3限制性内切酶

３．反应缓冲液：
反应缓冲液主要由Tris· HCl、NaCl、Mg2+组成， 其中Mg2+为内切酶辅基； Tris· HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
２．ＤＮＡ：
作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的 纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、 SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因 素的存在均不同程度影响限制性内切酶的 活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。
酶切反应中应注意以下几个问题：
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量 根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底 物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对 ２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 使用时防止操作中对内切酶的污染。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如 EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有 如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比 来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
实验方法
１．按下表分别加入各试剂（注意限制性 内切酶最后加入且在冰上操作）于 Eppendorf管中。 DNA 5μl 10×buffer 1μl 无菌水 3.5μl 内切酶 0.5μl 总体积： 10μl
实验目的及背景
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮ wenku.baidu.com中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶 都是从原核生物中发现，它们的功能犹似 高等动物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮ Ａ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的 磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为 Ｐ，３’端为ＯＨ。
限制酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具 有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼 有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有 特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割， 很难形成稳定的特异性切割末端。 Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底 物上解离下来。 故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
Ⅱ型酶
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进 行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子， 识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’ 端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们 能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大 地推动了分子生物学的兴旺和发展。
２．将反应体系充分混匀，并于台式离心 机上短暂离心。 ３．Eppendorf管于３７℃水管中反应1小 时。 ４．反应结束后加入2μl的6XLoading buffer 以终止反应。 ５．混匀后0.8％琼脂糖凝胶上60伏电泳２ 小时。