3限制性内切酶
限制性内切酶
限制性内切酶限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。
通常，限制性内切酶会切割双链DNA，每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA，识别序列长度通常为4-8bp，酶切之后会形成粘性末端和平末端。
上世纪50年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异[1,2]，即：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌C）内繁殖的噬菌体λ感染同一种类的灵异菌株（例如大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K的感染率出现明显下降。
新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。
研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。
这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域[3]。
直到上世纪60年代，人们才发现宿主变异的机制，其与噬菌体DNA的酶切有关，进而发现并分理出了限制性内切酶。
上世纪60年代初Werner Arber观测发现，宿主范围内的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[4]。
这些发现最终催生了限制性修饰（R-M）体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA不受甲基化[5]。
随着DNA连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶的家族不断壮大，重组DNA 技术应运而生。
限制性内切酶的命名规则，考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶[6]。
例如，以HindⅢ酶为代表：“H”代表Haemophilus“in”代表influenzae“d”代表血清型d“Ⅲ”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶限制性内切酶的分类，根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类：TypeⅠ：同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白需要ATP切割位点与识别位点间的间距不定TypeⅡ：特异性的识别序列切割位点位于识别序列内或邻近识别序列在切割位点生成5＇磷酸基和3＇羟基末端需要M2+TypeⅢ：由两个相反的识别序列组成切割位点与其中一个识别序列的间距恒定需要ATPTypeⅣ：仅切割甲基化的DNA切割位点大约距离识别位点30bp由于自身特殊的特点，TypeⅡ限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
二、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶首先由M.
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型：
① 5’端凸出（如EcoR I切点） 5’3’5’3’GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’3’CTGCAG GACGTC -3’ -5’
A 用于核酸操作的工具酶
Enzymes
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶
第一节 限制性核酸内切酶
一、限制性核酸内切酶
（Restriction endonuclease） 是一类能够识别双链DNA分子中的某 种特定核苷酸序列（4—8bp），并由 此处切割DNA双链的核酸内切酶。
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A 5’-GATC----3’ 3’----CTAG-5’ 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的 新位点一般不能再被原来的酶识别。 GATCT3’ 5’ -G BamH I Bgl Ⅱ A-5’ 3’-CCTAG 5’-GGATCT-3’ Bgl Ⅱ 3’-CCTAGA-5’ Sau 3A
？
BamH I
（7）限制酶的酶活性
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在 一定的温度、离子强度、pH等条件下才 表现最佳切割能力和位点的专一性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。 ① 星号（*）活性 如果改变反应条件就会影响酶的专一性 和切割效率，称为星号（*）活性。
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇
限制性核酸内切酶与核酸内切酶、外切酶
限制性核酸内切酶百科名片其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA 再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。
核酸内切酶核酸内切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。
从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶。
如链孢霉（Neurospora）的核酸酶就是既分解DNA又分解RNA的酶。
一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。
[1]寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。
RNA聚合酶科技名词定义中文名称：RNA聚合酶英文名称：RNA polymerase定义1：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科）定义2：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科）定义3：以DNA或RNA为模板合成RNA的酶。
所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
限制性内切酶酶切位点汇总
限制性内切酶酶切位点汇总限制性内切酶（Restriction Endonuclease）是一类存在于细菌体内的酶，它能够识别特定的酶切位点，并在该位点上切割DNA链。
限制性内切酶起源于细菌，原本作为细菌对抗噬菌体感染的防御机制，但现在被广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
限制性内切酶的分类和命名依据它们发现的第一个类型的噬菌体。
如EcoRI是从大肠杆菌中分离出的内切酶，与T4噬菌体相关；HindIII是与T4噬菌体有关的内切酶等。
酶名中的缩写首字母通常是酶切位点的首字母，比如EcoRI是指E.coli的RY粘性末端的切点。
现在限制性内切酶已被发现有超过3000多个类型。
下面是一些常见的限制性内切酶的切割位点汇总：1. EcoRI：切割位点为G↓AATTC（↓表示切割位点），产生的切割后的两个DNA片段是G-AATTC和CTTAA-G。
2. HindIII：切割位点为A↓AGCTT，产生的切割后的两个DNA片段是A-AGCTT和TTCGA-A。
3. SmaI：切割位点为CCC↓GGG，产生的切割后的两个DNA片段是CCC-GGG和GGG-CCC。
4. BamHI：切割位点为G↓GATCC，产生的切割后的两个DNA片段是G-GATCC和CCTAG-G。
5. XhoI：切割位点为C↓TCGAG，产生的切割后的两个DNA片段是C-TCGAG和GAGCT-C。
6. NotI：切割位点为GC×GGCCGC，产生的切割后的两个DNA片段是GC-GGCCGC和CGC-GC。
7. EcoRV：切割位点为GAT↓ATC，产生的切割后的两个DNA片段是GAT-ATC和TAC-TAG。
8. KpnI：切割位点为GGTAC↓C，产生的切割后的两个DNA片段是GGTAC-C和CCATG-G。
9. SalI：切割位点为G↓TCGAC，产生的切割后的两个DNA片段是G-TCGAC和CAGCT-G。
10. PstI：切割位点为CTGCA↓G，产生的切割后的两个DNA片段是CTGC-AG和GACG-T。
限制性核酸内切酶
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变 的菌株。
3. 温度
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。
粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割， 有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。
粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或 同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。
粘性末端和平齐末端的动画对比
四 限制性内切酶的识别序列
• EcoRⅠ的识别序列 GAATTC
•
CTTAAG
• Hind Ⅲ的识别序列 AAGCTT
•
TTCGAA
• BamHⅠ的识别序列 GCATCC
•
CCTAGG
• 从以上举例的各种限制性酶切酶的识别序列看出， 它们具有共同的规律性，呈旋转对称或二重互补 对称。
• 有的限制性酶切酶可识别两种以上的核酸 序列。
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大 多数是37oC，少数要求40-65oC。
酶
最适 温度oC
酶
最适 温度oC
酶
Apa I 30 Apy I 30 Ban I Bcl I 50 BstE II 60 Mae I Mae II 50 Mae III 55 Sma I Taq I 65
最适 温度 oC
特性
限制和修饰活 性
内切酶的蛋白 结构
I类内切酶 单一多功能的酶 3种不同的亚基
三酶切和单酶切
三酶切和单酶切摘要：1.三酶切和单酶切的概念2.三酶切的原理和过程3.单酶切的原理和过程4.三酶切和单酶切的优缺点比较5.在实际应用中的选择正文：三酶切和单酶切是分子生物学中常用的两种酶切技术。
它们的主要区别在于所使用的酶的种类。
三酶切是指同时使用三种不同的限制性内切酶进行切割，而单酶切则只使用一种限制性内切酶。
这两种技术都可以用于DNA 分子的切割和连接，但具体应用时需要根据实验需求和条件来选择合适的技术。
三酶切技术的主要原理是利用三种不同种类的限制性内切酶识别并切割DNA 分子的不同序列，形成特定的切口。
通过设计三种酶的切割位点，可以实现精确的DNA 片段切割。
在实际操作过程中，首先将三种酶混合在一起，然后将混合酶与待切割的DNA 分子一起温育。
在酶的作用下，DNA 分子被切割成特定大小的片段。
接下来，通过电泳或离心等方法将切割后的DNA 片段分离开来。
最后，将所需的DNA 片段重新连接起来，进行后续实验。
单酶切技术则是利用一种限制性内切酶对DNA 分子进行切割。
这种技术相对简单，操作过程与三酶切类似，但只需使用一种酶。
通过设计酶的切割位点，可以获得特定大小的DNA 片段。
单酶切技术的优点是操作简便，酶的来源和性质相对单一，实验条件相对容易控制。
但缺点是切割位点有限，可能无法满足某些特定实验需求。
在优缺点比较方面，三酶切技术具有更高的切割准确性和灵活性，可以实现更复杂的切割位点设计。
但同时，操作过程相对复杂，可能需要更长的实验时间和更多的实验技巧。
单酶切技术操作简便，实验条件易于控制，但切割位点有限，可能无法满足某些特定实验需求。
在实际应用中，选择三酶切还是单酶切技术取决于实验的具体需求和条件。
如果需要进行复杂的切割位点设计或对切割效果要求较高，可以选择三酶切技术。
如果实验条件有限，或对切割效果要求相对较低，可以选择单酶切技术。
限制性内切酶名词解释
限制性内切酶名词解释限制性内切酶（Restriction enzyme）是一类由细菌产生的酶，主要作用是切割DNA分子特定的酶切位点。
限制性内切酶在遗传工程和分子生物学研究中被广泛应用，能够将长的DNA 分子切割成特定大小的片段，从而使得研究者能够更好地研究和操作DNA。
限制性内切酶的发现和研究起源于1970年代。
当时，研究人员发现一些特定的细菌能够产生一种奇特的酶，它对DNA分子具有特异性的切割作用。
这种切割作用通常发生在特定的核苷酸序列上，被称为酶切位点或限制性位点。
每个限制性内切酶所识别和切割的酶切位点都有其独特的序列特征，并且有许多不同类型的限制性内切酶，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
限制性内切酶的酶切作用是通过切割DNA分子的磷酸二酯键来实现的。
酶在酶切位点附近结合DNA分子，然后通过水解反应切割两股DNA的骨架，形成切割产物。
限制性内切酶的切割位置对两股DNA是对称的，意味着切割产物的两端都有一小段单链的“黏性末端”。
这种黏性末端的单链序列是由酶切位点的一部分序列决定的，如EcoRI酶切产生的末端序列是5'-GAATTC-3'。
黏性末端可以与其他黏性末端互补配对，形成DNA双链的黏性连接。
这种黏性连接有助于分子生物学研究者将DNA分子重新连在一起，或者将不同的DNA分子连接在一起，从而构建新的DNA分子。
限制性内切酶的应用非常广泛。
一方面，通过限制性内切酶的切割作用，可以将长的DNA分子切割成小片段，从而方便进行测序、克隆和分析。
另一方面，限制性内切酶可以用于DNA重组和基因工程。
研究人员可以利用黏性末端的互补配对原理，将不同的DNA片段连在一起，构建新的DNA分子，例如将外源基因插入到质粒中，形成重组DNA分子。
此外，限制性内切酶还可以用于DNA分子的鉴定和分析，例如通过切割产物的大小和形态来鉴定特定的DNA序列。
总之，限制性内切酶是一种重要的分子工具，广泛应用于分子生物学研究、遗传工程和基因工程等领域。
限制性内切酶和DNA体外重组的基本含义
• 1、基本概念
•DNA重组技术也称为基因克隆或分子克隆。最终目的是把 一个生物体中的遗传信息转入另一个生物体。
2、基本步骤
•目的基因的提取:供体生物基因
或称外源基因的提取 •限制性酶切：目的基因切成不同 大小的片段 •酶接：连接到另一DNA分子上 （克隆载体） •转化:将这个重组DNA分子转入 受体细胞 •筛选和鉴定:对吸收了重组DNA 的受体细胞进行 筛选和鉴定 •基因表达：进行培养，检测外援 基因是否表达。
１、甘油浓度过高「＞5%v/v」 ２、１μｇDNA相对应的酶Unit数过高（因酶不同而不同，一般＞100 Unit/μｇ）
３、离子强度低（＜25mM）
４、pH值高（＞pH8.0） ５、残存有机溶剂。 ６、Mg2+替换为其他二价离子。（Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+）
Star 活性を阻害する条件
１、在切断可能的范围内，尽量减少酶用量。 ２、确认完全除去制备DNA时的有机溶剂。 ３、反应溶剂的离子强度调至100-150mM。４、反应溶液的pH值调整到7。 ５、二价阳离子尽量使用Mg2+。
2、Klenow酶：
• 也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’ 3’ 外切酶活性
Kpn I
5'- GGTACC -3' 3'- CCATG G -5'
Asp718 I
GTБайду номын сангаасCC-3' 5'-G + G-5' 3'-CCATG
CTCGA G
CCC
1 Unit 定义： 限制性内切酶在50μL反应液中60分钟完 全切断1μg DNA（多数情况是λ噬菌体DNA ）。
限制性内切酶的作用及原理
限制性内切酶的作用及原理
好的,我来详细解释限制性内切酶的作用及其作用原理:
1. 限制性内切酶(Restriction endonuclease)是一种能识别和切割DNA特定位点的酶。
2. 它能识别双链DNA上的特定短序列(一般为4-8个碱基),并在此处切开双链。
3. 不同的限制性内切酶能识别不同的DNA序列。
例如EcoRI识别GAATTC序列。
4. 限制性内切酶主要来源于细菌,是细菌抵御病毒的免疫机制的一部分。
5. 它们切割入侵病毒的DNA而不切割细菌自己的DNA,因为后者的识别位点通过甲基化反应被保护了。
6. 限制性内切酶的活性需要Mg2+等离子参与。
切割产生的DNA断端带5'或3'的单链突出。
7. 多数限制性内切酶可在室温条件下快速完全切割DNA。
切割产物是较小的线性DNA片段。
8. 在遗传工程中,可用限制性内切酶切割DNA,并利用互补的突出端连接形成重组DNA。
9. 也可以用其生成特定DNA片段用于Southern印记分析、克隆等目的。
10. 通过对DNA切割位点和片段长度分析,限制性内切酶是鉴定基因类型的重要工具。
综上所述,这就是限制性内切酶的作用方式及其生物学功能原理。
它对基因工程研究发挥着重要作用。
初一生物限制性内切酶概念及应用
初一生物限制性内切酶概念及应用限制性内切酶，也被称为核酸内切酶，是一类能够切割DNA或RNA分子的酶。
它们具有高度特异性，只在特定的序列上切割，因此在生物学研究和分子生物学技术中具有重要的应用价值。
本文将介绍限制性内切酶的概念，并探讨其在生物学领域中的应用。
一、限制性内切酶的概念限制性内切酶是一类可以识别并切割DNA或RNA分子中特定序列的酶。
它们通过与目标序列上的碱基进行特异性结合，并在特定的连接点上切割分子链。
限制性内切酶通常来自于细菌和原核生物，但在某些情况下也可以分离和重组自真核生物。
根据其切割的方式和切割位点的序列，限制性内切酶被分为多个家族，如EcoRI、HindIII等。
二、限制性内切酶的应用1. DNA分子的切割与连接限制性内切酶是DNA分子切割和连接的重要工具。
通过选取不同的限制性内切酶进行切割，我们可以得到具有特定序列的DNA片段。
这对于基因重组、片段测序等研究具有重要意义。
此外，限制性内切酶还可以通过切割产生的黏性末端或平滑末端，使得DNA片段能够方便地连接在一起。
2. DNA分子的分析与筛选限制性内切酶酶切产生的DNA片段可以通过电泳等技术进行分析和筛选。
不同限制性内切酶切割产生的片段大小不同，可以根据其大小差异进行分离和分析。
这在DNA指纹图谱的构建、遗传标记的筛选等领域起到了重要的作用。
3. 基因工程技术的应用限制性内切酶在基因工程技术中的应用尤为广泛。
通过使用限制性内切酶产生的DNA片段，结合DNA连接酶的作用，可以将外源基因或DNA片段插入到目标宿主DNA中。
这一技术被广泛应用于转基因生物的构建、基因治疗的研究等领域。
4. DNA测序技术限制性内切酶在DNA测序技术中扮演重要的角色。
通过将DNA分子切割成不同大小的片段，并通过测序技术对其进行测序，可以获取整个DNA分子的序列信息。
限制性内切酶的选择和使用对测序结果的准确性和效率起到重要影响。
综上所述，限制性内切酶作为一种能够切割DNA或RNA分子的酶，在生物学研究和分子生物学技术中具有广泛的应用价值。
限制性内切酶名词解释
限制性内切酶名词解释限制性内切酶又称为限制性内切酶是一种由特定的特定的特定的核酸分子特定的特定位置所识别的酶，它们能够在特定的位置将核酸分子切割成两段，其中一段被称为内切片段，另一段称为外切片段。
限制性内切酶是 DNA变，特别是基因识别和修饰的重要工具，可以将 DNA子切割成两个不同的片段，并且这两个片段可以通过结合的方式来进行重新组合。
限制性内切酶的发现，极大地改变了分子生物学的研究领域，使得科学家们能够更加精确地控制DNA的改变和组装。
限制性内切酶的种类繁多，但它们共有的特点是精确地识别特定DNA片段，并在特定的位置进行限制性切割。
它们曾被广泛应用于全基因组比较、基因调控分析、基因组编辑、克隆方法开发、细胞工程和一些其他的生物科学研究。
限制性内切酶的分解模式是其特有的特征，它们能够在特定的位置精确地分解DNA，使反应具有高度特异性。
它们的作用位置是由特定的DNA序列所决定的，即所谓的“限制性位点”。
它们的分解效率较高，一旦识别了特定的DNA序列，就可以把DNA分解成外切片段和内切片段。
此外，限制性内切酶的精确度也是非常高的，因为它们在DNA分解过程中只在特定的位置进行切割，从而避免了偶然的外切。
另外，限制性内切酶具有一定的灵活性，可以通过增加弱底物吸引力或结合抑制剂来改变它们的功能，以及通过改变活性中心的位点，以改变它们的切割效率。
总之，限制性内切酶因其精确度、分解效率和灵活性而能够大大的改变分子生物学的研究领域。
限制性内切酶在生物领域的应用非常广泛，它们可以用于克隆基因和生物工程，用于分析基因组变异和基因组间水平的比较，和用于细胞工程中细胞表型的改变。
此外，限制性内切酶也被用于生物检测，特别是对病毒感染有重要意义。
比如可以利用限制性内切酶对病毒DNA进行检测，以及其他一些生物标记试剂的检测，以确定特定的细胞和细菌的存在。
另外，限制性内切酶也可以应用于药物开发，用于研究药物潜在的重要靶标，以及如何从DNA中提取药物起始分子。
三酶切和单酶切
三酶切和单酶切概述DNA分子是由一系列核苷酸单元组成的双螺旋结构，其中包含了生物体遗传信息的编码。
在研究和应用中，我们常常需要对DNA分子进行切割和重组，以便于进一步的分析和操作。
三酶切和单酶切是两种常用的DNA切割方法，它们在实验室中被广泛应用于基因工程、分子生物学和遗传学等领域。
三酶切三酶切是指使用三种不同的限制性内切酶（restriction enzyme）同时对DNA分子进行切割的方法。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并切割DNA分子的酶类。
它们通常识别的DNA序列为4-8个碱基对长，并在特定的切割位点将DNA分子切割成两个或多个片段。
三酶切的原理三酶切的原理基于限制性内切酶的特异性识别和切割DNA序列的能力。
在三酶切中，选择三种具有不同的切割位点的限制性内切酶，并将它们同时作用于DNA分子。
每种限制性内切酶都会在其特定的切割位点将DNA分子切割成两个或多个片段。
通过合理选择限制性内切酶和切割位点，可以将DNA分子切割成具有特定长度和序列的片段。
三酶切的步骤1.选择适当的限制性内切酶：根据需要切割的DNA序列和所需的片段长度，选择适当的限制性内切酶。
常用的限制性内切酶有EcoRI、BamHI、HindIII等。
2.准备DNA样品：从生物样品中提取DNA，并经过适当的处理和纯化，得到纯净的DNA样品。
3.反应体系的准备：根据实验需要，将所需的试剂和酶加入到适当的缓冲液中，制备三酶切反应的体系。
4.反应条件的设置：根据所选用的限制性内切酶的最适工作条件，设置反应的温度、时间和其他参数。
5.反应的进行：将DNA样品与三种限制性内切酶和反应体系混合，使其在适当的条件下进行反应。
6.反应的停止：根据需要，可以通过加入适当的试剂或改变反应条件来停止反应。
7.分析切割产物：使用凝胶电泳等方法，对切割产物进行分析和检测。
三酶切的应用三酶切技术在分子生物学和基因工程中有着广泛的应用。
通过合理选择限制性内切酶和切割位点，可以实现对DNA分子的精确切割和重组。
限制性内切酶HindIII说明书
Hin d IIIA A G C T TT T C G A ATakara Code：D1060A包装量：3,000 Units附带试剂：10×M Buffer 500 μl10×Loading Buffer 500 μl纯度：1）Overdigestion Test：≥15 Units2）Ligation-Recutting Test：Ligation Effi.：100%,Recutting Effi.：100%3）pKF3 Cloning Test：＜2%●酶贮存液：10 mM Tris-HCl, pH7.5400 mM KCl0.1 mM EDTA1 mM DTT0.01 % BSA50 % Glycerol●起源：Escherichia coli carrying the plasmid encoding Hin dⅢgene.●一般反应体系：Hin dⅢ 1 μl10×M Buffer 2 μlDNA ≤1 μg灭菌水up to 20 μl●反应温度：37℃●反应时间：在上述20 μl的反应体系中，37℃反应5分钟可以完全切断λDNA，满足各种实验需求。
针对特殊酶切底物DNA，如果得不到良好的酶切效果时，可以将反应时间延长至1小时。
●活性确认：在50 μl反应液中，37℃温度下反应1小时，将1 μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
●纯度检测：1）Overdigestion Test：在1 μg DNA中加入过量的该限制酶，进行长时间（24小时）酶切反应，然后进行琼脂糖电泳，确认切出的DNA片段的电泳谱带不发生变化。
2）Ligation-Recutting Test：在经过10倍量该酶切出的DNA片段中，加入T4 DNA Ligase，使其连接，然后再使用该酶进行切断反应，判断Ligation-Recutting效率。
3）pKF3 Enforcement Cloning Test：使用10倍量的该酶，将Enforcement Cloning Vector pKF3 DNA切开，然后再进行连接后，转化至TH2感受态细胞中，判断该酶切位点受到影响的重组体所占的比率。
二、限制性内切酶的类型II类限制性内切酶III类限制性内切酶首先由M.
1
?
4
通过缩短保温时间、降低反应温度或减 少酶的用量可达到局部消化的目的。
4. 限制酶酶切反应的终止
大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。
5. 几种常用限制酶识别位点
6. 限制性内切酶识别序列的交叉列表
AATT **** **** MaeII HpaⅡc MspIc ACGT AGCT ATAT CATG CCGG
① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG序列在第二 个C上C5位置上引入甲基
二、限制性内切酶的类型
目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。 I 型限制性内切酶
II 类限制性内切酶
III类限制性内切酶
1. I型限制性内切酶
首先由M. Meselson和R. Yuan在1968 年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT
③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成 平齐末端。
（5）同裂酶（Isoschizomers) 识别位点的序列相同的限制性内切酶。
① 完全同裂酶： 识别位点和切点完全相同。 如Hind Ⅲ 和Hsu I。
Hind Ⅲ
Hsu I
5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
XmaI AvaI
C****G C****G
C****G C****G G****C EcoRI ApoI
SmaI
NgoMI BsrFI
AATT G****C G****C G****C G****C
三酶切和单酶切
三酶切和单酶切
三酶切和单酶切是在分子生物学中常用的DNA处理技术，用于操作和分析DNA分子。
它们分别指的是在DNA分子中使用多个酶或单个酶进行特定的切割。
下面对三酶切和单酶切进行解释：
三酶切：三酶切是指使用三种不同的限制性内切酶（也叫限制酶或核酸内切酶）对DNA分子进行切割。
限制酶是一种能够识别并切割特定DNA序列的酶。
通过使用三种具有不同的切割位点的限制酶，可以在目标DNA分子上生成多个特定的切割位点，从而产生多个DNA 片段。
单酶切：单酶切是指使用单一种限制酶对DNA分子进行切割。
在这种情况下，限制酶只识别并切割一个特定的DNA序列，从而生成两个切割位点。
这种方法通常用于分析特定的DNA序列，或者在某些情况下用于构建基因工程中的载体。
三酶切和单酶切在实验室中的应用范围和目的各有不同。
三酶切通常用于生成多个DNA片段，如在构建DNA文库、定位特定基因、进行DNA指纹图谱分析等方面。
单酶切则更常用于特定的DNA片段的分析、重组DNA构建等。
选择使用哪种切割方法取决于实验的目的和所需的分析结果。
1。
限制性内切酶原理
限制性内切酶原理限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一种常见的酶类，能够帮助细菌对抗侵入的病毒DNA，通过识别特定的DNA序列并将其切割成特定的片段。
限制性内切酶具有辨识性、切割性和钳制性、修复性四个基本特点。
限制性内切酶启示了分子生物学领域的许多实验技术，如DNA测序、聚合酶链反应（PCR）等，在生命科学研究中得到广泛应用。
限制性内切酶的辨识性是指它们能够识别DNA序列中的特定短序列，并只切割该序列。
每种限制性内切酶具有特定的辨识序列，也称为限制性酶切位点。
这些辨识序列通常是4-8个碱基对长，具有特定的配对规则，如EcoRI的辨识序列是5'-GAATTC-3'，其中A和T配对，G和C配对。
在DNA双螺旋结构中，限制性酶通过辨识序列与DNA结合，形成特异性的结合位点。
限制性内切酶的切割性是指它们能够在辨识序列的特定位置切割DNA双螺旋结构。
限制性内切酶通常通过切割特定的磷酸二酯键来断裂DNA链。
它们在辨识序列的特定位点周围创建一个切割位点，通常是辨识序列两侧的不同位置，如EcoRI在辨识序列的前后各切割一个磷酸二酯键，形成两个单链断裂端。
限制性内切酶的钳制性是指它们能够将切割的DNA片段留在切割位点附近，形成特定的断裂端。
例如，EcoRI在切割DNA后会在切割位点的切割位点之间留下两个黏性末端，形成一个单链和一个突出的单链片段。
这种特定的断裂端形式通常有助于进一步的DNA处理和连接。
限制性内切酶的修复性是指它们能够修复被切割的DNA。
在细菌细胞内，限制性内切酶的活性通常伴随着相应的修复酶系统，可以恢复被切割的DNA双链结构。
这种修复过程有助于防止细菌自己的DNA也被限制性内切酶过度切割。
限制性内切酶在分子生物学研究中得到广泛应用。
通过利用限制性内切酶的辨识性，科学家可以在特定的DNA序列上进行定点切割。
切割后的DNA片段可以被进一步用于DNA测序、PCR等实验技术。
限制性内切酶和引物
五、用于分析限制性酶切位点的软件
sequencher
DNAman
引物的设计
引 物 设 计
• 引物 • 引物的重要性 • 引物设计的原则 • 引物与PCR • 引物设计软件
引物（primers)
• 引物是人工合成的两段
寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
引物编辑
引物编辑
编辑引物
分析引物结果
确认编辑的引物
引物类型 搜索模式
引物搜索选项设定
引物长度
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
产物大小范 围
28对引物
搜索结果
每对引物的信 息
引物分值 100分为满分
双击选中一对 引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
引物设计界面
First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
7、同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的， 且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。 这些酶统称为同尾酶。这些酶切割 DNA 得到的产 物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同 的。通过表 4-3 很容易判断哪些酶可产生相同的 DNA 末端。
· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY · SpeⅠ A↓CTAGT NheⅠ G↓CTAGC XbaⅠ T↓CTAGA · BamHⅠ G↓GATCC Sau3AⅠ ↓GATC StyⅠ C↓CWWGG · ClaⅠ AT↓CGAT AccⅠ GT↓MKAC （pUC19）
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２．将反应体系充分混匀，并于台式离心 机上短暂离心。 ３．Eppendorf管于３７℃水管中反应1小 时。 ４．反应结束后加入2μl的6XLoading buffer 以终止反应。 ５．混匀后0.8％琼脂糖凝胶上60伏电泳２ 小时。
３．反应缓冲液：
反应缓冲液主要由Tris· HCl、NaCl、Mg2+组成， 其中Mg2+为内切酶辅基； Tris· HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如 EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有 如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比 来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
实验方法
１．按下表分别加入各试剂（注意限制性 内切酶最后加入且在冰上操作）于 Eppendorf管中。 DNA 5μl 10×buffer 1μl 无菌水 3.5μl 内切酶 0.5μl 总体积： 10μl
酶切反应中应注意以下几个问题：
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量 根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底 物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对 ２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 使用时防止操作中对内切酶的污染。
２．ＤＮＡ：
作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的 纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、 SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因 素的存在均不同程度影响限制性内切酶的 活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑一类能识别双链ＤＮ Ａ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶 都是从原核生物中发现，它们的功能犹似 高等动物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮ Ａ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的 磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为 Ｐ，３’端为ＯＨ。
限制酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具 有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼 有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有 特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割， 很难形成稳定的特异性切割末端。 Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底 物上解离下来。 故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
Ⅱ型酶
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进 行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子， 识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’ 端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们 能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大 地推动了分子生物学的兴旺和发展。