性同位素标记，不仅存 在放射性污染，而且在研究基因差异表达时必需用 ２ 张 膜，从而带来较大误差。因此，现在制作高密度的微阵 列多用经修饰的载玻片，可以用荧光技术标记，用激光 共聚焦扫描仪检测信号，对于基因的差异表达研究可用 双荧光标记。目前国内外对载玻片的修饰多用多聚赖氨 酸 （ｐｏｌｙ"Ｌ"ｌｙｓｉｎｅ）处理。朱滨［３～４］ 等用氨基硅烷处理载 玻片制备基因芯片，固定效果和杂交后芯片检测灵敏度 比前者好。
同位素标记的样品核酸经杂交后通过放射自显影显 示杂交信号的强弱与分布；用荧光标记的样品核酸与芯 片探针杂交后，用荧光共聚焦扫描仪扫描，采集各杂交 点的荧光信号位置、荧光强弱，双色荧光测定则需读出 两种荧光的强度，得到相关图象，然后经计算机软件如 Ｇｅｎｅｐｉｘ３．０ 软件 ＩｍａＧｅｎｅ３．０ 软件分析，将图象数字化， 即可获得有关的生物信息。
基因芯片是基于核酸探针杂交技术原理而研发的。 根据碱基互补原理，利用核酸探针到基因混合物中识别 特定基因。基因芯片技术主要包括 ４ 个技术环节：ＤＮＡ 微阵列制备、样品制备、生物分子反应和信号的检测及 分析［１～２］。 １．１ ＤＮＡ 微阵列制备
芯片制备之前要对载体进行修饰，使其表面有可进 行化学反应的活性集团，以便与生物分子进行偶联，并 使载体具有良好的稳定性和生物兼容性［２］。早期的微阵 列有许多采用尼龙膜或硝酸纤维素膜做固相载体，由于
生物芯片（Ｂｉｏｃｈｉｐ 或 Ｂｉｏａｒｒｙ）是近 １５ 年来在生命 科学领域迅速发展起来的一项高新技术。它是指根据生 物分子间特异性相互作用原理，通过微加工和微电子技 术将生化分析过程集成于固体芯片表面，从而实现对 ＤＮＡ、ＲＮＡ、多肽、蛋白质以及其他生物成分准确、快 速和大信息量的检测。目前常见的生物芯片分为 ３ 大 类，即基因芯片 （Ｇｅｎｅｃｈｉｐ，ＤＮＡ ｃｈｉｐ 或 ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒ－ ｒｙ）、蛋白质芯片 （Ｐｒｏｔｅｉｎｃｈｉｐ）和芯片实验室 （Ｌａｂ－ ｏｎ－ ａ－ ｃｈｉｐ）。最近出现了微珠芯片 （ＢｅａｄＡｒａａｙ）和 ＭＯ－ ＴＯＲＡＬＡ 公司的便携式无线生物芯片装置。目前使用最 多、最广泛、技术发展较成熟的生物芯片为基因芯片。
芯片上的杂交反应是芯片检测的关键一步。杂交条 件的选择与研究目的有关。一般影响异源杂交双链形成 的因素包括样品核酸的浓度、探针的浓度、杂交双方序 列组成、盐浓度及温度［９］。通过实验确定严谨的反映条 件使成千上万的杂交反应中的大多数处于最佳状态中， 使尽可能多的正确配对物不被遗漏 （假阴性尽可能少）， 错配比率降至最低 （假阳性尽可能少），从而获得最能 反映生物本质的信号。 １．３ 芯片信号检测与分析
收稿日期：２００８－ ０７－ １５ 基金项目：山东省自然科学基金项目 （Ｑ２００７Ｄ０２，Ｙ２００７Ｄ５５）； 山 东 省 教 育 厅 资 助 项 目 （Ｊ０７ＷＪ５０）；德 州 学 院 人 才 引 进 项 目 （０６ｒｃ０１２，０７ｒｃ００７） 作者简介：杨东英 （１９７４－ ），女，山东嘉祥人，博士，主要从事 动物生物技术研究工作。
待分析基因一般不能与芯片探针直接杂交，在杂交 之前必须进行分离、扩增和标记。根据样品来源、基因 含量和分析目的不同，采取的基因分离、扩增和标记的
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河北农业科学
２００８ 年
方法不同。常规的基因分离、扩增和标记技术完全可以 采用，如以 ＤＮＡ、ＲＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩增反应或克 隆或逆转录 （ｍＲＮＡ）［７］，获取其中的 ＤＮＡ、ＲＮＡ 等信息 分子并以放射性同位素如 ３２Ｐ／３３Ｐ 或荧光素标记，但操作 烦琐费时。高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯 片及基因扩增芯片是实现上述目的的有效手段和发展方 向［８］。目前采用最普遍的荧光标记方法与传统方法如体 外转录、ＰＣＲ、逆转录等原理上无多大差异，只是采用 多种荧光标记，以满足不同来源样品的平行分析。
关键词：基因芯片；寡核苷酸探针；生物信息
中图分类号：Ｑ７８
文献标识码：Ａ
文章编号：１００８－ １６３１ （２００８）０９－ ００５３－ ０２
Байду номын сангаас
Ｐｒ ｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ